Di (2-ethylhexyl)邻苯二甲酸酯的影响幽门螺杆菌全身的细胞凋亡在AGS细胞

文摘

塑料制品广泛应用于人类生活。Di (2-ethylhexyl)邻苯二甲酸酯(DEHP)是一个重要的添加剂塑料制造,用作增塑剂对许多产品包括塑料食品包装。DEHP是畸形形成的化合物,从而导致有效的生殖毒性。DEHP也会导致肝损伤、过氧物酶体增殖和致癌作用。DEHP也与消化性溃疡和胃癌密切相关;然而,潜在的影响和机制DEHP的胃肠道并不完全清楚。口腔感染途径幽门螺旋杆菌相似DEHP的主要摄入途径进入人体。因此,我们想要研究DEHP和的影响幽门螺旋杆菌暴露在人类胃上皮细胞系,AGS(胃腺癌)。AGS细胞系的生存能力显著低于80年μM-DEHP和幽门螺旋杆菌(MOI = 100: 1) coexposure比DEHP幽门螺旋杆菌一个人。DEHP和幽门螺旋杆菌coexposure也诱导caspase-3激活,增加了伯灵顿/ bcl - 2比例在AGS细胞和DNA碎片。这些结果表明DEHP可以增强幽门螺旋杆菌细胞毒性和诱导胃上皮细胞凋亡。因此,它是可能的,DEHP幽门螺旋杆菌coexposure可能增强胃黏膜完整性的破坏和潜在的促进胃致癌作用的发病机理。

1。介绍

Di (2-ethylhexyl)邻苯二甲酸酯(DEHP)是最常见的增塑剂用于提高聚氯乙烯(PVC)的灵活性。DEHP通常用于开发灵活的塑料食品包装,塑料地板,地毯材料、屋面材料、塑料墙治疗,室内装饰,电线,电缆包装材料、和儿童玩具1]。DEHP也用作吸尘器,工业溶剂、润湿剂和润滑剂2]。人体接触DEHP通常发生在空气、水、或皮肤接触DEHP-contained塑料(3];然而,最常见的接触源是由于摄入受污染的包装食品。由于其化学结构,DEHP容易溶解和从包装材料渗透到食物2- - - - - -4]。

邻苯二甲酸酯暴露在人类可以有许多潜在的健康影响。例如,一项研究报道,DEHP和mono-2-ethylhexyl邻苯二甲酸二(MEHP)可以通过胎盘和缩短的妊娠期胎儿发育(5]。DEHP也延迟男性生殖系统的发展2]。最近的证据也显示产前接触dhcp有关妊娠期较短(6),但产前接触dhcp不会影响分娩(7]。虽然口服摄入DEHP是一种最常见的人类接触的路线,这毒素在胃上皮细胞的影响尚未完全阐明。

人类的胃病原体,幽门螺杆菌(幽门螺旋杆菌),是一个螺旋革兰氏阴性微量需氧的细菌,它可以有选择地殖民的黏液层胃,可能导致严重的胃问题包括发展的慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌(8]。幽门螺旋杆菌通常是通过各种方式传播给人类,包括oral-oral和粪口途径(9]。幽门螺旋杆菌感染诱导细胞凋亡,胃上皮细胞的效应被报道与体内(10,11)和体外研究(12- - - - - -14]。

塑料广泛应用于食品包装在台湾和世界;然而,DEHP接触通常是在台湾人口高于其他国家如德国或美国(15,16]。幽门螺旋杆菌感染发生在大约50%的世界人口。台湾人口54.4%抗体血清阳性幽门螺旋杆菌(17),这是高于幽门螺旋杆菌血清阳性在其他国家,比如爱尔兰(18]。综上所述,这些数据表明DEHP的高曝光率和高的感染率幽门螺旋杆菌台湾人民,以及世界上的其他国家,可能是一个重要的健康问题;然而,DEHP和的影响幽门螺旋杆菌coexposure在胃上皮细胞是不清楚。出于这个原因,DEHP和的影响幽门螺旋杆菌coexposure在胃上皮细胞凋亡,作为一个指示器的上皮细胞的完整性,减少了在这个研究。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

