多重PCR快速尿素酶试验中的检测比较幽门螺旋杆菌使用质子泵抑制剂的患者

摘要

背景。本研究旨在评估多重PCR检测的诊断价值幽门螺旋杆菌并进一步评估接受PPI治疗和未接受PPI治疗的患者的血清学阴性结果。方法。这项研究是一项回顾性队列研究，包括457名有消化不良症状的患者，他们从2003年6月到2007年10月在埃文斯顿和格伦布鲁克北岸医院接受了上腔镜检查。共有556份样本报告，其中一些患者在此期间进行了不止一次的检测。首先对胃标本进行CLOtest，从标本中分离DNA，进行一步多路PCR。结果。通过M-PCR测试,幽门螺旋杆菌在对照组274例中有143例(52.2%)，在282例接受PPI治疗的患者中有130例(46.1%)()。CLOtest检测到…的存在幽门螺旋杆菌同一组282例接受PPI治疗的患者中有4例(1.4%)，未接受PPI治疗的患者中有29例(10.6%)()。结论。我们的PCR足够灵敏，可以检测到幽门螺旋杆菌尽管是在PPI治疗。

1.目的

幽门螺杆菌（幽门螺旋杆菌)是一种螺旋形细菌，主要见于胃内1]。这种细菌在胃炎显著致病作用，胃癌，胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和消化性溃疡病[2]。世界卫生组织进行分类幽门螺旋杆菌作为第一类致癌物[3]。这是一个大问题，因为世界人口的大约一半被感染幽门螺旋杆菌[4]。

目前，有可用于识别重重考验幽门螺旋杆菌，但没有金标准。快速尿素酶试验（RUT）被广泛应用于临床检测的脲酶幽门螺旋杆菌胃粘膜活检。脲酶酶水解尿素成二氧化碳和氨允许幽门螺旋杆菌在酸性环境中生存[2，五]。人们普遍认为，酸还原的药物，特别是质子泵抑制剂（PPI），通过减少的量降低RUT，尿素呼吸试验，组织学，和粪便抗原检测的灵敏度和准确度幽门螺旋杆菌[6，7]。

质子泵抑制剂降低的活性幽门螺旋杆菌在胃内，并向近端转移分布。有人认为，PPIs抑制的生长幽门螺旋杆菌通过ph依赖机制。质子泵抑制剂在诊断试验中可能导致假阴性，在进行试验前至少应停止2-4周[8，9]。然而，这产生了一个问题，因为PPI的退出与症状的复发密切相关。而在PPI上，负车辙不足以排除感染。活检标本可能存在活细胞细菌密度低，结果为阴性。这成为一个问题，因为许多美国人正在服用这些药物。2009年，PPIs在美国的销量排名第三，在处方总数中排名第六[10]。在一些研究中，作者得出结论，PPIs降低了车辙和组织学检查的胃窦和身体活检的敏感性和特异性。聚合酶链反应(PCR)检测灵敏度更高幽门螺旋杆菌。Yakoob等。结果表明，PCR比患者服用质子泵抑制剂[RUT和组织学更敏感7，11，12]。但单基因PCR仍存在特异性不理想和误报的问题。减少酸药物给许多诊断测试带来的问题幽门螺旋杆菌，DNA，和当前的PCR方法测试对于1个或2个基因的突变率，我们开发了一种独特的多重PCR（M-PCR）检测5个独特的基因，提高了特异性。

在先前的研究中，我们进行了，我们独特的M-PCR准确地识别幽门螺旋杆菌相比RUT和免疫组织化学分析;除了标识的显著数幽门螺旋杆菌这将不是由前者方法[被检测感染13-15]。本研究的目的是确定质子泵抑制剂对RUT和M-PCR的结果的影响。我们推测，M-PCR将不会受到从质子泵抑制剂的生理变化而受到影响，由于M-PCR技术和DNA的稳定性的灵敏度。

2.方法

2.1。病人

这项研究是一个回顾性队列，包括457名有消化不良症状的患者，他们从2003年6月到2007年10月在Evanston和Glenbrook Northwestern医院接受了上腔镜检查。在胃窦和胃体进行活检。这项研究基于对图表的全面回顾被分为两组:第一组是PPI水平，而对照组至少四周没有PPI水平。服用H₂受体内窥镜前的过去的4个星期内拮抗剂和抗生素被排除在这两个群体。每位患者的知情同意，并研究审议并通过了埃文斯顿西北医疗保健机构审查委员会批准。

2.2。快速脲酶试验(凝血试验)

该CLOtest的快速尿素酶试验（金佰利，罗斯威尔，GA，USA）根据制造商的说明书上的所有标本胃首先执行。一个明确的洋红色被要求阅读测试为阳性。结果24小时后，20分钟后解释，然后。

