文摘
介绍。慢性胆汁淤积的作用(CC)在肝损伤和纤维化仍不清楚。本研究的目的是定义的角色内皮一氧化氮合酶(e-NOS) CC和N-acetyl-L-cysteine的保护作用(NAC)在肝脏和肾脏损伤。材料和方法。A组(虚假的集团);B组(CBDL);和C组(CBDL + NAC)。C组收到每日剂量的NAC(100毫克/公斤)腹腔内4周。结果。桥接纤维化率较高(分别为100%和20%,),但强度e-NOS收到南汽在大鼠肝脏较低(1.3和2.7,)。肾脏的坏死区在老鼠中接受NAC低周4(分别为48%和57%;)。e-NOS肾脏的染色细胞的数量是相同的与CBDL虚假的组和两组。讨论。南汽减少了刺激肝纤维化大鼠模型的CC和减毒肝脏和肾脏损伤。我们的研究表明,e-NOS表达增加与CC老鼠的肝组织,这被NAC逆转。NAC治疗可能恢复e-NOS蛋白表达在CC和预防肝损伤。
1。介绍
实验表明,胆总管结扎(CBDL)导致慢性胆汁淤积(CC)和顺向肝脏炎症、纤维化和肝硬化(1,2]。CC在肝损伤和纤维化的作用仍不清楚。可能的机制包括积累的疏水性胆汁酸,自由基,抗氧化活性下降(3,4]。此外,CC增加生产的一氧化氮(NO)与氧自由基反应,导致细胞损伤和凋亡5]。多项研究表明,多器官损伤发生在CC (6- - - - - -8]。CC与肝脏功能障碍常伴有肾损伤(9- - - - - -12),这可能是由内毒素引起的,血管活性的介质,自由基(13- - - - - -15]。此外,肾损伤与肝有关可能发生的疾病直接管毒性或肾元阻塞(16]。
N-Acetyl-L-cysteine (NAC)是谷胱甘肽的前体和充当直接清除剂(17]。研究表明,南汽增加肝细胞中谷胱甘肽和抗氧化池,从而增加肝细胞膜的电阻(18]。除了抗氧化效果,NAC发挥抗炎作用通过抑制细胞因子和粘附分子和增加生产内皮一氧化氮合酶(e-NOS) [19,20.]。之前的研究表明,南汽肾功能改善缺血- / reperfusion-induced急性肾损伤。南汽的保护器官主要包括氧自由基的清除21)和调节e-NOS表达(22]。结果表明e-NOS表达增加了NAC可以起到至关重要的作用在保护器官损伤。
知之甚少如何e-NOS与肝、肾损伤在CC或它如何保护CC患者肝脏和肾脏损伤。本研究的目的是建立一个CC的鼠模型,定义的角色e-NOS CC,并学习如何NAC施加保护作用通过e-NOS在肝脏和肾脏损伤。
2。材料和方法
研究遵循公认的实验动物使用指南,是Bogazici大学的伦理委员会批准(土耳其伊斯坦布尔)(2013-06-04),和依法进行食品、农业和畜牧业的土耳其和国际法(保健指南和使用实验动物,1996)。女性Wistar鼠(200 - 250 g)被安置在恒定温度下与黑暗12 h /光周期。动物被允许访问标准的鼠粮和水。所有的老鼠都与肌肉注射氯胺酮麻醉(50毫克/公斤)和甲苯噻嗪(7毫克/公斤)。六十一只老鼠被随机分为三组:A组(虚假的组,5大鼠);B组(CBDL, 28个老鼠);和C组(CBDL +南汽,28老鼠)。7 B组和C组大鼠在周1和2。在星期3,B组有6大鼠(一只老鼠死亡)和C组有7个老鼠。星期4,一个老鼠在C组已经死了; therefore, both Groups B and C had 6 rats at the time of sacrifice.
