在体外预防沙门氏菌Lipopolysaccharide-Induced上皮屏障功能由不同的赔偿金额乳酸菌菌株

文摘

背景。乳酸菌显示了有益的抗炎作用沙门氏菌感染。紧密连接的维护(TJ)完整性起着重要的作用在避免细菌入侵。是否乳酸菌可以用来调节TJ蛋白的表达和分布在发炎的肠道上皮细胞。方法。使用transwell coculture模型,沙门氏菌脂多糖(LPS)水添加到极化Caco-2细胞cocultured外周血单核细胞在基底外侧隔间。LPS-stimulated Caco-2细胞和各种孵化乳酸菌菌株。TJ完整性决定通过测量transepithelial电阻在Caco-2单层。TJ蛋白的表达和定位(zonula-occludens -(佐薇)1)测定免疫印迹和免疫荧光显微镜。结果。不同菌株的乳酸菌负责不同的调节细胞层的完整性。有限合伙人是专门能够破坏上皮屏障,改变ZO-1的位置。我们的数据表明,乳酸菌可以减弱造成的肠上皮细胞屏障的破坏沙门氏菌有限合伙人管理。我们表明,乳酸菌菌株与紧密连接的维护和外观完整性。结论。在这项研究中我们提供了洞察生活益生菌可以改善上皮屏障属性,这也许可以解释他们的有益影响背后的潜在机制在活的有机体内。

1。介绍

沙门氏菌感染是全球人类食物中毒的常见原因和能引起广泛的疾病从轻微腹泻伤寒。所有沙门氏菌血清型分享的能力进入主机通过口服摄入受污染的食物或水。他们让自己吸收到肠上皮沙门氏菌致病性island-1 (SPI-1) 3型分泌系统。这个上皮屏障功能可以进一步削弱了感染细菌,包括美国沙门氏菌感染效应器(1,2]。沙门氏菌血清型培养的发展意味着违反粘膜上皮屏障的篡夺宿主细胞内信号传导机制(3]。很可能沙门氏菌诱发局部对紧密连接的影响渗透在肠道感染。这些影响可能协同作用与其他条件,如炎症反应,促进紧密连接(TJ)功能障碍[4]。目前,美国沙门氏菌感染克服肠道屏障是最被广泛接受的机制进入宿主细胞,特别是深层组织。因此,维护极化上皮紧密连接完整的单层避免细菌入侵中发挥着重要作用。

除了干扰屏障功能美国沙门氏菌感染效应器,证据还表明,脂多糖(LPS)可以诱导肠上皮屏障功能的紊乱。在我们之前的研究中,我们证明了的证据沙门氏菌LPS-induced炎症和上皮屏障功能障碍(5]。然而,特定的TJ负责屏障功能障碍尚未确定。通过使用极化上皮细胞层,我们可以明确的机制沙门氏菌有限合伙人改变TJ蛋白的分布。

关于沙门氏菌病的临床治疗,保守和支持性护理仍是主要的管理标准。抗生素只留给患者侵袭性疾病和不良表现。常规使用抗生素似乎出现耐多药耐药的风险增加美国沙门氏菌感染压力(6]。病人在患耐多药耐药细菌的风险将受益于预防治疗在过去的十年。然而,缺乏一个有效的抗生素治疗可能促进耐多药耐药细菌导致过剩的发病率和死亡率(7]。

潜在的改进使用益生菌在肠上皮屏障功能沙门氏菌感染在临床试验中两个方面得到了越来越多的证明和实验模型。在动物模型中,益生菌混合物被用来改善腹泻美国沙门氏菌感染来华的猪(8]。口服:# 3也被证明是有效的作为主要治疗老鼠。这些益生菌混合物被认为有效果增强通过直接改变上皮通透性屏障的完整性,从而保护上皮细胞从致病细菌入侵7]。

我们假设乳酸菌能够调节TJ蛋白的表达和分布在发炎的肠道上皮细胞,因此改变TJ结构。在我们之前的研究5),我们测试的相互作用美国沙门氏菌感染有限合伙人在人类上皮细胞培养的极化模型。我们成功地证明美国沙门氏菌感染有限合伙人可能会扰乱TJ在上皮结构单层在检查电阻和细胞通透性的变化。我们也调查了TJ蛋白表达等zonula-occludens -(佐薇)1作为适配器TJ(胞质表面的9),以及在体外的影响乳酸杆菌在TJ蛋白分布。我们的研究结果建议的一个重要的角色乳酸菌在调节TJ在肠道细胞的结构和功能。在这项研究中,我们试图确定不同的潜在能力乳酸菌菌株在执行上皮细胞屏障的肠道病原体美国沙门氏菌感染有限合伙人的挑战。

