文摘

目的。调查之间的关系乙型肝炎e抗原血清转化和树突状细胞(DC)的功能患者的乙型肝炎病毒。方法。外周血单核细胞(PBMC) 21慢性乙肝患者的免疫耐受状态,23个患者在不活跃的HBsAg携带者状态,和10个健康HBV-naive献血者被孵化,诱导成直流granulocyte-macrophage集落刺激因子(gm - csf)和interleukin-4 (il - 4),分别。表面标记表达式的直流被流式细胞术检测,和直流在同种异体的混合白细胞反应的刺激能力(高)被CCK-8测试,和水平的细胞因子释放的直流分析了酶联免疫吸附试验(ELISA)。结果。直流从免疫耐受的患者显示非常低的表面表达CD80、CD86, HLA-DR和表现出高的刺激能力受损和il - 12的分泌减少,而病人活动HBsAg携带者状态。之间没有显著差异的指标在不活跃的HBsAg携带者状态的患者和健康者。之间有显著差异的HBV DNA水平免疫耐受和不活跃的HBsAg航母战斗群()和一个负相关性HBV DNA水平和树突细胞的表达两组,分别为()。结论。直流从患者在不活跃的HBsAg携带者状态显示了更强的功能与免疫耐受的患者相比,树突细胞的表达与HBV DNA水平,和DC的功能阶段e抗原血清转化中起着重要的作用。

1。背景

据统计,慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染对人类构成严重风险,目前(影响大约3.5亿人1- - - - - -3,单单中国就有超过1.2亿人。乙肝感染的主要原因是慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌(4),占每年100万人死亡。慢性乙型肝炎病毒感染的自然过程可分为四个阶段:免疫耐受、免疫清除,低或nonreplication,复活(5,6]。同相的1 e抗原阳性患者乙肝病毒复制高但最小的肝脏疾病,第三阶段是不活跃的阶段期间,e抗原不在,病毒浓度很低,也有最小的肝脏炎症活动。虽然在第1阶段肝病活动低,25%的人倾向于肝脏疾病进展通过频率,程度上,和肝炎耀斑或急性发作的严重程度在第二免疫清除;一般来说,早期终止免疫耐受和随后的e抗原血清转化通常提供一个有利的结果,而延迟e抗原血清转化可能加速肝脏疾病的进展。

在持续的乙型肝炎病毒感染的发病机制,病毒和宿主的免疫反应中发挥重要作用。最近,积累报告表明树突状细胞的数量和功能在一定程度上受损的病人感染了乙型肝炎病毒(7,8]。DC的功能受损可能建议占乙肝病毒抗原呈递和T细胞刺激缺陷,这可能是慢性乙型肝炎病毒感染的原因。

因此,在这项研究中,我们调查了树突状细胞的表型和功能产生(PBMCs)患者外周血单核细胞在免疫耐受和低或nonreplication来确定它们之间是否有差异。我们希望这些数据将是有用的在解释不同免疫状态和水平之间的病毒患者两个阶段。

2。目标

的目标是检测树突状细胞的功能状态不同病人和关联函数和乙肝病毒复制的状态。

3所示。研究设计

3.1。主题

总共44例慢性乙型肝炎病毒感染患者登记从温州医学院第一附属医院。所有的病例根据慢性乙型肝炎诊断标准(在中国西安会议,2000年9月);患者乙型肝炎表面抗原阳性,至少6个月;我们排除了与其他病毒性肝炎感染的病人,和抗艾滋病病毒是负的。没有病人研究得到了抗病毒治疗前或有任何并发症如肝硬化和肝细胞癌(HCC)。44个病人分为两组:21患者e抗原阳性免疫耐受(IT)高血清病毒dna的水平,也为HBsAg, anti-HBcAbs和正常血清阳性丙氨酸转氨酶(ALT)水平;血清中ALT水平是衡量自动分析器(日立7600 - 110 -伊势);上限的截止(ULN)是正常的ALT 50 U / L;23例anti-HBeAb积极在不活跃的HBsAg携带者状态(ISC)察觉或低水平的病毒dna和HBsAg anti-HBcAb积极性和正常的ALT水平。所有的患者组,组ISC HBV基因型进行分析。 The baseline clinical data were shown in Table1。控制,10健康HBV-naive献血者(NC)进行评估。研究伦理委员会批准的协议是作者的单位,和书面知情同意是来自个人。

