迅速原位形成富含血小板血浆凝胶增强血管生成反应和增强早期伤口愈合后开放的腹部

文摘

目标。我们目前研究的目的是评估的潜力富含血小板血浆凝胶增强后肉芽组织形成开放的腹部和检查是否可归因于快速刺激新血管形成的影响。方法。24大鼠结肠ascendens支架腹膜炎手术引起败血症,其次是腹腔内注射的氮创建腹内的高血压。四个小时后,手术进行。老鼠被随机分为三组(为每个组):控制、platelet-poor等离子体(PPP)和富含血小板血浆(PRP)组。治疗一周后,肉芽组织形成和血管生成被组织学和激光多普勒分析评估。结果。由此导致富含血小板血浆血小板计数高于购买力平价。血小板源生长因子BB的浓度,将生长因子β1,血管内皮生长因子在PRP与购买力平价相比显著提高。Myofibroblast计数,肉芽组织厚度、船数,和血液灌注增加PRP组,其次是购买力平价,控制在最少。结论。迅速原位形成富含血小板血浆凝胶促进卓越的新血管形成和早期伤口愈合后开放的腹部和可能导致小说和有效治疗腹部伤口开放。

1。背景

离开腹部开放(也剖腹手术)已广泛应用于各种紧急手术的潜在好处严重受伤的病人,包括腹部筋膜室综合征,腹腔脓毒症、创伤,和战斗伤亡(1- - - - - -3]。损害控制剖腹手术通常达到较高的主筋膜闭包,但感染的管理打开腹部(OA)对外科医生构成巨大的挑战4- - - - - -6),通常病人留下一个“开放的腹部”,直到足够造粒的肠道隆起皮肤移植紧随其后。因此,促进肉芽组织形成早期阶段是必不可少的对那些病人如果关闭主筋膜是不能实现的。

开放腹部伤口的愈合过程涉及一系列复杂和动态的重叠阶段(7),招聘的修复细胞,生长因子,脚手架重组组织完整性至关重要。富含血小板血浆(PRP)凝胶的结构类似于自然的纤维蛋白凝块(8),可以作为细胞支架血管网络的渗透和组装。同时,PRP凝胶可用于提供大量重要的生长因子,如血小板源生长因子AB (PDGF-BB)、转化生长因子β1 (TGFβ1)和血管内皮生长因子(VEGF)和招募修复细胞组织损伤的网站(9,10),这是自然的伤口愈合的关键。事实上,局部使用富含血小板血浆胶体一直主张众多临床适应症11- - - - - -13]。这些观察和推论导致假设PRP凝胶补充将加速开放的腹部伤口愈合。但是,没有研究已经检查潜在的PRP凝胶作为治疗的一部分,以促进伤口愈合后开放的腹部。

在这项研究中,我们使用快速原位形成支架通过富含血小板血浆和platelet-poor等离子体(PPP)结合凝血剂(通常是牛凝血酶)治疗腹部伤口开放。我们的目的是评估如果用PRP凝胶治疗OA的伤口会显著提高OA愈合过程,减少所需的时间达到足够的肉芽组织形成为了进行皮肤移植,并检查是否可归因于快速刺激新血管形成的影响。

2。材料和方法

2.1。实验动物

48成年男性Sprague-Dawley老鼠(180 - 250 g,金陵医院,南京,中国)被用于本实验。动物被维护在一个控制环境(21±2°C,湿度50 - 60%,12小时光暗周期,和灯在6点),并允许自由获取食物和水。所有的动物保健和实验综述了协议和动物调查金陵医院伦理委员会批准。