一个人胃上皮细胞系,AGS(胃腺癌。BCRC 60102),从细胞库购买台湾国家卫生研究所和生长在RPMI 1640中补充10%胎牛血清,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素或0.1%庆大霉素(美国UT Hyclone,洛根)。AGS细胞被播种在2 ~ 2.5×10的密度⁵/ 35毫米培养皿或5 ~ 5.5×10⁵/ 25 T烧瓶,孵化24小时,转向培养基含有0 ~ 80μM DEHP (CAS编号:117-81-7,Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。DEHP水溶性有限;股票随后DEHP准备在DMSO溶液稀释不同浓度与细胞培养基。培养基的最后DMSO溶液的浓度大约是1%,对细胞生存能力没有显著的影响。所有文化都生长在湿润孵化器在37°C和95%空气- 5%公司的氛围₂。

2.2。幽门螺旋杆菌文化

由于细胞毒素的作用相关的基因(CagA)和空泡细胞毒素(VacA)基因,基因通常与幽门螺旋杆菌胃相关细胞凋亡(19),CagA / VacA积极幽门螺旋杆菌应变写明ATCC 43054,从细胞购买银行的台湾国家卫生研究所,被用于这项研究。写明ATCC 43054培养在trypticase大豆琼脂5%羊的血液(杰塞普,科廷马西森,医学博士,美国)与Skirrow选择性抗生素补充(Prolab Inc .,斯卡伯勒,加拿大)37°C有限公司₂/ O₂水夹套保温箱(福马科学、玛丽埃塔,哦,美国)微量需氧的条件下(10%股份有限公司₂,7.5%的人啊₂,82.5% N₂)。幽门螺旋杆菌细菌被添加到细胞:细胞浓度范围(感染的多样性,莫伊)100:1 - 25:1。幽门螺旋杆菌章节5至15用于这些实验,以确保细菌能够很容易坚持AGS细胞。坚持使用显微镜是可视化。

2.3。细胞生存能力分析

AGS细胞被播种在48-well文化板块的密度100细胞/毫米²为24小时,允许增长,转向文化传媒与或不含DEHP幽门螺旋杆菌18至48小时。测量细胞生存能力,MTT (3 - 4 5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴化,0.5毫克/毫升;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)被添加到每个好,和盘子孵化3小时37°C。甲瓒晶体(代谢活动的产物)溶解在异丙醇与0.04%盐酸甲瓒在每个好量化使用丹尼克斯MRX II分光光度计(美国弗吉尼亚州Chantilly丹尼克斯技术)在吸收频率的540和630海里。数据汇集从至少三个独立的实验,和复制井的数量≥4。

2.4。DNA碎片分析

DNA碎片是量化的程度使用细胞死亡ELISA检测⁺工具包(罗氏,曼海姆,德国)按照制造商的手册。简而言之,通过添加裂解缓冲到每个细胞细胞溶解,酝酿在4°C为30分钟。每个板块在200×g离心10分钟,和20μL的上层清液被转移到streptavidin-coated井。井是接受一个anti-histone——和anti-DNA-containing immuno-reagent,孵化在室温下2小时,洗了三次,与过氧化物酶底物和治疗2,2′-azino-di——(3-ethyl-benzthiazoline磺酸盐)。吸收在405纳米测量使用丹尼克斯MRX II分光光度计(英国丹尼克斯技术,Billingshurst)。

