文摘

检查胃肠激素的概要文件和功能性胃食管反流病(GERD)的变化,血orexigenic激素的水平测量与实验诱导GERD老鼠。在实验中,等离子体在GERD老鼠酰基胃促生长素水平高于sham-operated老鼠,虽然在GERD食物摄入量减少了老鼠。虽然等离子体抑制食欲的激素——瘦素水平显著降低在GERD老鼠,没有观察缩胆囊素水平变化。重复管理鼠胃促生长素GERD老鼠没有影响体重的减少或食物的摄入量。因此,这些结果表明,异常增加外围饥饿激素的分泌和减少胃促生长素反应可能发生在GERD的老鼠。神经肽Y和agouti-related肽mRNA表达GERD老鼠的下丘脑显著增加,而proopiomelanocortin mRNA表达显著下降相比,在sham-operated老鼠。然而,melanin-concentrating激素(MCH)和prepro-orexin mRNA表达GERD老鼠的下丘脑是类似于sham-operated老鼠。这些结果表明,尽管GERD大鼠血浆胃促生长素水平更高,生长素信号在GERD老鼠可能抑制由于减少了妇幼保健和/或在下丘脑促食素的合成。

1。介绍

胃食管反流病(GERD)是当胃酸引起的流回食道,导致食管粘膜上皮的侵蚀。胃液分泌抑制剂,如质子泵抑制剂,可以减轻GERD症状(1]。此外,胃酸反流到食道典型吃(后增加2,尽管GERD患者有时抱怨恶心和食欲不振,胃酸反流到食道,导致GERD可能部分的数量和内容的食物造成的。有各种各样的周边和中央appetite-related激素参与控制食欲和饱足;胃促生长素分泌的胃和刺激食欲和胃肠蠕动3),而缩胆囊素(CCK)和瘦素分泌的食物摄入,抑制食欲(4,5]。由X /像细胞生长素分泌胃粘膜中发现,它与生长激素促分泌素受体结合(GHS-R)出席的迷走神经刺激摄食行为通过抑制饱腹感刺激通过CCK [6,7]。相比之下,瘦素是由脂肪细胞分泌,直接作用于下丘脑跨越血脑屏障,从而抑制食物摄取的欲望造成的饥饿激素(5]。直到目前为止,GERD患者appetite-related荷尔蒙的变化没有充分的特点。我们假设GERD的恶化可能由appetite-related激素的异常功能。作为第一步在GERD阐明appetite-related激素的参与中,我们研究了外围appetite-related肽的概要文件,关注胃促生长素水平和饥饿激素的变化响应能力。

2。材料和方法

2.1。动物

八周大的雄性Wistar鼠(克丽日本,东京,日本)在实验中使用。在测试期间,4 - 5个动物被安置在一个笼子里,被允许免费食物和水。动物之间的房间照亮07:00晚7:00,温度和湿度保持在恒定水平。所有的测试进行09:00 - 18:00,根据Tsumura实验动物伦理委员会的指导方针。

2.2。化学物质

鼠胃饥饿素得到肽研究所(日本大阪)和无菌生理盐水溶解在0.9%(大冢制药、日本东京)。

2.3。制备GERD的老鼠

GERD被Omura手术诱导的方法(8]。老鼠的食物24 h与乙醚麻醉。腹部开放使用2厘米upper-median腹部切口。胃和十二指肠的世间,前胃之间的边界和腺胃与1 - 0丝线缝合(写到简介:东京,日本)。切成2毫米宽18-Fr内导管(作秀的成分、东京、日本)是用于覆盖面积近幽门十二指肠,和一个5尼龙线(写到简介:东京、日本)被用来缝合和修复幽门浆膜表面。胃和十二指肠被放置到腹腔,随后关闭。Sham-operated老鼠第一laparotomized暴露他们的胃和十二指肠大约1分钟,然后腹腔被关闭。手术后,老鼠是一个额外的24小时禁食(导致共48 h)。GERD-induced动物被发现已经开发出器官粘连或脓肿或极端减肥或弱点被排除在实验。为了避免样本中显著减少,比老鼠sham-operated GERD-induced动物了。