2.1。手术
实验CC引起CBDL中线剖腹手术。胆总管是双重结扎与4 - 0丝绳索之间的缝合,并切断。腹壁和中断的针脚缝合关闭。B组收到生理盐水(NS)和C组收到NAC(100毫克/公斤)为他们的第一次治疗腹腔内。他们随后收到每日剂量100毫克/公斤NS或NAC腹腔内4周。老鼠收获在1、2、3和4周后CBDL。剖腹手术后,血液收集每周进行生化分析。4周大鼠牺牲,肝脏和肾脏组织病理学研究收获。
2.2。组织病理学
组织样本在10%福尔马林固定24小时,24小时与自来水冲洗,使用梯度酒精脱水系列。组织是由透明的二甲苯和嵌入式的石蜡。部分(5μm)沾hematoxylin-eosin()),高碘酸希夫(PAS),马森的三色的污渍。朔伊尔肝组织学变化是分类使用分类如下(23]:0:没有变化;1:门户与胆管损伤与炎症或没有绚丽的导管病变;2:ductular反应(门静脉周的纤维化经常出现);3:桥接纤维化;4:胆汁性肝硬化。
肾苏木精和伊红染色部分进行评估近端小管坏死和凋亡,血管内皮细胞凋亡,简化,肾小球旁体肥大,细胞数量由一位经验丰富的肾脏病理学家(盲样身份)。组织损伤是使用小管损伤评分得分测量受损的比例小管(那些表现出失去刷状缘,扩张,形成和细胞溶菌作用)(24)和高碘酸Schiff-positive颗粒在肾小管:1,< 25%的小管;2、25 - 50%的小管;3、小管50 - 75%和4,小管(> 75%25]。
2.3。免疫组织化学
表达e-NOS是肾脏和肝脏中发现使用兔多克隆抗体(美国生原体,rb - 9279 r7)和streptavidin-biotin过氧化物酶技术4]。在相同的条件下接受了手术治疗部分。石蜡切片(5μ米)在二甲苯脱蜡。部分患者,在去离子水冲洗,受到2 N HCl 20分钟来增强抗原检索的解决方案。内源性过氧化物酶活性抑制3% H202在甲醇为10分钟。部分洗在磷酸缓冲盐(PBS)三次(每5分钟)和preincubated 1.5%正常山羊血清在PBS 20分钟在室温下湿室。
一夜之间,部分被孵化与e-NOS抗体(2 4°Cμ克/毫升在PBS稀释1.5%门店)。消极的控制,用PBS代替主要的抗体。部分与生物素化的孵化山羊anti-rabbit免疫球蛋白g (1μg / mL在PBS稀释1.5%的门店)30分钟在室温下与链霉亲和素调湿室然后辣根过氧化物酶共轭(即食)30分钟。最后,部分与苏木精复染色,在去离子水冲洗,安装在玻璃幻灯片(即食)明确安装解决方案。部分是为使用光学显微镜检查、拍照(Bx-51)。免疫组织化学e-NOS染色强度在所有组的肾脏和肝脏的部分是由两个独立的半定量的评估组织学家(失明)。e-NOS强度表达式被列为所有(−)、低(+),中等(+ +)和强(+ + +)。
2.4。血清生化
血清样本存储在−80°C。血清肌酐(SCr)和丙氨酸转氨酶(ALT)水平测定光谱光度测量的方法使用一个自动分析器(RxL-Max、西门子、德国慕尼黑)。
2.5。统计分析
数据报告为算术意味着(M)和标准差(SD)的5 - 7在每个治疗组动物。统计分析包括学生的以及和Mann-Whitney非参数测试。被认为是统计学意义(ssp公司,芝加哥,IL)。
3所示。结果
3.1。CBDL和肝纤维化
CBDL为1、2、3或4周被用来诱导CC在B组大鼠(仅CBDL)和C组(CBDL + NAC)。CC在肝脏和肾脏的影响评估每周通过生化分析和组织学检查。4周后,CBDL老鼠显示扩张胆总管(图1(一))。虽然没有改变被发现虚假的组(A组),B和C组的大鼠肝脏炎症和胆管损伤,第一周后检测。他们的门管区最低限度扩大炎症浸润,包括淋巴细胞、中性粒细胞和肝细胞膨胀。此外,韧性扩散在B和C组的观察组织学改变相似的老鼠中(数据1 (b),1 (c),1 (d))。在星期2,门户炎症包括更多的白细胞和几个浆细胞和胆管损伤比,观察最初更强烈。门静脉周的纤维化观察两组B和C,而少观察门静脉周的纤维化大鼠接受NAC (C组),这种差异没有统计学意义(66%比50%,,数据1 (e)和1 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
