文摘

本研究的目的是揭示microRNA miR-15a的协会和miR-16失调与结直肠癌患者的临床病理特点及预后。结果,我们发现miR-15a miR-16表达式,定量探测到实际time-PCR,都显著下调在结直肠癌组织中与邻结直肠粘膜(包括)。特别是miR-15a在结直肠癌组织的表达水平呈正相关,与miR-16显著(斯皮尔曼相关系数,)。此外,miR-15a和/或相关均显著地差别miR-16对这些先进的TNM(所有阶段组织学分级(所有),不佳)和阳性淋巴结转移(所有)。此外,生存分析确定miR-15a表达式,miR-16表达式,miR-15a / miR-16组合作为独立的预测因素不利的整体存活率和无病生存。有趣的是,miR-15a / miR-16组合的预后价值比miR-15a或独自miR-16表达更重要。集体,miR-15a的异常表达和miR-16可以用于分层肿瘤恶化的结直肠癌患者。miR-15a的结合模式有很大差别,miR-16对这些值区分患者结直肠癌手术后的预后差。

1。介绍

结直肠癌,常见的消化道恶性肿瘤,代表第三世界范围内最常见癌症和癌症死亡的第二大原因。在发达国家1]。虽然传统上被认为是更常见的在西方人群,结直肠癌的发病率在最近几年不断快速上升的在一些亚洲国家,如中国、韩国、日本和新加坡(2]。作为临床heterogeneous-multifocal疾病,结直肠癌在癌形成一个多步过程,进展和预后。虽然大肠癌的5年总体生存率已高达71.3%,复发患者的存活率仅为40% (3]。近50%的结直肠癌患者在6年内死于远处转移的早期诊断。肝脏是主要的和经常的唯一器官远处转移(4]。几个临床病理的特点,如tumor-node-metastasis TNM分期系统,基于特征的原发性肿瘤,淋巴结的存在和程度和远处转移,被用来评估预后的结直肠癌患者(5]。然而,病人的临床结果患者在同一个舞台上仍有很大的差异。因此,它是非常必要阐明大肠癌的致癌分子机制为了探索小说标记预测恶性肿瘤的进展及预后和指导临床医生选择适当的治疗。

小分子核糖核酸(microrna),一群高度保守的和小非编码rna与核苷酸,年龄在18岁至25岁之间的函数作为转录后的监管机构沉默mRNA的表达水平目标的互动与互补的站点(3′UTR)(3′端非翻译区6]。超过60%的人类蛋白质编码基因与microrna在选择性压力下保持配对,这意味着microrna可能扮演了一个重要的角色在管理不同的生理和病理过程,包括细胞增殖、分化、凋亡和致癌作用7]。尤其是在人类癌症,microrna可以作为肿瘤抑制基因或致癌基因根据他们的信使rna的功能目标。不同于大多数现有的生物标志物,microrna的表达似乎是细胞类型,针对疾病的模式和可用于某些癌症的分类histotypes [8]。越来越多的研究发现各种microrna异常表达在结直肠癌,可以准确区分恶性肿瘤从良性结肠粘膜组织。正义与发展党et al。9]发现38种microrna的表达谱与结直肠癌相关使用microrna的聚合酶链反应肿瘤中的数组和手术边缘组织样本来自土耳其40零星的早发性结直肠癌患者,发现mir - 106 - a和mir - 125 b与结直肠肿瘤的形成和入侵有关;王等人。10)建立了血清microrna的表达谱特征和测试其特异性和敏感性的生物标志物的诊断结肠直肠癌。

