ATP结合盒基因的基因型与表达：潜在协会胰腺癌发展和化疗耐药？

抽象的

ABC (atp结合盒)转运体基因的遗传多态性与包括胰腺癌在内的各种癌症对化疗的不同反应有关。在本研究中，我们在正常和胰腺癌标本中研究了ABCB1、ABCC1和ABCG2基因中的四个snp。分析了三种转运蛋白的表达情况。ABCB1基因中G2677T和C3435T的TT基因型与较低的胰腺癌发生风险相关(，OR = 0.35和， OR = 0.29，分别)。据我们所知，这是关于ABCB1基因共同多态性影响胰腺癌遗传风险的首次报道。2677TT和3435TT携带者的ABCB1表达量较野生型纯合子和杂合子低。使用标准胰腺癌细胞株进行的细胞活力测定显示，ABCB1 2677TT-3455TT单倍型比其他单倍型对吉西他滨更敏感。结论．ABCB1 G2677T和G3435T的多态性与胰腺癌的差异易感性相关，并可能预测化疗反应。

1.介绍

胰腺癌是第10个最常见的癌症诊断和领先的癌症死亡原因，在美国[第41，2］．由于缺乏症状和早期检测措施，胰腺癌通常在晚期才被诊断出来;只有10%到15%的患者是在相对较早的阶段被诊断出来的，此时手术切除肿瘤仍然是可能的。然而，由于胰腺癌的侵袭性，复发率仍然很高。高达80%的胰腺癌术后患者，在术后两年内癌症复发。化疗是局部晚期、转移性和复发性胰腺癌的主要治疗方法，但疗效有限[3.］．即使与吉西他滨，晚期胰腺癌肿瘤治疗的金标准，客观肿瘤缓解率只有15-20％，在随机试验中位生存期仅5-6.7个月[3.］．事实上，胰腺癌具有最高的死亡率所有主要癌症，只有5％的患者会为五年以上生存，并且成活率尚未在近40年[改善1］．此外，胰腺癌发病率预计将增加由于人口变化和多个生活方式因素，特别是吸烟，加入甜味剂和动物产品食用的饮食重[4，5］．了解胰腺癌的易感性和化疗疗效有限的机制（S）是对这种致命的疾病作斗争的关键。

胰腺癌化疗疗效有限的一个主要原因是化疗耐药性。atp结合盒(ABC)转运体的过表达已被证明在各种癌症的化疗耐药发展中发挥重要作用[6- - - - - -8］．ABC转运代表一个家族跨越细胞外和细胞内膜，包括代谢产物，脂质和药物主动转运多种基材的膜蛋白。ABC转运蛋白的过量表达导致增加的药物外排从而降低细胞内药物水平，导致耐药性。49个人的ABC转运蛋白的，15被牵连赋予对多种癌症化学治疗剂的抗性，并且最密集特征成员是多药耐药性1（MDR1或P-糖蛋白，ABCB1），多药耐药蛋白1（MRP1，ABCC1），和乳腺癌耐药蛋白（BCRP，ABCG2）7］．有报道称，与正常胰腺相比，腺癌中ABCB1、ABCG2和ABCCs mRNA表达升高[9- - - - - -12]，但与肿瘤的侵袭性临床相关性仍存在争议[11，12］．

在ABC转运蛋白多态性已被深入研究，并在不同的组织区室，改变的药物水平，以及几种疾病宿主敏感性流出的多种多样表达泵相连。用于胰腺癌，胰腺癌幸存者最近的一项研究发现，单核苷酸多态性（SNP）在ABCG2（rs2231164）为胰腺癌存活相关;携带AG / GG基因型的患者表现为更好地生存比那些携带AA基因型[13］．另一项在术前接受吉西他滨治疗的患者中进行的研究显示，ABCC2和ABCC5中的两个单核苷酸多态性与总生存率相关，而ABCC2 G40A GG基因型与吉西他滨的组织学反应差相关[14］．在接受吉西他滨辅助化疗的患者中，SNP ABCB1-G2677T也被报道与药物反应相关[15］．然而，很少有研究调查了ABC转运基因多态性的作用，在胰腺癌的发展，以及是否ABC转运基因型与转运胰腺表达相关。在这项研究中，在胰腺癌的发展和化疗耐药ABC转运蛋白的作用进行了研究。具体而言，ABCB1，ABCC1，和ABCG2的在正常和癌性胰标本基因多态性进行分析。该外排泵的表达水平进行了检查，相关的单核苷酸多态性。ABC转运基因型与化疗的敏感性的潜力相关还研究了在几种胰腺癌细胞系。