CBDL老鼠与增加门静脉周的纤维化,胆管增生,在B组桥接纤维化证实了马森的三色的染色肝组织在星期3(图1 (g))。尽管C组表现出炎症、胆管增生、观察和门静脉周的纤维化,没有桥接纤维化(图1 (h))。肝脏桥接纤维化的程度显著低于老鼠接收NAC(分别为80%和0,)。在星期4,桥接纤维化是观察在所有老鼠在B组,但只有在C组的五个老鼠(100%比20%,)。这表明,南汽减少纤维化大鼠模型的刺激CC和减毒的肝损伤进展(数字1(我)和2(一个))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
e-NOS的表达在鼠肝得分为每个组每周(图2 (b))。细胞染色的平均数量积极e-NOS很低的虚假的组(A组;图2 (c))。B和C组,细胞染色积极为A组e-NOS类似发现在星期1。两组之间没有显著差异被发现在周1和2 B和C。e-NOS染色的平均强度增加第二周后组B和C。在星期3,意味着e-NOS表达式在老鼠接受NAC低,但这种差异没有统计学意义(2和1.5,)。星期4,C组e-NOS表达水平明显低于发现B组(1.3和2.7,;数据2 (d)和2 (e))。
3.2。南京政府阻止CBDL后肾损伤
组织学检查大鼠肾脏的虚假的组(A组)并没有透露任何病态,而老鼠CBDL两组表现出低水平的管状上皮损伤和中性粒细胞浸润在星期1。小的凝固性坏死灶的肾皮质不是和他走时发现了彩色部分在星期1和肾脏坏死地区小得多的老鼠接受NAC(分别为4%和11%,、表1和数字2 (f)和2 (g))。在第2周,观察肾小管上皮细胞损伤的肾皮质,与小的老鼠中凝固性坏死灶组织B和c扩张管和增加蛋白质和细胞将被观察到在远端小管和收集管道最显著的皮层(数字2 (h)和2(我))。坏死区域观察到肾脏在接受南京显著小于老鼠在星期2 B组(分别为21%和26%,、表1)。
在星期3,皮质小管展出焦,细胞质空泡形成,扩张腔,焦颗粒投射,温和的间质水肿。近端小管显示坏死细胞的数量明显高于CBDL老鼠。坏死区在大鼠肾脏接受NAC明显小于老鼠在星期3 B组(分别为48%和57%;;表1和数字3(一个)和3 (b))。局灶性肾盂肾炎在B组大鼠的肾脏,而不是观察老鼠收到NAC (C组;图3 (c))。此外,在B组大鼠中,所有的小管扩张,管状细胞萎缩。这些组织学变化不太严重的老鼠收到南京。管周毛细血管内皮细胞凋亡是可见的)部分的相应线性凋亡的身体在B组大鼠间质毛细血管内皮。肾脏的坏死区在老鼠中接受NAC (C组)显著降低在周4(分别为54%和62%;;表1和数字3 (d)和3 (e))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
表达e-NOS主要是检查在远端和收集管和肾小球内和远端和收集管小管。老鼠的肾脏的表达e-NOS在虚假的组(A组)显示小以挪士染色在远端和收集管小管,没有在肾小球e-NOS染色(图3 (f))。e-NOS染色细胞的数量收集和远端导管与CBDL相似的两组(B和C组)并没有比那些观察到在a组NAC没有影响e-NOS表达在肾周4组B和C,有类似e-NOS染色强度在肾小球(没有染色),收集管道(小染色),和远端管道(小染色)。e-NOS染色强度没有影响南汽在老鼠CBDL(数字3 (g)和3 (h))。
3.3。生物化学分析