miR-15a和miR-16 (miR-15a / 16)集群在染色体13 q14.3本地化,基因组区域,经常删除大多数慢性淋巴细胞白血病(CLL),和一个子集套细胞淋巴瘤(11,12]。microrna miR-15a / 16编码的集群经常删除或许多癌症细胞系和各种肿瘤组织中表达下调,包括慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌,暗示他们在肿瘤恶化的恶性肿瘤(肿瘤抑制作用11- - - - - -16]。特别是,马和他的同事们表明,过度的miR-16可以抑制结肠癌细胞的增殖和诱导细胞凋亡通过内在细胞凋亡通路17];钱和他的同事发现了低miR-16表达式作为一个独立因素预测结直肠癌患者的预后不良(18];戴和他的同事们发现,miR-15a /结果可以应用在结肠癌治疗体内,导致有效的结肠肿瘤异种移植生长逮捕和血管生成减少19];施等人也报告说,p53诱导miR-15a /启用和AP4可以形成一个双重否定反馈回路调节epithelial-mesenchymal过渡和转移在结肠直肠癌20.]。然而,临床意义miR-15a / 16集群在结直肠癌尚未完全阐明。因此,本研究旨在揭示miR-15a协会和miR-16失调与结直肠癌患者的临床病理特点及预后。

2。材料和方法

2.1。研究人群

本研究的协议是机构研究伦理委员会批准的中南大学湘雅医院。获得了一份书面知情同意参加本研究的主题。

一百二十六年大肠癌患者(76名男性和50名女性),接受根治性切除率的普通外科,湘雅医院,中南大学,2001年2月到2003年1月,参加本研究。病人的平均年龄在录取的时候是66年,范围22 - 82年。没有一个病人收到了术前放疗或化疗。所有被证实组织病理学诊断,所有原发性肿瘤标本的石蜡块进行分析。只有零星的结直肠癌患者被选为我们的分析,和积极的病史患者遗传即结直肠癌或家族性腺瘤息肉病被排除在外的时候病人的集合。美国癌症联合委员会的第六版(与)TNM分期系统被用于肿瘤的分期。详细信息在所有126例结直肠癌的临床病理的特点在这个研究是表所示1。此外,126年邻结直肠粘膜手术切除来自同一患者和正常的组织学证实。

所有126例结直肠癌患者给予后续考试(直接评价或电话面试),从1到10年(平均6.18年)。比结直肠癌患者死于其他疾病或意外事件被排除在案例收集在这个研究。生存的分析和后续治疗手术的日期是用来表示后续时期的开始。无病生存期(DFS)被定义为从治疗手术的时间第一个肿瘤复发和远处转移。总生存期(OS)被定义为时间治疗手术后死于任何原因。

2.2。量化实际Time-PCR(存在)

表达水平miR-15a和126年miR-16对新鲜肿瘤样本与相邻的结直肠粘膜从126例结直肠癌患者检测到存在。总RNA分离试剂盒(表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。第一链cDNA合成进行了使用TaqMan微rna逆转录装备和RT引物特定于各种MicroRNA(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。实时PCR进行TaqMan普遍掌握混合二世和TaqMan微分析组合在7500年ABI棱镜(应用生物系统公司)。U6 RNA作为内部控制是正确的变化实验:miR-15a RT-primer: 5′gtc GTA太极拳AGT GCA GGG太极拳GAG GTA TTC GCA CTG手枪ACG ACC ACA AAC-3′;向前miR-15a PCR引物:5′gcg GCT AGC AGC ACA TAA TGG-3′,反向5′-GTG CAG GGT 20 gg条t - 3′;miR-16 RT-primer: 5′gtc GTA太极拳AGT GCA GGG太极拳GAG GTA TTC GCA CTG手枪ACG ACC ACA AGT-3′;向前miR-16 PCR引物:5′gcg GCA ACC CGT AGA太极拳GAA-3′,反向5′-GTG CAG GGT 20 gg条t - 3′;PCR引物对U6:向前5′ctc GCT TCG GCA GCA CA-3′,反向5′aac GCT柠檬酸CGA ATT TGC GT-3′。microrna的表达是基于阈值定义的周期(Ct)。 The方法被用来计算miR-15a或miR-16的相对表达水平。每个样本评估每个microrna的一式三份。