2.4。测量体重和食物摄入量

老鼠被安置后单独GERD归纳。每日体重测量从手术的日子,每日食物摄入量,计算是餐前的之间的差异和餐后食物的重量,测量从手术后2天(第二天)。9天,老鼠的食物被剥夺了24小时,然后牺牲执行组织病理学评估食管。

2.5。组织病理学评价

经过24小时的空腹(第十天),老鼠通过乙醚麻醉下腹部腔静脉抽血,食道切除。如前所述(执行组织病理学评价9]。食道被打开了一个纵向切口和固定化橡胶板与昆虫针。整个食道被拍到,每张图片导入一个图像分析软件(WinROOF;Mitani公司(日本东京)。网站显示食管粘膜侵蚀被确定和他们的面积测量。

2.6。影响外源生长素在GERD老鼠

GERD-inducing手术期间,老鼠被戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(饲、东京、日本)和导管充满肝素生理盐水是固定在颈静脉。导管通过皮下注射,拿出从后面,当时覆盖着金属弹簧,以防止它被咬。手术后,老鼠被安置单独和一个额外的24小时禁食。从第二天,大鼠胃促生长素(3 nmol /鼠)是管理老鼠通过颈静脉6天每天一次。胃食道逆流及sham-operated的对照组老鼠注射生理盐水。每日体重测量从手术的日子,从手术后第二天每日食物摄入量。

2.7。测定血浆胃促生长素和Appetite-Related荷尔蒙

从下腹部腔静脉血液收集天3乙醚麻醉,手术后7和10。血浆样本获得如前所报道(10]。总之,血液被收集在一个包含EDTA-2Na管(Dojindo实验室、熊本、日本)和抑肽酶(Wako纯化学工业,大阪,日本)。血样立即离心机在4°C,和上层清液与1 mol / L盐酸酸化(1/10体积)。等离子体是储存在−80°C到测量。血浆胃促生长素水平测量使用积极的胃饥饿素酶联免疫试剂盒和Desacyl胃饥饿素酶联免疫试剂盒(日本东京三菱化学Medience)。血浆CCK水平测量与CCK环评工具包(美国凤凰制药,伯林盖姆,CA)使用nonacidified血浆样本以同样的方式获得的。血浆瘦素水平测定使用Bio-Plex悬浮阵列系统(美国BioRad实验室、大力神、CA) Bio-Plex Pro鼠糖尿病患者测定面板(BioRad实验室)。

2.8。RNA提取、逆转录和实时聚合酶链反应

收集血液样本后,胃和下丘脑立即切除在3天,7和10−80°C到测量和存储。组织是均质和总RNA提取使用RNeasy普世组织工具包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)。总RNA从每个样本稀释到100 ng /μL,允许反应5分钟在70°C,并立即在冰上冷却。一个整除的1μ克总RNA反向转录使用TaqMan逆转录试剂(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)根据制造商的协议。

定量聚合酶链反应(PCR)进行棱镜7900 ht序列检测系统(应用生物系统公司)使用PCR TaqMan普遍掌握混合(应用生物系统公司)。来弥补差异的总RNA添加到每个反应,mRNA表达规范化β肌动蛋白作为一种内源性表达的控制阈值周期()的值: 在哪里周期的数量达到了吗β肌动蛋白基因阈值和是周期的数量达到目标基因的阈值。的寡核苷酸引物和荧光探针用于TaqMan定量PCR是应用生物系统公司提供的:胞质β肌动蛋白,Rn00667869_m1;prepro-ghrelin Rn00572319_m1;GHS-R Rn00821417_m1;膜结合O酰基转移酶域包含4(胃促生长素O酰基转移酶;山羊),Rn02079102_s1;神经肽Y (NPY): Rn00561681_m1;agouti-related蛋白(AgRP): Rn01431703_g1;proopiomelanocortin (POMC): Rn00595020_m1;promelanin-concentrating激素(MCH): Rn00561766_g1;,Rn00565995_m1食欲素(prepro-orexin)。