2.2。制备富含血小板血浆

PRP准备了丰富全血血小板浓度使用两步离心分离过程。10毫升的全血从健康的老鼠心脏穿刺进入prechilled管包含ACD-A的血液/ ACD-A比9:1。随后,每个血液样本在400×g离心10分钟获得的三个典型层:红细胞在底部,“巴菲外套层之间,非细胞在浮在表面的等离子体。使用无菌吸管,上层被转移到另一个中立管以及淡黄色的外套和recentrifuged 800 g×10分钟。2毫升的PRP是省略了从管的底部和2毫升的购买力平价收集上层清液产生最终的PRP和购买力平价产品,分别。最后在全血血小板浓度,分析了PPP, PRP在自动计数器。样本的PRP和购买力平价被冻结在−80°C,然后用冷水解冻为了溶解血小板。TGF VEGF浓度β1,PDGF-BB在全血,购买力平价,测量PRP酶联免疫吸附试验(ELISA)根据制造商的指示。

2.3。外科手术和PRP凝胶原位

所有老鼠都禁食过夜,腹腔注射麻醉的克他命(50毫克/公斤体重)和甲苯噻嗪(5毫克/公斤体重)混合物。在无菌条件下,结肠ascendens支架腹膜炎(CASP)执行程序创建一个连续腹腔脓毒症(14]。简而言之,一个3毫米长静脉留置插管(14 g, Venflon Ohmeda,瑞典)插入并固定到结肠ascendens,大约1.5厘米远端回盲瓣,antimesenteric网站。通过仔细触诊的盲肠,插管充满了粪便。随后的重新定位的结肠ascendens和流体替换使用2毫升无菌生理盐水,腹部的层(肌肉和皮肤)缝合(5/0 Ethicon)。然后,硅胶导管(外径0.8毫米)插入腹腔氮气吹气,保持20毫米汞柱腹压的15]。4个小时后,我们打开了腹壁缝合,封闭的缺陷在结肠与单一反相缝合(5/0),并与10毫升生理盐水冲洗腹腔。然后我们删除全层腹壁,从而创建一个2厘米×3厘米缺陷。

之后,动物被随机分为三组:PRP组PPP组和对照组,每组八个老鼠。PRP或购买力平价凝胶作为双组分系统管理:准备PRP或购买力平价作为一个组件和一个凝血酶/ Ca^{+ 2}其他成分。系统使用一个double-syringe安排在两个组件涨跌互现原位立即分发前打开腹部伤口(图1(一))。PRP组和PPP集团PRP的伤口上覆盖着相同的大小或购买力平价凝胶(图1 (b),厚度约0.3厘米),分别与DuoDerm然后分层,额外的薄酱,使凝胶放置。最后,腹部被暂时关闭使用无菌聚丙烯网(巴德公司,特洛伊,MI)。在对照组,只与网格的伤口都淹没了。

2.4。组织学

肉芽组织和底层肠循环收集在第七天,10%中性甲醛固定,其次是在分级脱水乙醇(70%至100%),在石蜡包埋,连续使用切片机(5节μ米),随后与苏木精和伊红染色或CD31免疫组织化学和())sma (Abcam、剑桥、马)。

2.5。激光多普勒分析

伤口部位的血液灌注测量用激光散斑对比度成像(LSCI, PeriCamψ系统、Perimed瑞典)2分钟,确保时间稳定之间测量。系统使用一个不同的激光波长为785 nm。灌注图像的空间分辨率为0.2毫米/像素的测量距离12厘米。图像大小设置为对应2厘米×3厘米和图像采集率设置为3图像/ s。数据数字化和存储在一个电脑,意味着灌注水平区域的图像与信号处理软件分析了离线(PimSoft 1.4, Perimed AB,瑞典)。所有LSCI血液灌注测量提出了激光散斑灌注单位(LSPU)。

2.6。统计数据

数据提出了意味着±SEM除非另有注明。所有测量的至少六个不同的幻灯片或老鼠,为每个数据点与多个读数。连续变量分析单向方差分析。重复测量方差分析和LSD事后测试时使用比较两个以上的变量。所有统计分析与IBM SPSS统计18(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。全血中血小板浓度、购买力平价和PRP

