喀斯特和BRAF突变检测方法:免疫组织化学是一个可能的替代方法在结直肠癌分子生物学?

文摘

喀斯特基因分型结果强制转移性结直肠癌治疗之前进行antiepidermal生长因子受体(EGFR)单克隆抗体疗法。BRAFV600E突变通常是出现在结直肠癌CpG岛methylator表型和微卫星不稳定。目前,喀斯特和BRAF评估是基于分子生物学技术,如快照或Sanger测序。分子上执行测试formalin-fixed石蜡包埋(FFPE)样品,immunodetection似乎是一个有吸引力的替代检测突变。因此,我们的目标是评估喀斯特的有效性和BRAF突变基因分型结果与参考方法的immunodetection在结直肠腺癌。喀斯特和BRAF基因分型结果进行快照。一只兔子反喀斯特多克隆抗体检测在33 FFPE结直肠肿瘤样本与已知的喀斯特的地位。此外,鼠标反BRAF单克隆抗体测试30日FFPE肿瘤样本与已知的BRAF的地位。喀斯特免疫染色证明这两个可怜的敏感性(27%)和特异性(64%)在检测喀斯特突变。相反,BRAF免疫组织化学显示完美的敏感性(100%)和特异性(100%)在检测V600E突变。尽管分子生物学检测的参考方法喀斯特突变,免疫组织化学检测将是一个极具吸引力的方法BRAF在结直肠癌V600E突变。

1。介绍

结直肠癌是第二个最常见的癌症死亡原因在西方世界,和它的发病率正在增加(1]。大约有50%的结直肠癌患者最终出现转移性疾病,系统性的姑息治疗通常是管理。

转移性结直肠癌患者的治疗方案(mCRC)近年来发生了极大的改变通过引入antiepidermal生长因子受体(EGFR)疗法针对表皮生长因子受体转导级联,这是使用的主要致癌途径之一tumoral细胞。

美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲药品局(EMEA)批准使用anti-EGFR单克隆抗体,西妥昔单抗和帕尼单抗,mCRC患者喀斯特(Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因相同器官)突变。喀斯特蛋白,属于大总科的鸟嘌呤guanosine-50-triphosphate(三磷酸鸟苷)和鸟嘌呤guanosine-50-diphosphate (GDP)结合蛋白,是一种强大的下游表皮生长因子受体转导级联效应。体细胞喀斯特突变检测在大约40%的结直肠癌并导致异常亲和力的喀斯特三磷酸鸟苷与转导级联的永久激活。喀斯特突变已被确定为一个可靠的强烈的负面预测因素anti-EGFR单克隆抗体疗法mCRC患者(2- - - - - -4]。喀斯特突变筛选被强制在欧洲2008年7月以来,旨在限制对西妥昔单抗和帕尼单抗治疗mCRC野生型患者喀斯特肿瘤(5,6]。

BRAF(v-Raf小鼠肉瘤病毒致癌基因相同器官B1)的一员RAS /皇家空军家庭,编码一个serine-threonine蛋白激酶参与MAPK增殖蛋白激酶信号级联。BRAF作为RAS的直接效应,促进肿瘤的生长和生存的激活MEK (MAPK /ERK激酶)[7]。最常见的激活突变BRAF结直肠癌中几乎总是导致缬氨酸取代谷氨酸残600 (BRAF V600E)和发生在10 - 15%的频率8]。结直肠癌、BRAF突变是与两个分子特性紧密相关:CpG岛methylator表型(CIMP)和微卫星不稳定性(MSI)。约11 - 76%的MSI肿瘤港BRAF突变与只有0 - 15%的微卫星稳定(MSS)肿瘤(7]。BRAF林奇综合症的突变是缺席的,有缺陷的生殖系突变错配修复(MMR)系统,但通常出现在零星的MSI结直肠肿瘤。因此,BRAFV600E分析是用来区分零星的MSI结肠直肠癌和林奇综合症病例(9]。