2。材料和方法

2.1。细菌和培养条件

乳杆菌GG (LGG)从BCRC购买(生物资源收集和研究中心、台湾)。商业压力l .干酪品种喂食Lcr35 (Antibiophilus)被用于这项研究。喂食(LR),l . paracasei(LP),l . johnsonii50 (LJ50),l . johnsonii59 (LJ59)获得TTY Biopharm(台湾)。那些乳酸杆菌在37°C下被限制曝气介质夫人(Difco)。活细菌数的集落形成单位(CFU)推导了吸光度的600海里(A600),为每个应变使用校准曲线。细菌细胞种植到固定相,在无菌磷酸盐缓冲盐水洗两次(PBS, pH值7.2),resuspended 1×10⁹在PBS含有20%甘油CFU /毫升,储存在−80°C到进一步使用。

2.2。细胞培养和Caco-2 /人类血液周边单核细胞(PBMC) Coculture模型

人类结肠癌细胞腺癌Caco-2(生物资源收集和研究中心,BCRC 67001;台湾;通道33-37)生长在0.8毫升杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)补充谷酰胺为2.0毫米,0.1毫米不重要的氨基酸,NaHCO 10毫米₃谷氨酰胺,1.7毫米,1.0毫米丙酮酸钠,20% (v / v)胎牛血清(ASFC生物科学、澳大利亚)。细胞被播种1×10⁵细胞/厘米²在12-well transwell插入(康宁,0.4μ从至少三米)。使用PBMCs献血者和孤立使用Ficoll-Hypaque(通用电气医疗集团超AB、瑞典)梯度离心法从健康的捐赠者。PBMCs (4.0×10⁶)转移到组织文化板块,1毫升RPMI 1640含10%血清的培养。细胞培养是维持在37°C在95%的空气和5%的公司₂在湿润的气氛中有三个细胞培养基每周变化。

2.3。诱导炎症反应和抗炎得分

诱导炎症反应,我们补充道美国沙门氏菌感染有限合伙人(10 ng / mL, L6143σ)的顶端室的基础上初步时间进程研究[5]。有限合伙人负对照组没有治疗。阳性对照组3人力资源的刺激后,所有的培养基在隔间被移除和冷PBS洗两次。发炎的极化Caco-2单层添加包含各种新鲜培养基乳酸菌菌株或阳性对照组乳酸菌、1、6、24小时。

2.4。电阻的测量

融合的测量控制transepithelial电阻(三通;世界精密仪器,萨拉索塔,佛罗里达州,美国)。分界点的te被定义为450Ω×厘米²我们也可视化在显微镜下细胞层完整性的一致性。三通是读四个时间点(0、1、6和24小时)。

2.5。免疫荧光显微镜

免疫荧光研究极化Caco-2室玻璃上镀单层膜是幻灯片(Deckglaser)和PBS洗两次3小时前接触有限合伙人(10 ng毫升⁻¹)。乳酸菌添加到红肿的单层膜和孵化24小时。细胞被固定在4%多聚甲醛(默克公司)和permeabilized Triton x - 100 (Sigma-Aldrich)为0.3%。研究TJ,非特定的绑定被封锁5%胎牛血清(SAFC、澳大利亚)45分钟前孵化与初级抗体(1:300鼠标anti-tight结蛋白1 (anti-ZO-1) 0.1毫克/毫升;美国σ)60分钟和二级抗体(1:500 Dylight 488山羊antirabbit免疫球蛋白G;杰克逊,美国)30分钟。结果分析了使用BX60荧光显微镜(奥林巴斯,汉堡,德国)。ZO-1染色观察两个独立观察员盲目的复制样品和执行三次。