2.5。免疫印迹分析Caspase-3, Caspase-8、伯灵顿和bcl - 2

细胞蛋白提取(20μg)变性在十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲在95°C 5分钟,装上10 - 20%梯度SDS-polyacrylamide凝胶电泳(页面)凝胶(表达载体),并通过电泳分离。分离蛋白质被转移到一个聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。5%脱脂牛奶的膜被Tris-buffered盐水(TBS)含0.05% Tween-20和抗体治疗活跃caspase-3(兔多克隆antiactive caspase-3抗体,1:500年,Abcam,剑桥,妈,美国),活跃caspase-8(兔多克隆antiactive caspase-8抗体,1:1000年,Abcam,),伯灵顿(鼠标多克隆抗体anti-Bax 1: 500年,圣克鲁斯生物技术(SCBT),圣克鲁斯,CA,美国),bcl - 2(鼠标多克隆抗体anti-Bcl-2 1: 500年,SCBT), GAPDH(鸡多克隆抗体anti-GAPDH 1: 1000年,微孔,Billerica,妈,美国)β肌动蛋白(鼠标单克隆抗-β肌动蛋白抗体,1:1000,SCBT)。使用HRP-conjugated二级抗体结合抗体检测(1:5000年,杰克逊ImmunoResearch实验室;美国西树林,PA)和增强化学发光(ECL, Amersham法玛西亚生物技术,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)。密度测量的图像墨迹图上可视化BioSpectrum AC成像系统(美国UVP高地,CA)和使用视觉WorksLS分析软件进行分析。

2.6。统计分析

为每个组的至少一式三份实验操作条件。定量数据表示为均值±SD统计进行使用SigmaStat 3.5(美国加利福尼亚州圣何塞SysStat软件)。研究和对照组之间的差异是由方差分析评估(方差分析)。组间差异的显著性水准进一步分析使用事后费舍尔最显著差异(LSD)测试。一个被定义为具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。DEHP和幽门螺旋杆菌Coexposure AGS细胞生存能力降低

AGS细胞的细胞生存能力DEHP治疗24小时后如图1(一)。细胞生存能力明显暴露后80年有所下降μDEHP治疗(一维方差分析、)。0.1μ米(),1μ米(),10μ米(DEHP)也引起一个无意义的AGS细胞生存能力下降,相比用DMSO(车辆)集团由一维方差分析和测试。此外,无显著统计学差异(一维方差分析、)是观察之间的控制(培养基没有DMSO)和汽车集团。自从dehp - 80μ米最重要的细胞生存能力下降引起的,这个浓度是用于进一步的实验。

DEHP和后AGS细胞生存能力幽门螺旋杆菌coexposure呈现在图1 (b)。细胞生存能力显著降低了dehp - 80μM 18人力资源(一维方差分析,)。幽门螺旋杆菌感染显著增加AGS细胞死亡(感染复数)MOI-dependent的方式。相比之下,汽车或幽门螺旋杆菌孤独,dehp - 80μM和幽门螺旋杆菌coexposure显著降低AGS细胞的细胞生存能力后18小时暴露(一维方差分析、)。相比之下,dehp - 80μ米,dehp - 80μM和幽门螺旋杆菌coexposure也显著降低AGS细胞后的细胞生存能力幽门螺旋杆菌(MOI = 100/1) coexposure(一维方差分析、)。这一结果不仅意味着DEHP和细胞毒性的影响幽门螺旋杆菌独自AGS细胞,但它也表明DEHP和幽门螺旋杆菌接触有添加剂对AGS细胞细胞毒性的影响。的细胞毒性幽门螺旋杆菌莫伊的100/1,加上DEHP高于我的50/1,我的25/1,这个实验条件是用于进一步的研究。此外,无显著统计学差异在细胞组之间的可行性幽门螺旋杆菌在DMSO(车辆)和幽门螺旋杆菌(MOI = 100: 1、50: 1和25:1)培养基(一维方差分析、,,职责)。

时间进程的一项研究在DEHP和AGS细胞生存能力的变化幽门螺旋杆菌coexposure图所示1 (c)。细胞生存能力明显时间的方式降低了dehp - 80μ治疗(一维方差分析、)。dehp - 80μM和幽门螺旋杆菌(MOI = 100: 1) coexposure更重要的是减少AGS细胞生存能力。因为几乎细胞(大约87%)死后18小时的暴露和细胞生存能力没有明显统计学差异18小时和24小时后dehp - 80μM和幽门螺旋杆菌coexposure(一维方差分析,),因此,DEHP和幽门螺旋杆菌治疗18人力资源被选中作进一步实验。