2.3。多重PCR

读完CLOtest后，同样的标本被送到实验室分离DNA。然后进行一步M-PCR。评价M-PCR电泳凝胶的研究人员对结块结果不知情。M-PCR针对以下位点:0.86 kb DNA片段、脲酶A基因、16S核糖体RNA、26 kda蛋白抗原和hpaA基因。每个基因座选择一个正向引物、共同引物(FC)和两个反向引物(R1和R2)。R2引物位于R1的放大区域内。R1和R2引物分别与5个FC引物混合，分别置于FC-R1和FC-R2引物的两个单独扩增体系中(图)1)。共有10个DNA片段可被扩增，在2管，每个含有5个扩增子内部到另一个。对于M-PCR，我们定义了一个积极的情况下，幽门螺旋杆菌如果来自相同基因座中的10个片段的5个或两套DNA片段被因为细菌的DNA序列的高度多样性的扩增（图2）13-16]。在每一个M-PCR运行，正（菌株J99）和负（水空白）对照样品测定，以保证有一个参考，没有污染。每个M-PCR进行包含包含除胃组织所有反应组分以评估污染的阴性对照。此外，三个物理上独立的工作场所都设立了模板制备，PCR反应和PCR后分析，以避免污染。特殊的防回吸吸头和日常紫外线和酒精消毒使用。

2.4。统计分析

所使用的统计软件包是图InStat的版本3.10。通过使用Fisher精确检验，双尾进行统计分析。P小于0.05为显著性。

3.结果

在收集数据的时间跨度内，共有556个样本报告了一些患者进行了不止一次的检测。一项临床后记录回顾显示有282(50.7%)例患者在内镜检查前接受PPI检查至少四周。

有由M-PCR测试了两组之间没有差异。通过M-PCR检测，幽门螺旋杆菌在对照组274例中有143例(52.2%)，在282例接受PPI治疗的患者中有130例(46.1%)()。CLOtest检测到…的存在幽门螺旋杆菌同一组282例接受PPI治疗的患者中有4例(1.4%)，未接受PPI治疗的患者中有29例(10.6%)()。M-PCR确定幽门螺旋杆菌在34例病例中，33例(97.1%)1)。

在PPI和无PPI组中，CLOtest和M-PCR的检出率均有显著差异()。在523例病例中，M-PCR检测到241例(46.1%)血清学阴性。在PPI组中，278例中新增127例(45.7%)，对照组中新增114例(46.5%)。

4.结论

幽门螺旋杆菌是一种主要的人类病原体因为不同的影响幽门螺旋杆菌，需要一种准确的检测方法。目前，还没有一种方法足够灵敏和特异，可以被认为是“金标准”，所以我们不能使用一种标准进行比较;但使用的是在实践中普遍使用的，并被证明具有临床意义。我们开发了一种独特的多重PCR检测方法幽门螺旋杆菌在内镜活检标本。

本研究表明，PPIs影响幽门螺旋杆菌用CLOtest法检测，M-PCR法不检测。这是选择要检测的诊断测试时要考虑的一个重要因素幽门螺旋杆菌。另外，通过复查结晶体阴性结果的阳性病例增加了46.1%。因此,幽门螺旋杆菌使用现有方法的检测应该被仔细审查，特别是那些最近服用过PPIs的患者，以确保结果不是假阴性。CLOtest具有很高的特异性，但需要高密度的细菌来检测。M-PCR足够敏感，可以检测到幽门螺旋杆菌尽管一个人正在对PPI治疗。

在我们的研究中，M-PCR的高检出率可以归因于我们研究的患者群。我们只测试了有症状的患者，这是更有可能的感染;作为结果的数字将在这些类型的患者高。用于在检测率和低的检测率在RUT组之间的差异的另一种来源是来自的的圆球形式形成幽门螺旋杆菌。它可分为三个阶段:螺旋状、可活的球状体和退行性不可活的球状体。各种条件都可能诱发球虫形态，如PPI和某些抗生素[17]。有研究表明，蛋白质含量和遗传物质从螺旋到圆球形式在转换过程中保持不变。的圆球细胞的脲酶活性比螺旋形式下[18]。通过车辙鉴定球虫是困难的;然而，PCR方法被用来检测遗传物质，因为DNA保持完整。Can等的研究表明，由于未检测到突变，尿素基因区域的可靠性是由不同因素引起的[19]。之前的研究表明，我们的M-PCR能够检测到coccoid形式的DNA。球虫形态的毒性较弱，不易形成定植和诱发炎症。然而，它可能在感染中起作用，并被怀疑是抗菌治疗后感染复发的部分原因。当条件合适时，球虫形态可以恢复为螺旋形态，并可能恢复传染性[18]。

除上述药物外，我们不排除其他药物。任何增加pH值的药物或抗生素都会影响细菌的生长幽门螺旋杆菌从而可能影响结果。一个病人被CLOtest的测试呈阳性，而由M-PCR阴性。这可能有几个方面的原因差异;它可能是一个假阳性，其中CLOtest的是97％特异性或其中一个不同的脲酶生成酶的细菌或M-PCR未能检测到的细菌由于基因突变。在我们以前的研究中，所有的阳性患者免疫组化分析和CLOtest的人还通过胃标本[的M-PCR方法阳性13]。