2.6。免疫印迹

极化Caco-2单层膜发炎是补充道乳酸菌和生长在24-wells板。他们收获后孵化24小时。个别样本细胞溶解在一个冰冷的裂解缓冲(20毫米Tris-HCl, pH值7.4;150毫米氯化钠;5毫米MgCl₂;10%甘油;NP-40 0.5%;0.1% SDS;0.3μM抑肽酶;1μ米亮抑酶肽;PMSF约1毫米;1μM抑肽素),放在冰10分钟。细胞溶解样品在10000转离心5分钟在4°C和上层的收集。总蛋白质浓度被使用BCA量化分析工具包(美国热)。蛋白质分析,40岁μ克蛋白质添加同等体积的2×Laemmli样品缓冲和煮10分钟。样本运行在8%聚丙烯酰胺凝胶在100 V 1.5人力资源。蛋白质被转移到免疫印迹PVDF膜(Bio-Rad)。隔夜后阻塞(PBS /渐变补充0.05%脱脂奶粉),墨迹与初级孵化(鼠标anti-tight结蛋白1 (anti-ZO-1)(美国σ))和二级抗体(辣根过氧化物酶共轭anti-mouse免疫球蛋白(美国杰克逊))在室温下60分钟;蛋白质是由化学发光试剂可视化(美国热)和暴露于X-OMAT电影(美国柯达)。

统计数据。定量数据被表示为平均值±标准误差为一式三份(SE)测量。与学生进行了统计分析t以及使用SPSS 12.0。统计学意义是定义为一个P值< 0.05。

3所示。结果

3.1。的影响乳酸菌在Caco-2单层阻力

来确定是否改变Caco-2单层阻力之间的直接影响Lactobacillu年代和肠上皮细胞,我们选择了六株乳酸菌,然后把它们暴露于极化Caco-2单独单层。显著差异的测量值中极化单层有限合伙人治疗后观察3小时。三通是一个测量的上皮屏障的完整性,并在24小时监测保护。我们发现te价值观培养的上皮细胞的阳性对照组都在每一个时间框架(图最低1)。te的价值观不同乳酸菌孵化后组织仍然相对较近1小时。大多数乳酸菌菌株没有诱导三通6小时后的显著增加。然而,24小时孵化后,te LP和LR组中的值被发现在所有水平最高乳酸菌组。te的Lcr35集团通过24小时保持最低的时期。t值LGG、LJ50 LJ59组低于LP和LR组,有显著差异。这些结果表明,不同菌株的乳酸菌负责不同的调节细胞层的完整性。

3.2。有限合伙人对ZO-1位置和表达的影响

作为屏障功能,TJ至关重要的影响乳酸菌TJ完整性上的进一步研究。确定的表达ZO-1 TJ LPS-induced中断,我们进行免疫印迹分析,发现TJ膜蛋白ZO-1明显退化在PC和PC-24 h组(图2(一个))。我们还TJ标记包括ZO-1用于免疫荧光显微镜研究结肠上皮细胞(图2 (b))。ZO-1分布负对照组细胞通常有其自然流畅。然而,ZO-1高度破坏上皮细胞接触有限合伙人,出现在一个不连续医生模式有限合伙人治疗组。3人力资源风险敞口有限合伙人ZO-1导致损失的细胞间连接比阴性对照组。有限合伙人被发现参与上皮屏障的破坏和扰乱ZO-1的位置。

3.3。的影响乳酸菌在暴露于LPS ZO-1位置和表达

乳酸菌扮演着一个重要的角色在维护上皮屏障(1]。免疫印迹分析揭示ZO-1表达在不同的显著增加乳酸菌菌株和显示类似的密度除了电脑,PC-24 h, LJ59组(图2(一个))。此外,LR ZO-1显示类似的表达水平,LP和LGG组相比,数控组。我们发现,这些乳酸杆菌菌株也负责TJ蛋白的位置的变化。极化Caco-2层暴露在有限合伙人与各种压力的孵化乳酸菌24小时,ZO-1的定位是通过显微镜(图检查2 (b))。的中断TJ -对照组24小时孵化后无法逆转。负控制、LGG菌株和Lcr35没有影响TJ结构,外观,尺寸。此外,接触LR也使TJ结构曲线明显,和ZO-1变得更大。消极的控制和LP-incubated细胞组,ZO-1被发现局部细胞膜外侧,形成连续的网状模式特征。此外,我们发现多云网络式ZO-1出现在50组与菌株LJ和LJ 59治疗。即使在有限合伙人为24小时,我们发现ZO-1的外观保持不变。作为结论,我们这里显示不能逆转,打乱了TJ在有限时间内的有限合伙人。然而,乳酸菌菌株能够完全保护TJ的外观。