喀斯特和BRAF利用分子技术状态评估等基因组DNA提取tumoral Sanger测序后,快照,实时PCR、或其他验证方法10]。尽管分子病理解剖病理学的“自然进化”,并不是所有的病理部门目前装备进行这种分析。此外,财务问题,由于高成本的设备和试剂分子病理学也可能导致一个切换到另一种的检测方法。因为分子测试主要进行formalin-fixed石蜡包埋(FFPE)肿瘤样本,这是存储在病理部门immunodetection似乎是一个有吸引力的替代等突变检测。事实上,免疫组织化学是一个批准的方法识别哪些病人可以受益于特定的癌症治疗,如测定HER2表达乳腺癌和胃癌。此外,病理学家也可以执行喀斯特和BRAF通过免疫组织化学方法突变筛查的同时,组织病理学诊断,导致相当大的节省时间。

为了验证这种新方法,我们评价一只兔子反喀斯特的多克隆抗体,针对内部人力喀斯特地区蛋白质,又一只老鼠反BRAF单克隆抗体。然后,我们得到的相关结果与突变状态人类大肠癌癌DNA序列分析样本。

2。材料和方法

2.1。分子分析

Formalin-fixed肿瘤石蜡包埋标本来自Sapienza大学医院(意大利罗马)和鲁昂大学医院(法国鲁昂,)。共有63个样本随机选择从我们实验室转移性结直肠癌患者指2009年5月到2012年10月喀斯特基因分型。

串行部分原发性结直肠肿瘤从每个石蜡块,放在玻璃幻灯片:一个4µ米厚的部分与苏木精和伊红染色(圆))组织病理学检查,另一个4µ米厚的部分用于免疫组织化学技术。以下5个10µ米厚的部分肿瘤DNA的准备处理的。切片机刀片之间改变每个FFPE肿瘤样本和石蜡部分分别处理以避免交叉污染。

)准备启用肿瘤区域划定和视觉估计肿瘤细胞百分比。良性的组织和间质污染最小化炎性细胞,肿瘤区域,此前强调通过病理学家)准备,macrodissected在五10µ米厚的部分放在玻璃幻灯片使用一次性消毒手术刀。

喀斯特和BRAF基因分型是根据协议执行之前报道(2,11]。短暂,快照分析基因组DNA提取使用“RecoverAll总核酸隔离工具包FFPE组织”(应用生物系统公司)推荐的供应商,喀斯特外显子2(密码子12和13)BRAF外显子15放大了使用特定的引物PCR(聚合酶链反应)。执行快照引物延伸反应包括ddNTPs(三磷酸dideoxynucleotide)用荧光染料标记,特定的快照引物,2µL纯化PCR产品。在迁移之后自动测序仪(ABI棱镜3130 xl)结果分析使用GeneMapper软件4.0版本(应用生物系统公司)。多路放大产品的快照喀斯特和BRAF允许可视化在这些引起的任何突变的具体位置:c。34 g、c。34 g、c。35 g、c。37 g、c。38G(for喀斯特),c。1799T(forBRAF)。

2.2。样本的选择

喀斯特研究,人口组成的样本33包括11例癌症患者最常见的情愫喀斯特突变(G12A、G12C G12D、G12V G13D, g12,和G12R)没有突变BRAF和22例喀斯特和BRAF野生状态。BRAF的研究中,我们选择30例肿瘤患者包括20窝藏一个c。1799 t > (V600E)BRAF突变没有任何喀斯特突变(10 MSI肿瘤和海量存储系统(MSS)中肿瘤)和10个肿瘤患者提供海量存储系统(MSS)中BRAF或喀斯特突变。

2.3。免疫组织化学分析

免疫组织化学染色进行4μ米的部分FFPE块。Deparaffinization和补液进行二甲苯和酒精。与蒸馏水洗涤后,部分在微波炉预热30分钟10更易在99°C / L浓度的柠檬酸缓冲(pH值6)。在水冲洗后,内源性过氧化物酶活动被浸泡在3%过氧化氢为5分钟。然后,部分被孵化1小时在室温下兔多克隆抗体对喀斯特(k - ras基因兔子反多克隆抗体,稀释1:100;春天生物科学,加利福尼亚州)或16分钟37°C小鼠单克隆抗体BRAF V600E蛋白质(VE1克隆;春天生物科学,California)。

免疫反应性与DAKO透露设想系统使用3、3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAKO)发色体与苏木精复染色。负控制染色是由省略主要抗体。