3.2。树突细胞隔离和文化

Monocyte-derived DCs (MoDCs)准备从外周血单核细胞(PBMCs)主要根据先前建立的协议(9,10]。PBMCs被Ficoll-Hypaque从刚画肝素化全血分离密度梯度离心法,洗两次,resuspended 2×10⁶/毫升RPMI 1640 (RPMI 1640媒介购买从GIBCO BRL盖瑟斯堡,医学博士,美国)。3 h后孵化有限公司37°C的5%₂6-well板,上层的丢弃和贴壁细胞孵化RPMI 1640 + 10%胎牛血清在一夜之间。轻轻不依从细胞被移除,RPMI 1640 10%胎牛血清补充100 ng / mL rhGM-CSF (Peprotech,英格兰)。和50 ng / mL rhIL-4(英国Peprotech)添加到井中。一半的中等刷新,细胞因子在中间添加浓度每2天。在孵化的第七天,25日rhTNF - ng / mLα(英国Peprotech)添加到介质,然后是第九天收集细胞。

3.3。树突状细胞的形态

树突状细胞的形态是由光学显微镜监控。

3.4。表面标记流式细胞术

9天,树突细胞是收获和沾染了共轭单克隆抗体mouse-anti-human, FITC-anti-CD80, PE-anti-CD86,和PE-anti-HLA-DR(所有从Ebioscience购买,圣地亚哥,美国),在室温下20分钟的黑暗。Isotype-matched抗体被用作控制。与PBS洗一次后,树突细胞固定在1%多聚甲醛,流式细胞术分析。

3.5。T细胞刺激

处理后25μ克/毫升的丝裂霉素在37°C为30分钟,树突细胞的浓度镀2×10⁴1×10⁴,5×10³细胞每分开,然后混合,孵化的不依从PBMC同样健康的人1×10的浓度⁵细胞每一式三份。总成交量调整到200μL /好,细胞被孵化的RPMI 1640 10%的额外96 h的边后卫37°C公司5%₂,然后20μL /好四唑盐(CCK-8)(购买来自铜仁、日本)添加到媒介4 h在年底前文化,而T淋巴细胞组(没有树突细胞一起孵化),只有RPMI 1640中等组,分别建立了作为阴性对照组和背景群体。吸光度(美国)是衡量ELX800G(生物技术)的检测波长450 nm和参考波长630 nm)。结果表示为刺激指数(SI)由以下公式计算:刺激指数=(值的样本−背景值)/(价值观的负面−控制背景值)。

3.6。树突状细胞分泌的细胞因子

看不到上层清液从混合淋巴细胞反应(MLR)收集4天IL-12p70检测使用酶联免疫吸附试验(ELISA),这是购买从研发系统(明尼阿波利斯,美国),根据制造商的指示。

3.7。数据分析

数据被表示为平均数±标准差。所有数据分析利用SPSS-XII软件。参数采集与组间方差的同质性是由最小显著差测试(LSD),而方差数据与异质性是由丹尼特T3测试。HBV DNA水平之间的相关性和树突细胞的表达是评估使用斯皮尔曼相关系数。

4所示。结果

4.1。树突状细胞的形态特征

第三天,许多细胞增长分支预测和小附着骨料可以观察到。第七天,越来越多的细胞诱导和开始暂停。与另两组相比,树突细胞免疫耐受的病人有更多的死亡或凋亡细胞颗粒在细胞质中,如图1。

4.2。树突细胞的表型

9天的文化、表型分析表明,表达水平CD80、CD86,和HLA-DR低免疫耐受的患者比另外两组。孤立的从患者树突状细胞激活HBsAg携带者状态表现出相似的表面分子的表达与健康对照组树突细胞。结果见表2和图2。

4.3。树突细胞的同种异体T细胞增殖

在反应过敏混合白细胞,T细胞增殖诱导树突状细胞水平的增加比率直流和T cell-dependent方式。ISC患者树突状细胞有较强的刺激能力比病人在图3。他们之间有显著差异,尤其是直流和T细胞的比例是1:5和1:10。实验并没有透露直流ISC患者和健康之间的显著差异控制在T细胞增殖。

4.4。树突状细胞分泌的细胞因子

IL-12p70的水平pg / mL患者,pg / mL ISC病人,和在健康对照组pg / mL。结果表明,IL-12p70减少定量在树突细胞培养从病人而ISC患者或健康对照组。然而,没有统计上显著的差异从患者树突状细胞激活HBsAg携带者状态或健康人IL-12p70的分泌。

4.5。HBV DNA水平和基因型

之间有显著差异的HBV DNA水平免疫耐受和不活跃的HBsAg航母战斗群()和一个负相关性HBV DNA水平和树突细胞的表达两组,分别为()。所有的患者在这两组基因型B或C基因型。基因型C的比例高于基因型B组和组ISC,分别。此外,基因型C组的比例高于ISC组。

5。讨论

病毒感染是如何逃避免疫应答的机制,导致慢性感染已经成为一个研究热点。相信细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应中起着重要作用在控制乙型肝炎病毒感染(11]。急性病毒性肝炎患者成功清除病毒,安装大量HBV-specific CTL反应。相反,这种反应在慢性感染患者缺失或极度疲弱不清除病毒。因此,病毒持续或慢性与CTL反应不足(12,13]。