3.2。DEHP和幽门螺旋杆菌Coexposure-Induced AGS细胞的凋亡

细胞死亡检测⁺系统(罗氏)是用于检测AGS细胞凋亡(图2)。DEHP剂量依赖性增加诱导无DNA碎片的比率。与车辆组相比,18小时暴露dehp - 80μM展出一个无意义的倾向增加DNA碎片比率(单向方差分析,)。DEHP和幽门螺旋杆菌(100/1)的莫伊coexposure 18人力资源,然而,显著增加DNA碎片比率(单向方差分析,)。DNA碎片后比dehp - 80μM和幽门螺旋杆菌coexposure明显高于DEHP(单向方差分析,)或幽门螺旋杆菌独自一人(单向方差分析,)。这个结果意味着DEHP可增强毒性幽门螺旋杆菌和增加幽门螺旋杆菌- - - - - -诱导AGS细胞的凋亡。此外,的比例幽门螺旋杆菌全身的DNA碎片没有表现出显著差异在DMSO-containing或正常的媒介,这表明的活性和毒性幽门螺旋杆菌没有受到DMSO溶液的影响。

3.3。DEHP和幽门螺旋杆菌Coexposure伯灵顿/ bcl - 2比例增加

DEHP和后伯灵顿和bcl - 2蛋白的表达幽门螺旋杆菌治疗3小时检测通过免疫印迹分析和伯灵顿/ bcl - 2比例计算。dehp - 80μ米(一维方差分析、)或幽门螺旋杆菌单独治疗(一维方差分析,伯灵顿/ bcl - 2比例增加;然而,dehp - 80的综合治疗μM和幽门螺旋杆菌coexposure引起更高的伯灵顿/ bcl - 2比例增加(一维方差分析、)(图3)。这个结果暗示DEHP幽门螺旋杆菌coexposure伯灵顿之间的平衡和bcl - 2蛋白表达的干扰。

3.4。DEHP和幽门螺旋杆菌Coexposure活跃的表达形式的Caspase-3 Caspase-8

表达积极caspase-3和caspase-8蛋白质18人力资源DEHP和后幽门螺旋杆菌治疗是由免疫印迹分析和量化研究的结果发表在数字4和5。表达积极caspase-3后显著增加幽门螺旋杆菌/ DEHP一氧化碳暴露,尤其是DEHP - 80μM结合幽门螺旋杆菌治疗(一维方差分析、,而汽车集团)(图4)。dehp - 80μ米/幽门螺旋杆菌co-exposure-induced活跃caspase-3蛋白表达,也高于dehp - 80μ米(一维方差分析、)或幽门螺旋杆菌独自一人(一维方差分析,)。活跃caspase-8表达式在18小时DEHP或没有明显改变幽门螺旋杆菌(一维方差分析,)(图5)。这些apoptosis-related蛋白质的比例也总结表1平均数±标准差。

4所示。讨论

幽门螺杆菌(幽门螺旋杆菌)细菌首次识别和隔离胃炎和消化性溃疡患者的胃活组织检查20.]。美国国立卫生研究院共识发展会议(21)确定幽门螺旋杆菌作为消化性溃疡发展的主要原因。幽门螺旋杆菌也是评估由国际癌症研究机构(IARC)和被认定为人类组1致癌物(1994)。幽门螺旋杆菌与胃腺癌和胃淋巴瘤有关。幽门螺旋杆菌通过各种方式传播给人类,包括oral-oral和粪口途径(9]。