2.3。统计分析

使用SPSS统计分析软件包(版本13.0;SPSS . n:行情)、美国IL)。miR-15a或miR-16表达式在大肠癌组织和邻近的正常粘膜被成对正反相比测试。的以及或确切概率法来评估miR-15a / miR-16表达和临床病理特征之间的关系。miR-15a和miR-16表达之间的相关性是由斯皮尔曼等级相关分析。kaplan meier生存分析估计的方法,并通过使用生存率较相比。多变量分析了使用Cox比例风险模型。如果认为重要差异。

3所示。结果

3.1。Downregulation miR-15a和miR-16人类大肠癌组织

与相邻的结直肠粘膜相比,miR-15a(癌症与正常:与,,图1(一))和miR-16(癌症与正常:与,,图1 (b))结直肠癌组织中的表达均明显下调。特别是miR-15a在结直肠癌组织的表达水平呈正相关,与miR-16显著(斯皮尔曼相关系数,,图1 (c))。

然后,我们选择miR-15a的中间值(2.39)和miR-16截止点(1.93)表达式。结直肠癌患者miR-15a表达水平超过中间值或miR-16被认为是高表达miR-15a或miR-16;所有其他病人被认为是低表达miR-15a或miR-16。126结直肠癌患者,53例(42.06%)较低的表达miR-15a和miR-16 (miR-15a-low / miR-16-low), 30(23.81%)高表达miR-15a和miR-16 (miR-15a-high / miR-16-high), 23 (18.25%) miR-15a-high miR-16-low表达式(miR-15a-high / miR-16-low),和20例(15.87%)miR-15a-low miR-16-high表达式(miR-15a-low / miR-16-high)。

3.2。结合miR-15a协会和miR-16表达与结直肠癌的临床病理学特征

miR-15a协会和/或miR-16表达与结直肠癌的临床病理学特征总结表1。低miR-15a表达式和低miR-16表达均显著相关(TNM先进阶段、表1组织学分级(都)不佳、表1),淋巴结转移(的存在、表1)的结直肠癌患者。miR-15a和差别更重要的是,结合对这些miR-16 (miR-15a-low / miR-16-low)发现了53例(42.06%),更频繁地有先进的TNM阶段(、表1),组织学分级差(、表1)和阳性淋巴结转移(、表1比其他两个microrna的表达模式。然而,之间没有明显关系患者的性别、年龄、原发肿瘤,肿瘤大小或肿瘤浸润深度,miR-15a和miR-16和合并后的表达模式。

3.3。结合miR-15a预后的影响,在结肠直肠癌miR-16表达式

的潜在的预后影响miR-15a和/或miR-16表达kaplan meier结直肠癌进行评估的方法。因此,DFS和操作系统的患者低(miR-15a表达式,数据2(一个)和2 (b)、职责)或低(miR-16表达式,数据2 (c)和2 (d)、职责)都明显快于患者的高miR-15a表达或高miR-16表达式。更重要的是,患者结合miR-15a-low / miR-16-low表现最差的DFS和操作系统与其他两组相比(miR-15a-high / miR-16-high miR-15a-low(高)/ miR-16-high(低);这两个;数据2 (e)和2 (f)、职责)。

此外,单变量分析表明,淋巴结转移(和0.008,(职责),TNM阶段),组织学分级(和0.001,miR-15a表达式(职责),低)、低(miR-16表达式),并结合miR-15a-low / (miR-16-low表达式)都是有重大影响的因素DFS和操作系统(表2)。在多变量分析是根据Cox风险模型,TNM阶段是排除在外,因为它包含了淋巴结转移的临床病理因素。如表所示2淋巴结转移(和0.01,分别地),组织(包括年级),(miR-15a表达式),(miR-16表达式),并结合miR-15a / (miR-16表达式)都是独立的预后因素对DFS和OS大肠癌患者。值得注意的是,结合miR-15a / miR-16表达式的预后影响结直肠癌患者明显高于miR-15a表达式或独自miR-16表达式。