优化每个抗体包括FFPE前列腺癌组织样品的供应商和两行结直肠癌细胞,即HCT116 HT29,港口,分别喀斯特突变和BRAFV600E突变。

每个幻灯片应用研究,取得了由两个独立病理学家约翰•克利斯朵夫(Sabourin和弗朗西斯科·Borrini)没有任何临床病理的分子数据的先验知识。所有部分的两个观察者不同意重新计数,讨论后,最终协议。

免疫反应性被考虑进积极的肿瘤细胞的百分比与信号强度:肿瘤被评估为喀斯特-或BRAF -如果90%的癌细胞是清白的(< 10%的阳性细胞)和喀斯特积极或BRAF积极如果超过10%的细胞被应用。

2.4。统计分析

突变状态的分子生物学被认为是黄金标准技术突变检测。喀斯特和BRAF疣状,敏感性和特异性计算使用列联表由阳性病例(真或假)和消极的情况下(真或假)。

3所示。结果

喀斯特研究了11个tumoral CRC患者喀斯特突变状态和22个野生型患者喀斯特的地位。病人特点,tumoral突变数据和染色状态表中列出1。平均年龄是63岁(标准差= 10)。有23岁男性患者平均年龄为64岁(标准差= 10)和10个女性患者平均年龄为61岁(标准差= 9)。当礼物,喀斯特蛋白表达主要位于细胞质中,显示一个细粒度的模式,只是偶尔在细胞质膜(数字1,2,3)。独特的喀斯特表达在肿瘤领域观察11例(33%)患者;在剩下的22例,没有观察到喀斯特表达式。免疫染色,检测的灵敏度喀斯特突变计算为27%,而该方法的特异性为64%(表计算2)。

BRAF研究了20 tumoral CRC患者BRAF变异(包括10 MSI肿瘤患者和10 MSS肿瘤)患者和10 tumoral CRC患者BRAF野生型和海量存储系统(MSS)中。病人特点,tumoral突变数据和染色状态表中列出3。样本人口的平均年龄60岁(标准差= 12)。有19岁男性患者平均年龄为61岁(标准差= 13)和11个女性患者平均年龄59岁(标准差= 10)。当积极,BRAF染色是同质的,标记,或温和。独特的BRAF表达在肿瘤领域观察20例(66%)患者;在剩下的10例,没有观察到BRAF表达式。正如所料,BRAF蛋白表达是位于细胞质中,与细颗粒状胞质染色(数字4和5)。任何核染色被忽视,而不是得分。有趣的是,其中的一个BRAF突变的癌症是连续增生性/锯齿状的区域没有发育不良。在这个领域中,我们观察到细胞质染色强度下降相比,肿瘤的侵袭性组件(数字4和5)。通过子群这些患者根据其tumoralBRAF基因分型结果,我们发现BRAF表达式出现在20突变患者,独立于微卫星的状态,并没有在10不变异情况。因此,该技术的敏感性和特异性分别为100%(表4)。

4所示。讨论

我们知道分子病理解剖病理学的自然进化。与免疫组织化学相比并没有从根本上改变了病理处理、分子病理需要更多的基本技术调整和更昂贵的实验室设备。

定制anti-EGFR疗法基础上的经济影响喀斯特地位被Shankaran等人最近评估使用估计发病率为新mCRC病例诊断在美国。基于mCRC每年29762例新病例的发病率,前期的成本喀斯特(即分子测试估计1300万美元。每个病人,452美元)[12]。免疫组织化学的方法比分子病理学便宜,平均花费50美元/抗体测试(13]。

免疫组织化学的方法,这是一个有效的资源识别tumoral目标治疗(即访问。,CD117在胃肠道间质瘤(14)或HER2乳腺癌和胃癌(15,16]),尚未找到一个在大肠癌中的应用。与anti-EGFR抗体筛查mCRC迅速显示其局限性在选择患者anti-EGFR疗法(17]。在mCRC,唯一的预测标记(负面回应那些治疗)的标志是体细胞的决心拉突变。因此,形态学检测使用免疫组织化学分子筛选似乎是一个有吸引力的选择。事实上,我们假定喀斯特外显子2的突变发生在密码子12和13,通过诱导稳定的蛋白质组成性激活状态,也可以允许通过免疫组织化学方法检测这种蛋白质。利用抗体针对喀斯特(但不变异蛋白质),我们将可视化KRAS突变蛋白在肿瘤细胞突变的癌(或者至少检测一个“过度”突变情况下)。我们的数据无法支持这一假设。