2.9。统计分析

统计学意义是利用学生的检查t以及和被认为是具有统计学意义。数据被表示为的意思每组的扫描电镜。

3所示。结果

3.1。一般情况和组织学GERD老鼠

食道粘膜侵蚀显然是观察到的GERD老鼠10天(图1(一))。侵蚀网站在GERD老鼠的数量总面积毫米²。此外,这些老鼠的体重和食物摄入量明显减少与sham-operated老鼠(数字1 (b)和1 (c))。

3.2。在GERD大鼠血浆胃促生长素水平的变化

等离子体酰基和desacyl胃促生长素水平显著增加从第三天到第十天(数字2(一个)和2 (b);desacyl胃促生长素水平在10天:sham-operated,与GERD,fmol /毫升;)。

3.3。在GERD大鼠血浆瘦素和CCK水平

血浆瘦素水平显著降低10天(表1)。血浆CCK水平没有明显差异与GERD sham-operated老鼠。

3.4。饥饿激素的影响政府对体重和食物摄入量

GERD的老鼠的体重显著下降比sham-operated老鼠(图3(一个))。胃促生长素GERD老鼠重复管理没有影响体重减少。此外,没有每日食物摄入量差异GERD老鼠注射生理盐水和那些服用胃促生长素(图3 (b))。

3.5。胃的变化或在GERD大鼠下丘脑mRNA的表达

没有重大分歧prepro-ghrelin和GHS-R mRNA表达之间的胃在整个实验sham-operated和GERD老鼠(数字4(一)和4 (b))。相比之下,山羊mRNA表达GERD老鼠显著减少每天7到10(图4 (c))。GERD大鼠下丘脑NPY mRNA表达显著增加10天(图5(一个)),而AgRP mRNA表达显著增加从第三天(图5 (b))。相比之下,显著降低POMC mRNA表达在GERD老鼠从第七天(图5 (c))。此外,妇幼保健(图5 (d))和prepro-orexin(图5 (e))mRNA表达GERD老鼠保持不变的价格相比sham-operated老鼠。

4所示。讨论

尽管等离子酰基的迅速增加和desacyl胃促生长素水平在24小时禁食GERD老鼠,他们的食物摄入量和体重下降。重复管理酰基胃饥饿素不抑制减少食物摄入量和体重。下丘脑NPY / AgRP神经元活动,但不是妇幼保健或促食素神经元,显著增加。外围GERD大鼠胃促生长素信号被送到在下丘脑弓状核,但在下丘脑外侧区妇幼保健和促食素神经元(LH)可能没有被激活,导致抑制食物摄取。

胃促生长素是一个orexigenic主要在胃分泌(7]。胃饥饿素增加食物摄入量,抑制能量消耗(3,11]。在我们之前的研究中,我们使用GERD老鼠证明缺乏响应通过急性胃饥饿素丸管理(3 nmol /鼠)(12]。与sham-operated老鼠相比,GERD的生长激素分泌影响大鼠静脉注射酰基饥饿激素减少,管理和急性酰基胃促生长素不抑制食物摄入量的减少,胃排空,或者胃蠕动。重复管理酰基胃促生长素(3 nmol /鼠/天)GERD老鼠没有影响食物摄入量和体重在整个实验研究中。我们先前证明急性静脉管理酰基饥饿激素的剂量3 nmol /鼠sham-operated老鼠食物摄入量明显增加(12]。在正常大鼠,胃饥饿素的剂量管理1.5 nmol /老鼠也增加了食物摄入量显著(13]。食物摄入量与重复政府没有增加激素;因此,GERD老鼠可能需要更高剂量的外源性激素。