2.材料和方法

2.1。患者信息和样品收集

冷冻胰腺切除标本购自美国合作组织网络(CHTN) (Birmingham, AL, USA)，编码不可识别。从标本信息表中回顾性收集所购标本的病理和临床资料。在基因分型分析中，本研究共纳入152份样本(每个患者1份胰腺切除样本)，其中120份用于基因表达分析。一半的样本来自正常胰腺组织(NOR)，另一半来自恶性胰腺组织(MAL)。75%以上的样本来自欧洲裔美国人，其他样本来自非洲裔美国人或种族不明的人(见表)1(一)和1(b))。对于恶性样本，大部分(90%)诊断为胰腺腺癌。

2.2。DNA提取和基因分型

根据以下标准选择rs2032582 (ABCB1 G2677T)、rs1045642 (ABCB1 C3435T)、rs4148330 (ABCC1 G-260A)和rs2231142 (ABCG2 C421T) 4个snp:在dbSNP中，SNP的小等位基因频率大于0.1，并且在先前的研究中，SNP已被报道影响ABC转运体的表达/功能或与癌症风险/临床结果相关。使用QIAamp DNA试剂盒(Qiagen, Valencia, CA, USA)从胰腺组织或细胞中提取基因组DNA。利用7900HT快速实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems/Life Technologies, Grand Island, NY, USA)进行TaqMan SNP基因分型检测。real-time PCR结果验证等位基因鉴别分析，确保基因分型的准确性。

２.３.RNA分离和实时qRT-PCR

用RNeasy试剂盒(Qiagen)从冷冻胰腺组织或细胞中分离总RNA，用RT²First Strand试剂盒(SABiosciences/Qiagen)反转录成cDNA。SYBR green-based real-time qRT-PCR应用于CFX96 real-time PCR检测系统(Bio-Rad, Hercules, NC, USA)，引物购自SABiosciences。PCR产物经凝胶电泳和熔融曲线分析验证。管家基因phosphomannomutase 1 (PMM1)被用作标准化的内源性标准，因为正如其他人报道的那样[16，17]，我们发现，GAPDH的表达，而不是PMM1，胰癌标本增加。

2.4。细胞培养和细胞活性检测

人胰腺癌细胞，BXPC-3，ASPC-1，CFPAC-1，PANC-1，PL-45，的MiaPaCa-2和SU86.86，购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）（马纳萨斯，VA获得，USA）和如先前所描述培养[18］．简单地说，在播种后24小时(96孔板)，将胰腺癌细胞用不同浓度的吉西他滨(Eli Lilly Co.， Indianapolis, in, USA)处理48小时，并用CellTiter 96 AQueous One Solution cell Proliferation assay (Promega, Madison, WI)测定细胞存活率。(美国)通过遵循制造商的说明。导致50%生长抑制所需的吉西他滨浓度(IC_50.）的使用Graphpad Prism 6软件（圣地亚哥，CA，USA）计算。

2．5．统计分析

基因分型数据用PLINK (http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/)．所研究的SNP的基因型频率的独立性是为Hardy-Weinberg平衡测试。之间在ABCB1，ABCC1的频率的差异，和ABCG2基因多态性NOR和使用Fisher精确检验进行分析MAL标本。比值比（OR）和95％置信区间（CI）分别计算的等位基因和基因型的比较，以下共显性，显性和隐性遗传模型试验。除非另有说明，所述基因表达数据使用非配对比较以及。在所有情况下，结果被认为具有统计学意义的水平．

3.结果

在本研究分析的152个样本中(121个欧洲裔美国人)，所有4个snp的基因型和等位基因频率在整个研究人群和欧洲裔美国人亚群中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡。虽然在整个研究人群中，NOR组和MAL组的四种snp的等位基因频率没有差异，但rs2032582 (ABCB1 2677T)中的突变等位基因T在NOR组中的频率往往高于MAL欧洲美洲组(，数据未显示）。对于基因型频率，在ABCB1基因rs2032582和rs1045642的突变纯合基因型（2677TT和3435TT）均显著在整个研究人口和欧美亚组患胰腺癌的风险减少（表关联2和3.，， OR = 0.29 and， OR = 0.35，分别为，for the whole study population;， OR = 0.34 and， OR = 0.39，分别为，for the European Americans). The distributions of the two SNPs were also statistically significant for the recessive genetic model testing both in the whole study population and in the European American subgroup (G2677T为0.049;和0.035，为C3435T，RESP）。没有统计学差异被发现的NOR和MAL胰腺癌样本之间的另外两个SNP的等位基因和基因型频率。