4所示。讨论

在人类中,胃肠道粘膜屏障是由肠道微生物菌群、黏液层,上皮细胞,它们之间的细胞间TJ定位(10]。TJ的关键分子参与paracellular渗透率的控制(11,12]。TJ是复杂的蛋白质结构组成的跨膜蛋白,它通过斑块与肌动蛋白细胞骨架蛋白质交互。信号通路参与了组装、拆卸和维护TJ控制的信号分子,如蛋白激酶C、增殖蛋白激酶、肌球蛋白轻链激酶,ρgtpase [13]。他们封paracellular上皮细胞之间的空间,从而防止paracellular扩散的微生物和其他上皮细胞抗原。

共生的细菌,通常在产后小鼠肠道在最初几周的生活,诱导表达的基因改善肠屏障功能,而细菌殖民化异常可能会破坏这一过程和宿主疾病的发展做出贡献14]。同桌的益生菌可以促进肠道屏障的完整性在体外和在活的有机体内。益生菌保护肠道屏障在结肠炎小鼠模型(8),减少肠道通透性在人类患者克罗恩氏病(15]。治疗的上皮细胞大肠杆菌Nissle 1917导致ZO-2蛋白表达增多和再分配的ZO-2胞质细胞边界在体外(16]。最近,l .杆菌DSM 2648能够减少的负面影响大肠杆菌(致肠病的大肠杆菌(EPEC)) O127:编辑(E2348/69)三通和依从性高达98.75%和80.18%,分别在同时或之前coculture相比EPEC独自孵化(17]。管理l .杆菌在健康志愿者被证实的十二指肠显著增加ZO-1和附近的occludin TJ结构(18]。

在这项研究中我们发现乳酸菌可以减弱造成的肠上皮细胞屏障破坏中断沙门氏菌有限合伙人管理。添加乳酸菌细胞培养基能够减少LPS-induced抑制三通和反向ZO-1 TJ蛋白表达的变化。

尽管本研究没有地址的机制益生菌抑制Caco-2 LPS-induced损伤的细胞,它可以是猜测大肠杆菌应变Nissle 1917 (EcN)可能会通过恢复中断上皮屏障感染大肠杆菌应变E2348/69 [16]。其他的研究表明,生活的抗炎作用嗜酸乳杆菌上增加transepithelial电阻与电阻的下降诱发形成鲜明反差大肠杆菌感染(19]。事实上,不同的乳酸菌菌株有不同变化特征在修复肠道屏障可能解释为什么LP能够恢复LPS-induced损害极化Caco-2单层更有效地比LJ50和LJ59当我们看着他们的te表情。

乳酸菌的另一个可能的作用方式是直接调节上皮细胞的功能。TJ可能发挥作用在防止病原体的入口进入上皮细胞。据报道,由益生菌发酵的水果刺激TJ维护和形成(20.]。此外,LGG有能力防止宿主细胞形态学的变化,附加/消除病变形成和单层抗肠出血性大肠杆菌O157: H7感染(21]。至少,一些益生菌被证明有能力稳定TJ和诱导粘蛋白分泌上皮细胞(22]。LPS刺激后,与应变coincubation LC可以稳定TJ结构。除此之外,增加株LGG Lcr35也导致类似TJ形态的原始Caco-2单层。LJ59组相比,TJ结构相比更差保持积极的控制。因此我们发现乳酸菌可能的潜在保护上皮屏障损伤引起LPS直接行动的上皮细胞。

尽管在不同的研究中设置,先前的研究报道乳酸菌有有益的抗炎作用沙门氏菌(5),它仍然是很难确定他们的直接作用机制。我们之前发现记录Lcr35的抗炎作用沙门氏菌有限合伙人(5]。几项研究显示,政府的不同乳酸菌压力可以减少腹泻(23]。受损的肠道屏障紧密连接和中断发生在小肠结肠炎。此外,益生菌政府证实有抗炎作用和小肠结肠炎的治疗中发挥着重要的作用24]。

总之,我们提供生活益生菌可以改善上皮屏障属性,这也许可以解释他们的有益影响背后的潜在机制在活的有机体内。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关。作者声明没有冲突的伦理关系。作者仅负责内容和论文的写作。作者没有一个商业也没有其他的联系可能构成利益冲突(如制药股份所有权,咨询公司顾问委员会成员、相关专利,或研究经费)。

信息披露

部分信息已经出现在第43届儿科胃肠病学的欧洲社会,肝脏病学和营养,6月9 - 12,2010年,土耳其伊斯坦布尔。抽象的数字是po - n - 414。

承认

这项研究的部分支持由马偕纪念医院的科研补助金(嗯- e - 101 - 12 - 1)。作者感谢TTY Biopharm(台湾)提供乳酸菌菌株。

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