全血血小板计数,购买力平价,PRP的平均值,,分别/ L。PRP包含2.47倍的血小板数量在整个血液样本,发现和PPP只包含6%的原始血小板计数。

3.2。生长因子在购买力平价和PRP

如图2,各种GFs进行测试,得到了不同浓度的GFs在购买力平价和PRP。VEGF,和pg / mL,分别在购买力平价和PRP决定。对于TGFβ1,和pg / mL,分别在购买力平价和PRP决定。PDGF-BB,和pg / mL,分别在购买力平价和PRP决定。这些生长因子在PRP所有值明显高于购买力平价()。

3.3。PRP凝胶促进愈合过程的早期

组织学分析显示,与对照组相比,PRP凝胶产生改善愈合反应,显示一个更快速的细胞积累和基质沉积。精确量化的新组织,我们选择其他三个独立的措施组织formation-granulation组织厚度、myofibroblasts计数,船舶数量和直径。

PRP凝胶治疗诱导显著增加1.4和2.5倍,分别在肉芽组织厚度与PPP和对照组相比(图3)。SMA染色显示,PRP组表现出显著增加myofibroblast正面面积与购买力平价和对照组相比(图4)。此外,增加组织血管化与PRP凝胶对治疗的反应观察7天,就是明证积极CD31染色(图5),与购买力平价和对照组相比。

3.4。PRP凝胶促进血管生成反应

为了更好地确定发展中血管的功能,我们分析了伤口7天,使用激光多普勒在伤口地区评估血液灌注。我们发现PRP凝胶诱导更多的血液流向伤口面积比PPP支架,伤口只覆盖着网(图6)。例如,与PRP凝胶是293 LSPU血液灌注,而血液灌注只有193年和183年LSPU购买力平价和对照组,分别。之间没有显著差异PRP gel-treated伤口和控制。

4所示。讨论

在这项研究中,我们演示了局部的好处富含血小板血浆凝胶治疗腹部伤口开放。我们已经表明,伤口处理PRP凝胶表现出更快的痊愈率和足够的肉芽组织形成独自的伤口处理网相比,随后减少所花费的时间进行植皮手术。此外,局部使用的PRP凝胶已经被证明可以增强血管生成后的修复过程的早期阶段开放的腹部,随后,促进伤口愈合。

对开放的潜在并发症腹部伤口继续进化。因此,各种手术技术和nonanatomic报道替代尽快恢复提出了OA后腹部域。一般来说,早期的管理的最优目标是促进早期关闭(在第一个7天),防止延迟并发症。然而,在某些情况下,特别是在受感染的腹部,关闭主腹部筋膜是不可能继发于持续的内脏水肿和枯竭的筋膜边缘由于炎症和横向收缩。在这些情况下,病人留下一个“开放的腹部”,直到足够的造粒。因此,促进肉芽组织的形成是必要的,以防止早期并发症。

使用血液生物材料密封伤口和加速愈合开始使用纤维蛋白胶在1970年代初,由一个高度集中的纤维蛋白原(凝血酶引起的聚合和钙)16,17]。当时吉拉德等人于2002年首次引入患者腹部开放促进肠瘘的治疗(18]。即使是现在,十年之后,他们使用开放腹部伤口的治疗仍然是非常有限的,由于成本和复杂性在生产19]。因此,使用血小板集中刺激治疗和替代纤维蛋白胶,作为第一所描述的惠特曼et al。20.),增加了它的受欢迎程度在过去的十年中,在许多临床条件下(12,21,22]。然而,我们所知没有先前的研究来评估PRP凝胶对伤口愈合的影响开放后腹部及其机制。

一般来说,经典伤口愈合有三个阶段:炎症,增殖和装修阶段7]。伤口修复的早期阶段始于止血和血小板塞的形成,其次是纤维蛋白基质,成为渗透的支架细胞参与血管生成和组织修复。然而,以下特点使感染打开腹部伤口的愈合过程我们上面描述:打开腹部伤口感染,类似于铬的伤口,被认为是提高蛋白酶和蛋白酶抑制剂减少。因此这些可以减少形成新组织的能力。PRP凝胶,在结构上类似于自然纤维蛋白凝块(8),不能只提供结构支持不断增长的细胞,但也调节基质金属蛋白酶的生产(23),从而加速愈合过程。