我们分析了ABCB1、ABCC1和ABCG2基因的表达，发现在几乎所有研究人群/亚组中，与NOR胰腺相比，所有三种ABC转运体在MAL标本中都显著增加，但ABCC1在非裔美国人中的表达除外(图)1)．基于它们的基因型和与ABCC1 G-260A和ABCG2 C421T的基因型没有mRNA表达的相关性也比较三种ABC转运蛋白表达被发现（数据未显示）。然而，相对于其它基因型，ABCB1 2677TT和3435TT的突变体纯合子用在ABCB1的显著减少的表达NOR在整个研究人群和欧美子组既胰腺（图相关2(一个)和2 (b))．类似的趋势也出现在MAL标本，但差异无统计学显著。

由于ABCB1 G2677T和C3435T处于连锁不平衡状态，我们也比较了NOR和MAL标本中这两个SNPs的单倍型频率，并与欧洲美洲的mRNA表达相关。ABCB1 2677TT-3435TT单倍型与胰腺癌发病风险的降低显著相关(OR 0.27, 95% CI 0.08 - 0.92, OR 0.27, 95% CI 0.08 - 0.92)。）在欧裔美国人，和ABCB1的表达也低比其它单倍型（图3.)．

胰腺癌细胞系通常用于研究耐药机制。为了研究在本研究中鉴定的保护ABCB1基因型/单倍型是否与响应于化疗药物的任何功能上的意义相关，我们分析了ABCB1基因的表达，ABCB1的基因多态性，以及在七个胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性线。有趣的是，三个细胞系，MIAPACA-2，BXPC-3和CFPAC-1，被发现是ABCB1 2677TT和3435TT纯合子。细胞生存力测定法表明，这三种细胞系中均低于PANC-1，SU86.86，PL-45，和ASPC-1，其要么ABCB1 G2677T-C3435T野生型纯合子或杂合子（表对吉西他滨敏感更4)．然而，在这些细胞系中，ABCB1 mRNA表达与对吉西他滨的敏感性之间没有关联(见表1)4)．

4.讨论

许多因素都与胰腺癌患病风险增加有关，包括年龄、种族、肥胖、吸烟、糖尿病、慢性胰腺炎和遗传因素。事实上，遗传因素在家族性和散发性胰腺癌发病中都发挥着重要作用。BRCA2、PALB2、p16/CDKN2A、PRSS1、SPINK1和STK11等高外显基因的突变与罹患胰腺癌的极高终身风险相关，并可能导致美国多达10%的胰腺癌[19］．对于非家族性(散发性)胰腺癌，一些低外显率基因已被全基因组关联研究(GWAS)确定。胰腺癌候选基因也已从研究胰腺癌发展中已知的重要生物学途径，如烟草代谢、DNA修复、炎症和叶酸代谢的研究中报道[19，20.］．

在ABC转运蛋白基因遗传变体已经被深入研究并链接到差动疾病易感性和变化，以治疗药物[响应7］．在本研究中，我们发现ABCB1 2677TT和3435TT基因型与整个研究人群胰腺癌发病风险的降低相关(表)2)和欧美人(表格3.)．事实上,结合数据的欧裔美国人民族未知数(考虑到超过80%的胰腺癌患者在美国欧洲的美国人)表明,种代号为ABCB1的分布G2677T是统计学意义四叮铃声测试,包括对等位基因和基因型频率的确切概率法(，分别为0.039)、Cochran-Armitage趋势检验()和隐性遗传模型检验(）;对于ABCB1 C3435T，基因型频率Fisher’s Exact检验和隐性遗传模型检验有统计学意义(和、职责);的的Cochran-Armitage趋势检验的值（)和Fisher精确等位基因频率检验()接近统计学意义。由于样本量较小，我们无法在非裔美国人中测试相关性。即使有更多的样本，由于非裔美国人ABCB1 2677TT和3435TT的基因型频率非常低，仍然很难获得足够的统计能力来检测关联[21- - - - - -23］．据我们所知，这是关于ABCB1基因共同多态性影响胰腺癌遗传风险的首次报道。需要更多具有更大样本量的独立研究来验证这一有趣的发现。

与NOR胰腺相比，MAL标本中ABCB1、ABCC1和ABCG2基因表达显著增加(图)1)．这一发现与其他报道一致[9- - - - - -12ABC转运体可能参与胰腺癌化疗耐药。