我们的M-PCR阳性结果为46.1%，PPI阳性结果为52.2%，对照组阳性结果与我们之前的研究发现的52%的病例相似幽门螺旋杆菌和另外的40％从阴性结果。我们进行了一项双盲研究，相关的M-PCR的检测率炎症评分，免疫组化结果，并CLOtest的结果。该M-PCR和CLOtest的结果不是由一个独立病理学家谁检查的组织学特征闻名。该研究的结论是，在胃活检标本的平均活性和慢性炎症分数在PCR阳性比PCR阴性显著越大，表示存在幽门螺旋杆菌。在胃活检标本中，M-PCR检测到的幽门螺旋杆菌所有经免疫组织化学分析和/或血清学检测阳性病例[13]。

这项研究的结果和结论与那些由Yakoob等进行了一项先前的研究相一致。研究发现在检测率没有差异通过PCR，这是在PPI的组和对照组，74％和在胃窦75％之间。它也得出结论，既RUT和组织学的诊断率降低和PCR比两者更为敏感。在从胃窦活检的PPI组，在PCR 74％，在RUT 18％，并且在组织学50％阳性。此外，PPI组中附加68％，对照44％被发现通过PCR阳性。PCR的检测率较高相比，我们的研究，这可能是由于较小的研究人群，种族背景，或患者病情加重。此外，检出率会因他们的研究中使用的一个基因与使用5个基因研究我们其实更高。该研究的结论是，使用的酸降低药物相比，PCR和组织学[降低RUT的诊断率11]。在大多数涉及传统的PCR其他研究中，一个或两个基因进行鉴定幽门螺旋杆菌。从因为我们的M-PCR所有其他研究我们的M-PCR不同使用5个基因，因此是更具体的幽门螺旋杆菌。因此，很难将我们的M-PCR结果与传统PCR相关联。

检测微生物的使用PCR技术，包括幽门螺旋杆菌，都有很好的记录。传统PCR方法的潜在问题包括由于污染和不同物种之间的DNA序列同源而造成的假阳性。在我们的研究中，非ppi组的M-PCR和CLOtest存在较大差异，可能为假阳性[20]。用于M-PCR的引物在国家生物技术信息中心的基因库中被扫描，没有找到匹配的。还有M-PCR幽门螺旋杆菌物对19种细菌测试（大肠杆菌，产气肠杆菌，阴沟肠杆菌，肠球菌物种,Viridians组，铜绿假单胞菌、沙雷氏菌属物种,肺炎克雷伯菌，MRSA，乳酸菌物种,枸橼酸物种,脆弱拟杆菌(ATCC25285)、司理Wolinella succinogenes (ATCC29543)、空肠弯曲杆菌(ATCC33291)、幽门螺杆菌(ATCC52802)、幽门螺杆菌(ATCC35683)、幽门螺杆菌物种(ATCC35683)、heilmannii幽门螺杆菌(ATCC49286)和felis幽门螺杆菌(ATCC49179)））。19种菌均未发现标准幽门螺旋杆菌M-PCR带模式。还有一个内部控制，以防止误报。我们的M-PCR可以同时扩增10个DNA片段，也可以扩增5个基因座各自产生的2个片段，一个在内部，另一个在内部。我们的一步多巢式PCR的内部控制用于排除引物结合位点不同物种间DNA序列同源导致的假阳性，使M-PCR比传统PCR更具特异性。如前所述，我们通过研究验证了M-PCR检测结果，结果显示M-PCR阳性结果显示平均活性和慢性炎症评分显著提高。

非ppi组车辙检出率较低。这可能归因于我们没有排除的其他降酸药物，如铋化合物或钙产品。虽然我们进行了全面的药物审查和调查，但患者可能没有透露全部信息。我们的检出率低于其他研究，但其他研究的检出率也很低[11，12]。

总的来说，M-PCR检测了241例阳性病例。如果病人的车辙呈阴性，我们的M-PCR已经证明在诊断中是有用的幽门螺旋杆菌进一步评估否定的结果，因为它不会受到酸降低药物。使用M-PCR的可推荐作为添加剂测试，以确认存在幽门螺旋杆菌在有负车辙的病人中此外，对于要求患者接受经验性治疗或维持治疗的临床医生，M-PCR检测可以用于患者不需要消除PPI。M-PCR检测发现了大量的幽门螺旋杆菌常规检测不出的感染，发现另外46.1%阳性病例。我们的M-PCR幽门螺旋杆菌将提高检出率，增加医疗干预的机会，并允许通过不受PPI影响的敏感和具体方法对患者进行治疗。我们在美国开发了一种可用于医生的M-PCR。

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