此外,血小板集中包含许多强大的促有丝分裂的和趋化现象的生长因子,调节组织修复的关键过程,包括细胞增殖、趋化性、迁移,细胞分化,细胞外基质合成(10,24]。bFGF, PDGF TGFβ、IGF、EGF对成纤维细胞趋化因子(25,26]。VEGF和bFGF诱导pro-angiogenic表型在培养的内皮细胞27]。骨髓基质细胞,recruitable在组织修复过程中,也调节了PRP (28]。一些生长因子,如VEGF、PDGF和bFGF,成为复杂参与血管生成(29日,30.]。所有上述生长因子释放的PRP凝胶。此外,bFGF和TGFβ表达下调在慢性伤口和浓度远低于那些报道从急性伤口31日]。此外,通过使用PRP凝胶作为生长因子来源穿着伤口,因此,在活的有机体内促进愈合应该治疗,当地的可用性保证了控制生长因子的释放。

此外,观察到的效应可能部分由于其抗菌活性。PRP中血小板扮演的角色在伤口处在宿主防御机制已经被先前的研究证明(32,33]。纯富含血小板血浆和platelet-leukocyte凝胶抑制粪肠球菌,白色念珠菌,链球菌agalactiae,链球菌oralis。这可能代表一个有价值的属性的增强腹部伤口愈合后开放。

我们建议PRP凝胶用于临床实践。它可以访问大多数医生,无论是在大城市还是在这些地区医院设施。PRP凝胶很容易准备的只有20 - 40毫升自体血液病人和相对较低的成本。所有可用的PRP方法共同原则:收集血液的抗凝剂使用前,立即离心两次。这次是变量,但总是不超过一个小时内完成。同时,应用自体PRP凝胶伤口网站在技术上是容易,可以作为传统的非手术疗法。获得浓缩血小板、凝血酶和氯化钙,分别放置在double-syringe系统远端混合装置。

各种技术,目标的实现确定的主筋膜(DPC)关闭或恢复腹部域,现在可以使用开放的腹部后,包括波哥大袋,维补丁,合成网,真空吸尘器设备,或各种方法的组合6,34,35]。然而,迄今为止,没有任何数据表明一个在促进DPC(尤其比另一4]。英国国家的一项研究报道,NPWT是降低27%(只有44.9%)延迟主要关闭率在患者腹部开管理脓毒症(5]。低延迟的主要关闭表明这些技术,包括NPWT,可用作明确的治疗腹腔脓毒症的设置,使用生物材料,如PRP凝胶,获得发自内心的报道,直到伤口可以进行皮肤移植。虽然相结合的方法合成材料和生物派生组件是有吸引力的,因为它可以促进伤口愈合,同时保留机械性能,需要额外的研究来确定最优算法管理开放的腹部后腹腔脓毒症。

作为一个初步研究,需要解决一些局限性。首先,我们的方法的一个潜在的弱点是同种异体代替自体PRP使用。最初,PRP定义为自体血小板浓度在等离子体的体积小9]。等实验模型大鼠的血容量太小,产生自体PRP,因此需要使用捐赠者的血液PRP的准备。根据马克思9),使用动物血小板捐献者传达传授一个明显的免疫反应的风险,这可能会导致假阴性结果。然而,最新的研究可以消除这种担忧因为示范的积极作用36]。第二,本研究只是侧重于早期伤口愈合的过程,但尚未评估在后续进展进一步对器官功能的影响伤口愈合,皮肤移植,和相关的并发症。在下一阶段,我们需要检查观察结果的后果。

总之,迅速原位形成富含血小板血浆凝胶促进了非凡的新血管形成和伤口愈合后的早期阶段开放的腹部。这些结果鼓励技术和可能导致的进一步临床研究小说和有效治疗腹部伤口开放。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(批准号81270478)和攀登计划在江苏省自然科学基金杰出学者(赠款。BK2010017)。作者感谢教授小梅邵和健桥方帮助教PeriCam PSI的使用系统。

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