树突状细胞是最强大的抗原递呈细胞(apc)发挥战略作用在启动和调节免疫反应(14]。DCs在antigen-capturing独特的设备齐全,加工、展示功能和作为初始T淋巴细胞激活的关键球员对抗病毒药物(15,16]。Beckebaum et al。17)提出,乙型肝炎病毒感染妥协与伴随的DC的抗原递呈功能障碍的辅助T细胞1型反应。

在现在的研究中,gm - csf和il - 4,直流隔离患者显示CD80的表达下降,CD86, HLA-DR和低allostimulatory能力当直流和T细胞的比例是1:5和1:10与ISC患者相比。然而,它们之间没有显著差异,当直流和T细胞的比例是1:20。可能的主要原因是DCs的数量太小,导致淋巴细胞增殖没有明显的差异。

至少两个信号是必要的来激活一个幼稚淋巴细胞才能识别和目标乙肝病毒抗原。绑定antigen-MHC复杂和TCR的幼稚T淋巴细胞代表第一个激活信号;costimulatory信号由结扎幼稚T细胞CD28的B7分子代表第二个信号。激活DCs过程抗原的能力,表达高水平的costimulatory分子;因此他们可以提供T细胞激活所需的信号。在我们的研究中,较低的表达costimulatory分子和allostimulation减少了患者DC表明抗原的失败表示,特别e抗原表示和T细胞刺激,诱导缺乏HBV-specific免疫反应,这可能发挥重要作用的差异这病人和ISC病人之间的免疫反应。通过测试被动免疫的效应与anti-HBe免疫球蛋白免费乙肝表面抗原的抗体实验乙型肝炎病毒感染黑猩猩模型中,斯蒂芬et al。18]建议anti-HBe调制可能有生物活性的乙肝病毒复制。因此,明显的差异的原因在乙肝病毒复制,ISC患者可能是由于缺乏e抗原引起的免疫反应的功能障碍。

直流提供的关键细胞因子被认为是第三个途径启动一种适应性免疫反应。il - 12是一个主要在第三途径诱导效应辅助T淋巴细胞(Th)响应Th1细胞分化。也参与了一代的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和激活细胞毒性的CD8 + T细胞,尤其是增效γ干扰素(IFN -γ)生产T淋巴细胞(19]。我们的实验结果显示il - 12的分泌减少直流患者诱导Th1 / Th2平衡。这种差异可能在于HBV持续复制。

e抗原血清转化后,一些患者到达第四阶段HBeAg-negative慢性乙型肝炎的特征- e抗原阳性anti-HBe,检测病毒dna (10⁴-10年⁸拷贝/毫升)和转氨酶升高。有两种假说解释乙肝病毒复制的复活。Precore (Pre-c)突变废除e抗原合成通过创建一个平移终止密码子,而基底核心启动子(BCP)突变降低e抗原表达转录机制(20.- - - - - -22]。因此,anti-HBe病人不是特定的突变病毒。这似乎并不是真的在e抗原血清转化。因此,没有病人HBeAg-negative慢性乙型肝炎被带进e抗原血清转化。

我们发现隔离直流ISC患者表现出相似的表面标记物的表达,alloreactive T细胞刺激,和il - 12的分泌,控制直流,对应之前的结果(23]。

乙型肝炎病毒基因型以前证明有明显的地理和种族分布,与B和C基因型流行在东南亚(24),我们目前的研究进一步证实了这个发现。所有患者的基因型B或c基因型之前的研究表明,HBV基因型影响乙肝病毒感染的疾病严重程度和长期的临床结果(25]。B基因型患者相比,基因型C患者迟到或缺席e抗原血清转化多个肝炎耀斑后加速慢性肝炎的进展(24,26]。大多数以前的研究表明,HBV基因型C感染患者有更高的肝硬化和肝癌的风险比B基因型感染(27- - - - - -29日]。病毒载量的影响对肝细胞癌的风险评估基于人群的前瞻性群组的台湾未经治疗的慢性乙肝患者(REVEAL-HBV研究)30.]。我们发现HBV DNA水平的基因型C高于b基因型HBV DNA浓度可能影响树突细胞的表达。但这些差异需要更严格地再次得到一个更大的病例数。

总之,目前的研究表明直流显示e抗原血清转化之后更强大的功能。DC的功能的改变可能发挥重要作用的差异之间的乙肝病毒的免疫反应和复制它病人和ISC病人。我们打算脉冲直流细胞e抗原或HBcAg增强DC的功能,尤其是在进一步研究e抗原的免疫反应。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。