ABCB1 2677TT和3435TT基因型/单倍型与正常胰腺组织中ABCB1的表达减少相关(图)2和3.)，但在胰腺癌标本中差异无统计学意义，这可能与MAL组TT变异样本量较小有关。事实上，这个结果与我们的观察相一致，ABCB1 2677TT和3435TT携带者较少发生胰腺癌(表)2和3.)．ABCB1 G2677T的非同义突变可导致明显的氨基酸变化(Ala > Ser)，与野生型相比，其底物特异性较低，药物刺激atp酶活性降低[23］．ABCB1 C3435T是一个同义突变，但该变体可以通过影响翻译效力来改变蛋白质表达[24］．自从ABCB1 3435TT首次被报道与肠道中ABCB1的表达相比CC纯合子显著相关以来，许多研究已经调查了ABCB1基因型/单倍型与不同组织中转运蛋白的表达/功能之间的关联[25］．然而，结果并不一致。我们的研究是第一个比较的基础上基因型胰腺组织ABC转运蛋白的表达。显然，更多的研究是必要的，以确认这项研究的结果。

吉西他滨常被用于胰腺癌术后的辅助治疗，尽管由于先天和获得性化疗耐药，患者反应率非常低，但仍是晚期胰腺癌的标准治疗方法。虽然人类平衡转运体已经被确定能够调节吉西他滨的摄取，但外排泵在吉西他滨转运中的作用尚未被明确描述。脱氧胞苷激酶是激活吉西他滨的限速酶，胞苷脱氨酶使吉西他滨失活为二氟脱氧尿苷，允许代谢物从细胞清除[26］．有趣的是，2'，2'- difluorodeoxyuridine（dFdU），吉西他滨的主要非活性代谢物，是ABC转运的底物[27］．非选择性抑制ABC转运体活性可显著增加细胞内dFdU水平，抑制胞苷脱氨酶，导致细胞内吉西他滨浓度增加，细胞毒性增强[27］．虽然吉西他滨可以不是ABCB1的直接底物，在表达或ABCB1的功能的改变可以对吉西他滨化疗的发展来作出了贡献。由于高水平的ABCB1基因表达的被链接到人胰腺癌的预后差[11]并且报道ABCB1 2677TT和3435TT基因型与增加的总存活在吉西他滨治疗术后胰腺癌患者[相关联的事实15]，本研究检查ABCB1基因型/单倍型与ABCB1 mRNA表达的关联并在几个胰腺癌细胞系对吉西他滨的敏感性。有趣的是，我们发现，与ABCB1 2677TT-3435TT单倍型的细胞系比携带其它单倍型的细胞对吉西他滨更敏感（表4)，但这些差异不能用ABCB1表达的变化或在这些细胞系中发现的已知突变来解释[28］．在这些胰腺癌细胞系的ABCB1 2677-3435单倍型可能与影响细胞对吉西他滨敏感其他未知的机制相关联。

ABC转运蛋白不仅是药物外排泵。许多研究已经阐明ABC转运的其他角色在癌症的发生和进展[8]：例如，（1）ABCB1已报道抑制在正常和肿瘤细胞凋亡级联;（2）由小干扰RNA抑制癌细胞增殖和肿瘤扩展在小鼠异种移植模型ABCB1敲低的;（3）ABCB1也被报道发挥细胞增殖的作用，活化因子与其受体protumorigenic血小板的交付。这些机制可能可以解释这项研究的是，在正常2677TT和3435TT运营商ABCB1较低的表达水平与降低患胰腺癌的风险相关的惊人的发现。

ABCB1 G2677T和C3435T是两个在不同人群中频率不同的功能性snp [21，22，25］．非裔美国人2677TT和3435TT基因型/单倍型的极低频率可能部分解释了为什么非裔美国人比欧洲裔美国人和亚裔美国人更容易患胰腺癌[29］．非洲裔美国人胰腺癌的最高发病率和死亡率比其他族裔在美国[29］．由于缺乏保护基因型/单倍型，ABCB1 2677TT和3435TT，可能有助于非洲裔美国人的胰腺癌和吉西他滨增加化疗耐药的可能性，因而预后较差更高的敏感性。

总之，本研究发现：（1）ABCB1 2677TT和3435TT基因型/单倍型与罹患胰腺癌的风险较低;（2）ABCB1的mRNA表达在ABCB1 2677TT和3435TT载波减少;和（3）的ABCB1 2677TT-3455TT单倍型可能与增加的敏感性的吉西他滨相比，其它单倍型。这项研究的结果可能在利用药物基因组学，指导胰腺癌化疗今后的实践帮助。然而，在不同种族的大研究来进一步证实这些结果。

免责声明

本文提出的观点并不一定反映食品药品监督管理局。

利益冲突

提交人声明没有关于本文的出版物的利益冲突。

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