机制,外周血胃促生长素水平增加在GERD老鼠还不是很清楚。没有关系的差异prepro-ghrelin或GHS-R mRNA表达在胃里sham-operated与GERD老鼠。造成这些结果并不增加胃促生长素合成的胃,不一定促进受体的合成,增加信号响应能力。此外,表达的基因编码山羊,这是一种酶,增加了一个辛酰proghrelin组,显著降低了。这个结果是按照发现山羊信使rna可能是消极监管长期禁食期间(14]。这可能是由于负面反馈由于丰富的酰基胃促生长素外周血中。因此,胃促生长素分泌生胃可能导致外周血胃促生长素水平高。

GHS-R G-protein-coupled受体,这些受体通常接受配体结合后去极化(15]。持续高企的GERD大鼠的血浆胃促生长素水平可能导致系统性GHS-R去极化。然而,在这项研究中我们发现,下丘脑NPY / AgRP mRNA表达显著增加从第三天GERD老鼠的价格相比sham-operated老鼠。胃促生长素结合GHS-R结束时胃迷走神经,刺激NPY / AgRP神经元出现在下丘脑弓状核,并增加NPY / AgRP mRNA表达(3,13]。因为NPY / AgRP mRNA表达在GERD老鼠增加,胃促生长素信号可能最大。瘦素抑制NPY / AgRP表达式,刺激POMC神经元,并产生POMC mRNA (16,17]。由于血浆瘦素只有在手术后10天检查,我们只能建议增加胃促生长素水平与血浆瘦素水平呈负相关。然而,除了增加血浆胃促生长素水平,降低血浆瘦素水平可能会导致增加NPY / AgRP和显著降低POMC mRNA表达GERD老鼠。

在这项研究中,prepro-orexin妇幼保健mRNA表达并没有改变在GERD老鼠。orexigenic信号,通过激活NPY / AgRP神经元,LH,传播导致促食素或妇幼保健神经元的激活18- - - - - -21]。促食素和妇幼保健主要是合成LH当这些神经元被激活。MCH-1R hypophagia肽对抗或损耗的结果,和MCH-1R-deficient老鼠精益22- - - - - -24]。众所周知,奖励系统,包括食欲或学习,是由这些神经元通过多巴胺神经元的激活(25,26在腹侧被盖区和伏隔核。我们推测促食素或妇幼保健神经元激活可能在GERD抑制老鼠,导致食物摄取的抑制。然而,详细的作用机制和因素的身份压制这些神经元的原因仍然未知。进一步的研究需要阐明促食素或妇幼保健神经元响应的原因。

目前,不存在GERD模型适当反映人类盖德。模型提出了在当前实验描述了一种粗放经营涉及的结扎前胃幽门区和修复的戒指,从人类GERD使它有很大的不同。此外,尽管这些初步结果,政府有效剂量的PPI (27)并不影响初始体重、食物摄取,或者胃促生长素浓度GERD老鼠。可以得出这样的结论:过度食道胃酸不参与增加生长素的分泌或异常食物intake-related系数表达式。此外,因为口服Cisapride明显改善胃排空在目前的模式12),治疗幽门区环和结扎不会引起不可逆转的减少胃蠕动。然而,广泛的手术会影响食物的可能性intake-related参数不能被排除在外。在这项研究中使用的GERD模型的有效性需要在未来充分验证。此外,物理障碍的影响和胃酸接触手术食品intake-related参数和激素水平需要仔细检查。

5。结论

GERD大鼠与正常大鼠相比,典型外围酰基胃促生长素水平增加,瘦素水平下降,可能会损害胃促生长素信号传输。然而,它仍然是必要的来验证模型的有效性,进一步检查细节关于PPI管理。

利益冲突

没有利益冲突与任何金融组织关于讨论的材料。

确认

h .武田接到Tsumura给予支持。m . Nahata y Saegusa, y Harada土屋n和t .服部年宏受雇于Tsumura。