4所示。讨论

越来越多的证据表明,肿瘤发生和发展受干扰影响的人类大肠癌microrna的监管网络和他们的目标基因。然而,很少有信息关于microrna的恶性肿瘤。在目前的研究中,我们评估的表达水平miR-15a miR-16然后相关的表达水平与结直肠癌患者的临床病理学参数。后126名结肠癌患者的回顾性研究,结合分析miR-15a和miR-16表达成为结直肠癌预后的显著预测面板。它也作为一个独立的预后因子的结直肠癌淋巴结转移和组织学分级。我们所知,这是第一个研究表明miR-15a的临床价值和miR-16表达在一个大型系列的结直肠癌患者。

众所周知,microrna在癌症的重要性,一般而言,突出显示的观察恶性细胞microrna的表达模式发生改变。miR-15a miR-16,转录集群(miR-15a / miR-16),最初被确定为潜在的癌症基因在慢性淋巴细胞白血病的发病机制11),提供了第一个证据,这两个microrna对肿瘤发生可能是重要的。之后,积累研究报道的异常表达miR-15a miR-16在各种人类癌症和畸变的功能相关性(11- - - - - -16]。例如,Bandi和Vassella表明miR-15a / miR-16经常被删除或下调在肺鳞状细胞癌和腺癌。他们还证实,细胞周期蛋白是主要目标miR-15a G1 / miR-16在非小细胞肺癌表明这个集群可能涉及细胞周期控制和有助于肿瘤发生的恶性肿瘤(14]。巴塔查里亚和他的同事观察miR-15a的表达式和miR-16在卵巢癌细胞株和原发性卵巢组织和发现这些microrna能抑制卵巢癌细胞增殖和克隆增长目标Bmi-1 [21]。太阳和他的同事报道,miR-15a和miR-16可能影响多发性骨髓瘤的血管生成针对VEGF (22]。Musumeci和他的同事们提出了一个分子电路miR-15a和miR-16及其相关目标合作促进肿瘤发展和侵袭性前列腺癌的并发活动基质和癌症细胞(16]。Bonci和他的同事们还提出,miR-15a和miR-16可能作为肿瘤抑制基因在前列腺癌的控制细胞生存、增殖,和入侵23]。这些发现表明,miR-15a miR-16可能细胞特定类型的功能。

虽然了解的异常表达miR-15a miR-16人类结肠直肠癌,更知道这种畸变的临床意义。在当前的研究中,我们的数据,基于有一大群人的结直肠癌患者,miR-15a和miR-16恶性差别证实了对这些组织与邻近正常结直肠粘膜。我们还发现miR-15a都差别和/或miR-16对这些基因与阳性淋巴结转移有关,先进TNM阶段,所有参数和组织学分级差代表肿瘤侵犯。研究结果表明,miR-15a和miR-16都与肿瘤发生和结直肠癌肿瘤恶化。相同的染色体区域的两个microrna允许我们假设miR-15a / miR-16集群可以在结直肠癌发挥重要作用。此外,生存分析显示,所有可以预测差别miR-15a和/或miR-16对这些短DFS比相应的控制和操作系统。Cox比例风险模型进一步证明,结直肠癌患者miR-15a-low / miR-16-low表达式相对死亡风险高于其他表达式模式。更重要的是,合并的预后价值miR-15a / miR-16表达这种癌症是更重要的比miR-15a或miR-16表达式,这意味着miR-15a相结合的分析方法和miR-16表达状态可能会增强我们的精度识别高危病人侵略性肿瘤进展和预后不良,从而为临床管理提供有用的信息。

总之,我们的研究结果提供了令人信服的证据表明miR-15a的异常表达和miR-16可用于分层肿瘤恶化的结直肠癌患者。miR-15a的结合模式有很大差别,miR-16对这些值区分患者结直肠癌手术后的预后差。进一步调查的分子机制miR-15a / miR-16与结直肠致癌作用是必需的。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

肖杰通用电气和广发证券参与研究设计和协调和监督研究和分析和解释数据。Huihuan唐提供指导。魏苇肖和广发证券执行大部分的实验和统计分析和起草。剑和李Liandong霁进行实验和样品收集。所有作者阅读和批准了期末论文。