最近的出版物报道的可能性immunodetection突变蛋白是表皮生长因子受体(18,19]或BRAF [20.]。玉等人最近单克隆抗体生成特定于更频繁的表皮生长因子受体突变蛋白(外显子19 E746-A750删除和外显子21 L858R突变)(21]。340年他们的敏感性92%免疫组织化学分析非小细胞癌肺标本的99%相比古典DNA测序。同样的结果被发现使用特定单克隆抗体针对V600EBRAF突变(20.),只有与蛋白质反应的产物V600E突变而不是蛋白质与其他突变有关BRAF(22]。在这种背景下,我们决定评估的效用BRAF V600E免疫组织化学。完整的一致性在我们的研究中观察到堪比公布的数据(23- - - - - -25]。

这些结果强烈认为赞成免疫组织化学的方法来排除林奇综合症的微卫星高(MSI-H)结肠直肠癌,建议在最近出版(25]。BRAFV600E突变,几乎没有在遗传性结直肠癌,常出现在零星的CRC CpG岛的表现型(CIMP-high),甲基化导致的启动子区域的甲基化。BRAF突变CIMP-high CRC经常MSI-H,一种启动子甲基化,导致MLH1-deficient肿瘤(26]。

Immunodetection的BRAFV600E突变也可能提供预后信息。最近的数据辅助研究在II期和III期结肠癌患者27和转移性疾病28)表明,BRAFV600E突变与临床结果更糟糕。的预测作用BRAF突变结直肠癌目前争论,但最近的一项荟萃分析表明BRAF突变是不良预后的预测生物标志物在mCRC anti-EGFR单克隆抗体治疗的患者,特别是在喀斯特野生型患者(29日]。

在个性化医疗的时代BRAF转移性黑色素瘤的突变,靶向治疗晚期大肠癌的一直在调查窝藏的突变BRAF。的结果BRAFV600E抑制CRC的失望,而期望在临床前模型和案例报告(30.,31日]。

组织学形态控制部分通过免疫组织化学染色允许评估肿瘤区域不同的表型表达。最近的研究证据,形态均匀肿瘤实际上可能有非常不同的基因型特征(32]。许多希望被认为持续一个活检可以让肿瘤根据分子概要描述,从而有效地允许病人最好的治疗。然而,这tumoral异质性可能是靶向治疗的失败的一个原因:非敏感subclone的存在导致其选择的治疗和疾病的复发。因此,在临床肿瘤学,似乎重要的考虑这个tumoral异质性分子特征制定新的战略。免疫组织化学是一种强大的工具,是一个有效的形态支持表型特征,特别是检测肿瘤细胞的异质性。然而,其有效性依赖于抗体的特异性,必须认识到只有突变蛋白。

关于时间的实验室,免疫组织化学可以很容易地在一个工作天,而分子技术需要至少两个工作日。

免疫组织化学评价也可能是有用的在这种情况下,材料的质量不适合分子调查:只可以评估诊断恶性肿瘤的存在分散细胞标本。相反,分子技术需要至少5%的tumoral细胞样本进行测试。

总而言之,通过抗体针对喀斯特(但不是特定的突变蛋白),我们无法区分喀斯特突变的肿瘤从喀斯特在mCRC野生型肿瘤。因此,开发一个单克隆抗体与外显子2基码12和13个突变而设计的喀斯特域(代表超过90%的KRAS突变)可能最终促进mCRC患者的筛查anti-EGFR疗法。事实上,我们的数据支持使用免疫组织化学检测BRAFV600E突变蛋白质分子检测在大肠癌的替代品。免疫组织化学预后和治疗可能会成为一个有前途的工具决定在不久的将来。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

作者感谢尼基Sabourin-Gibbs,鲁昂大学医院,援助和审查论文的英文写作。

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