DEHP是一种增塑剂,广泛在食品包装,这往往可以从塑料包装实际上迁移污染包装食品(22]。DEHP污染是普遍的整个食物链23]。肉类、鱼类、奶制品、新鲜水果,面包都表现出DEHP污染的患病率为100%。其他重要的食物也表现出DEHP污染程度较轻的患病率;谷物和豆类(93%)、蔬菜(80%)、调味品(66%)(24]。估计每日摄取的邻苯二甲酸酯一般台湾人口约0.1到309.6μg / kgBW /天(约0.015到47.5μ米,体重60公斤的成年人)[15]。PVC行业的工人,邻苯二甲酸酯的日摄入量是更高的约为-850 - 0.6μg / kgBW /天(约0.092到130.6μ米,体重60公斤的成年人)[25]。从人体中DEHP的半衰期(范围在16和24小时26],DEHP可以刺激胃肠道上皮细胞和积累在人体内通过可持续DEHP-contaminated食品的摄入。在人类中,摄入10克DEHP (~ 426μM,假设60公斤合著)可引起轻度胃干扰和“温和的洗涤”(27];然而,短期和长期的影响高水平DEHP是未知的。在这项研究中,所带来的影响幽门螺旋杆菌并确定了DEHP胃上皮细胞。我们发现DEHP幽门螺旋杆菌coexposure AGS细胞生存能力大于DEHP或下降幽门螺旋杆菌单(图1),表明曝光的总和幽门螺旋杆菌和DEHP添加剂对胃肠道上皮细胞的毒性,可能改变细胞增殖和细胞凋亡之间的比率。

细胞增殖和细胞凋亡之间的不平衡可能导致胃致癌作用。胃切除术患者的标本展出正常胃粘膜包含低表面上皮凋亡细胞的数量。凋亡数量明显增加的情况下,慢性胃炎和/或肠上皮化生(28]。增加细胞凋亡与胃癌的发展(29日]。对活检获得的TUNEL检测胃癌患者的胃粘膜也发现多个凋亡细胞(30.]。此外,它已被证明,增加的速度幽门螺旋杆菌- - - - - -诱导AGS细胞系凋亡是47.0%,正常胃上皮细胞系(GES-1),这是由北京理工大学癌症研究收集、113.0% (31日),流式细胞仪实验还显示在GES-1凋亡细胞的比例为10.2% ~ 27.6%幽门螺旋杆菌感染4小时(32,在AGS细胞凋亡的比例约为18%幽门螺旋杆菌感染6小时(33]。这些文章表明,正常胃上皮细胞比AGS细胞可能更敏感幽门螺旋杆菌和可能导致更高的比率比AGS细胞后细胞凋亡幽门螺旋杆菌感染。因为细胞凋亡率增加可能的途径,与胃癌的发展(29日),幽门螺旋杆菌- - - - - -诱导致癌作用可能更明显比AGS细胞正常胃上皮细胞。在这项研究中,我们发现幽门螺旋杆菌和DEHP coexposure增加AGS细胞(图的DNA碎片2)。这个结果意味着幽门螺旋杆菌和DEHP coexposure可能诱导细胞凋亡和改变之间的平衡在胃上皮细胞细胞增殖和细胞死亡,破坏胃黏膜的完整性,促进胃致癌作用。此外,的比例幽门螺旋杆菌和DEHP coexposure高于幽门螺旋杆菌感染,进一步表明DEHP增强幽门螺旋杆菌- - - - - -诱导AGS细胞凋亡。已经表明,细胞凋亡与细胞亚种群的高增长率选择胃癌癌前病变和参与的恶性转化34),幽门螺旋杆菌第一类致癌物质,DEHP 2型b致癌物IARC分类(2000);此外,我们发现DEHP幽门螺旋杆菌接触AGS细胞凋亡增加。因此,DEHP和幽门螺旋杆菌- - - - - -诱导AGS细胞凋亡可能增加AGS细胞恶性转化。