ALT分析每周平均水平是高于CBDL组比虚假的组(图3(我))。在C组ALT水平低于B组在4周(68±30 U / L与146±63 U / L,)。肾功能评估血清肌酐在星期4。肌酐浓度CBDL组均值显著高于假组(2.3±0.3 mg / dL在B组和C组1.6±0.5 mg / dL和0.34±0.1 mg / dL A组;和)。肌酐的平均浓度显著低于C组比B组()。
4所示。讨论
慢性淤胆型大鼠模型被用来检查e-NOS的角色和南汽在肾脏和肝脏损伤的保护作用。NAC治疗CBDL老鼠预防肝脏和肾脏损伤。我们的研究表明,e-NOS表达增加与CC老鼠的肝组织,这扭转了NAC治疗。e-NOS在肾组织的表达并没有改变在老鼠与CC及其表达不受南汽。
几项研究已经证明了CC在肝脏和肾脏损伤的影响1,2,9- - - - - -12),有几个因素可能起作用[3,4,13- - - - - -15]。系统性氧化应激,肝脂质过氧化增加,肝细胞线粒体功能障碍,释放促炎细胞因子的肝损伤后肝循环胆汁酸,木糖醇,循环免疫复合物,减少谷胱甘肽生产、过度生产的没有发生在CC (26- - - - - -29日]。的潜在作用没有肝纤维化发展的证明(30.,31日]。没有可以与超氧化物阴离子反应和活性氧,导致形成过氧亚硝基阴离子,增加了脂质过氧化反应,在肾脏和肝脏组织损伤32- - - - - -35]。然而,很少有文献中的信息关于e-NOS在生产中的作用在CC肝病肝脏和肾脏损伤。
南京汽车的使用在我们的研究中是合理的,因为它减少氧化应激和产生抗炎和免疫调节作用21,36- - - - - -39]。CBDL报道减少抗氧化防御系统和肝脏谷胱甘肽(GSH)含量和增加自由基的形成40]。研究表明自由基的作用肝纤维发生的调制,直接或通过脂质过氧化41,42]。证实了NAC的antifibrotic影响实验模型(43,44]。此外,血清酶(ALT)的活性降低动物接受CBDL并得到了南京汽车,这表明这种药物的王亚南45- - - - - -48]。南汽的交互和e-NOS之前蛋白表达进行了研究[49]。NAC作为过氧化物清除剂,能够三倍e-NOS表达式和增加没有生物利用度(50,51]。然而,目前尚不清楚NAC e-NOS表达通路中的行为在CC减弱肝脏和肾脏损伤。
我们调查的角色e-NOS在肝脏和肾脏损伤和NAC e-NOS表达的影响及其预防肝脏和肾脏损伤的进展在CC + CC。南汽集团(C组)显示减少肝损伤和肝组织中大量的e-NOS低于CC组没有NAC (B组)。NAC治疗导致减少激活e-NOS和积累在肝脏胶原蛋白。治疗后显著减少胶原蛋白染色与南汽CBDL后连续4周一天一次。ALT CBDL后的浓度的增加在老鼠收到NAC建议减少肝脏炎症。总的来说,这项研究表明,NAC可以防止CC肝脏疾病引起的肝损伤。南汽减少e-NOS表达肝脏和减毒炎症,导致细胞损伤,显著降低肝细胞损伤和纤维化。这是第一个报告演示的作用e-NOS肝损伤在CC和南汽的小说影响作用通过e-NOS衰减肝损伤CC, NAC治疗可能恢复e-NOS蛋白表达在CC和预防肝损伤。
这项研究表明,南汽改善CBDL的有害影响肝脏和肾脏,保护,似乎与e-NOS的强化。这些发现表明,NAC补充与其他疗法可能会在慢性淤胆型障碍患者有益保护肾脏和肝脏;然而,需要进一步的实验和随机临床研究。这项研究有一些局限性。首先,我们没有检查NAC的影响在其他自由基的存在可能导致肝纤维化和肾损伤。南京可能会影响其他自由基代理和通过其他途径减少肾和肝损伤。第二,南汽的精确作用在防止肾脏损伤并不确定在本研究中,因为e-NOS表达在肾组织中没有受到CC或NAC治疗。
总之,肾脏和肝脏损伤的模型CC肝病表现为肾小管坏死后,内皮细胞凋亡,多形核白细胞浸润,肝纤维化。描绘这将是有用的角色e-NOS CC和评估潜在的NAC治疗。继续调查机制e-NOS导致肝纤维化可能导致新方法治疗肝损伤患者的CC。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突或资金。