前面的文章还透露,apoptosis-related蛋白表达在各种不同类型的胃癌癌前病变和可能涉及致癌作用和转移的过程中。bcl - 2蛋白表达增加胃癌变前的损伤和减少其表达式后恶性改变(34,35]。伯灵顿蛋白质表达调节病人的胃后癌前病变幽门螺旋杆菌感染(36]。伯灵顿蛋白质也是高度表达肠上皮化生地区附近的肿瘤和相关细胞凋亡的诱导(35]。伯灵顿蛋白质被发现高表达在胃癌病人的组织和肿瘤阶段(没有区别37]。综上所述,伯灵顿/ bcl - 2比癌细胞恶性改变后可能会增加。我们的结果表明,接触DEHP和相结合幽门螺旋杆菌增加了伯灵顿/ bcl - 2的比例AGS细胞(图3),这个结果可能意味着DEHP,幽门螺旋杆菌曝光可能会诱发AGS细胞恶性变化。

细胞死亡包括两个独立的路径:内在和外在。的内在途径诱导的线粒体外膜的渗透率损失。线粒体外膜的渗透率损失导致细胞色素c的释放,apoptosome形成,procaspase-9激活。外在途径是由死细胞外配体结合,导致caspase-8的激活。内在和外在途径激活caspase-3和导致细胞凋亡38,39]。幽门螺旋杆菌据报道,引起胃上皮细胞凋亡通过外在通路的激活40];然而,在不同的研究中,幽门螺旋杆菌也报主要通过内在途径诱导细胞凋亡。Caspase-8激活似乎没有发挥重要作用幽门螺旋杆菌诱导细胞凋亡(41]。在这项研究中,DEHP幽门螺旋杆菌coexposure显著增加激活caspase-3 AGS细胞(图所示4),但caspase-8激活18小时后没有改变曝光(图5)。这个结果类似于之前回顾文章,表明DEHP或caspase-8不是必不可少的幽门螺旋杆菌- - - - - -诱导细胞凋亡,DEHP和幽门螺旋杆菌- - - - - -诱导细胞凋亡也可能由内在途径。此外,活跃caspase-3明显高于co-exposed DEHP和细胞中幽门螺旋杆菌比细胞暴露于DEHP或幽门螺旋杆菌一个人。这些结果平行的DNA碎片的研究,表明DEHP幽门螺旋杆菌coexposure有累加效应caspase-3激活和AGS细胞的凋亡。此外,caspase-3激活中扮演一个重要的角色在应激入侵42),高水平caspase-3表达在胃癌患者的组织样本显示不良预后与胃癌淋巴结转移相关(43]。caspase-3蛋白表达主要胃癌是高于胃转移性癌(44,45]。这项研究发现,DEHP和幽门螺旋杆菌暴露增加积极的表达形式的caspase-3 AGS细胞和诱导AGS细胞凋亡,这暗示DEHP和结果幽门螺旋杆菌可能增强应激能力入侵胃癌的能力。综上所述,这些数据不仅表明caspase-3可能扮演重要的角色在AGS细胞联合DEHP和诱导细胞凋亡幽门螺旋杆菌曝光,也意味着添加剂影响DEHP和后AGS细胞的恶性转化幽门螺旋杆菌曝光。

总之,本文报道,DEHP幽门螺旋杆菌coexposure可以调节伯灵顿和bcl - 2蛋白表达增加伯灵顿/ bcl - 2比,激活caspase-3蛋白质,增强AGS细胞凋亡。这些结果提供新的DEHP的carcinogenetic效果和信息幽门螺旋杆菌coexposure在胃上皮细胞,这可能进一步的研究,提出一个可能的机制,DEHP提高致癌作用,结合已知的致癌物。因此,有必要进一步研究DEHP和理解底层机制幽门螺旋杆菌可以在胃上皮细胞引起致癌作用和转移。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持由高雄医学大学医院(KMUH99-9 M68, KMUH100-0 M01), E-Da医院(EDAHP100012 EDAHP101021)、卓越为癌症研究中心授予(doh102 - td - c - 111 - 002),,台湾行政院卫生署。

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