大肠杆菌- 赋予BMP-2作为结肠癌的化学预防策略：概念验证研究

摘要

结肠癌是一个严重的健康问题，迫切需要新的预防和治疗途径。通过转基因细菌传递具有抗癌活性的蛋白质提供了一种有趣的、潜在的特异性、经济和有效的方法。有趣的是，骨形态发生蛋白2 (BMP-2)在结肠中是一种重要和强大的肿瘤抑制因子，因此是一种有吸引力的候选蛋白，可通过转基因细菌传递。然而，还没有证据表明在细菌环境下产生BMP对结肠癌细胞有效。在这里，我们演示这种转换大肠杆菌用编码回肠来源的成熟人BMP-2的cDNA诱导有效的细胞凋亡在体外结直肠癌模型系统，而母体生物在这方面无效。此外，这些效果对与BMP抑制剂Noggin的分类术敏感。我们提出使用转基因细菌的预防和治疗结肠直肠癌是可行的。

1.介绍

骨形态发生蛋白(BMP)是大TGF-的成员之一β形态发生配体超家族。最初，BMP被认为是一种参与骨形成的形态发生蛋白，后来这种蛋白在胚胎发育过程中成为一种重要的信号中介，是所有三个胚层衍生物形态发生密码的关键组成部分[1］．BMP信号传导由内源细胞外蛋白（例如Noggin）拮抗，其结合BMP并因此限制了BMP信号的程度[2］．BMP与I型（BMPR1A，BMPR1B）和II型（BMPRII）丝氨酸苏氨酸激酶跨膜受体结合，并触发信号转导级联通过信号换能器的SMAD级联介导的信号转导级联。通过三种不同类别的Smad家族蛋白质进行信号传导：受体调节的Smads（Smad1,5和8），共置/扫描4（常见的Smad常见的介体），以及抑制酶（Smad 6和7，负Smad的监管机构）。最后，BMP-Smad途径通过Cotranscriptional Partners激活核中的直接或间接BMP靶基因（图1）[3.］．因此，BMP与细胞外基质蛋白形成复合物;因此，由于其强大的形态发生作用，其生物活动局限于局部生态位。

BMP-2在消化器官的胚胎发育中起着至关重要的作用，例如在胃腺的形成中[4.］．表达通过成年期维持，在那里它有助于在该持续再生器官中维持组织稳态[5.]，并且它的存在似乎是抑制转换所必需的在体内，例如,后幽门螺杆菌感染 [6.或在易患癌症的过渡区[7.].同样，结肠的特征也是BMP-2的高表达[6.那8.那9.]，信号传导组分的遗传丧失与散发性癌症的发展密切相关[10.那11.]及遗传性息肉病综合症，特别是幼年型息肉病[12.在胃癌和大肠癌中，BMP-2启动子的甲基化也是一个常见事件[13.］．特别重要的是，他汀类药物对结直肠癌发展的预防措施是通过BMP途径介导的[14.]，产生表观遗传重编程，减少结直肠癌细胞干性[15.那16.］．显然，在胃肠道的其他部分，BMP信号与癌症过程密切相关。BMP-2是再生肝中下调肝细胞增殖的负调控因子[17.]但在食道BMP-2中，生产可能实际上可以涉及诱导癌前病症的Barrett的食道[18.］．这些数据在一起表明BMP-2用作柱状肠中的强大肿瘤抑制剂，因此外源BMP-2的施加可用于调用癌细胞。同意BMP-2的这种应用，Wen等人。已证明BMP-2抑制细胞生长和诱导的正常和癌细胞细胞分化[19.］．

结肠癌是一种上皮癌，其由于不受控制的细胞增殖和细胞凋亡机制的失调而产生的显性癌症[20.]，其发病机制无疑与粘膜免疫学与微生物生态学的复杂相互作用有关[21.].结肠癌的常规治疗，如手术、放疗和化疗，其疗效有限，并导致严重的副作用。同样，当前的化学预防策略只能部分降低风险，而内镜筛查费用昂贵且不受患者欢迎。通过局部应用抗肿瘤药物的靶向治疗cer分子在癌症发展的早期诱导细胞凋亡显然是向前迈出的重要一步。从这个意义上说，口服基因工程细菌可能是一颗金枪弹，因为根据定义，它们限制了对粘膜的作用，并且生产和应用于患者的成本低廉[22.那23.］．这种策略的力量已经在各种临床前模型中得到了证实[24.-27.用免疫调节分子的生产进行调用粘膜炎症，并且这种对人类疾病策略的适用性令人信服地显示在临床试验中Lactococcus lactis产生白细胞介素-10治疗克罗恩病[28.］．然而，尚未调查用于预防或治疗早期癌症的适用性。然而，显然，结肠肿瘤抑制剂BMP-2的粘膜递送可以证明在这方面具有高度兴趣，但需要证明在细菌环境中产生的BMP能够抵消结肠癌细胞。BMP-2已由哺乳动物细胞培养物和植物中的活性形式产生[29.]。证明细菌产生的BMP-2对结肠癌细胞的疗效将是将转基因细菌应用于癌症预防的重要一步。在这里，我们表明BMP-2可以通过大肠杆菌这类细菌能以一种对诺金敏感的方式杀死癌细胞，为这一策略的原理提供了证据。

2.方法和材料

2.1.DLD-1培养

DLD细胞在37°C、95% O湿化条件下培养₂/ 5％CO₂的气氛。将附壁的DLD细胞按常规方法在含10%胎牛血清的RPMI中培养。

2.2。克隆人BMP-2

以正常人回肠引物5'ATTGCCGGCGACCCGCTGTCTTCTA ' 3和5'ATCGATGCGACACCCACAAC ' 3为引物，PCR扩增人BMP-2 cDNA序列。引物中包含搭配和ngomiv.限制将来克隆到l . lactis．整个PCR产物克隆到Topo pTris原核表达载体中并转化大肠杆菌k - 12株(图2)．新的质粒被命名为PTRISBMP-2。通过PCR完成克隆和转化的确认大肠杆菌用上述引物测定菌落中是否存在人BMP-2。接下来，进行限制性内切酶分析，使用砰你好,年龄I，确认将人BMP-2插入到pTrcHis TOPO TA表达载体中的正确方向。椎板在脊柱中正确方向的预期大小为291 bp，反向方向为1030 bp。随后对阳性菌落进行测序并检查阅读框是否正确。

２.３.BMP-2在大肠杆菌

这大肠杆菌用pTrisBMP-2转化的菌株K-12在含氨苄西林(50μ在37°C g / mL);当OD₆₀₀培养物达到0.6，通过向终浓度为1mm的终浓度诱导BMP-2的表达并培养2小时[30.］．

２.４.西方墨点法

BMP-2的表达是通过蛋白质印迹确认的[31.］．SDS-PAGE检测蛋白分子量为44 kDa。用于免疫检测，样品用SDS-PAGE分离，电转移到硝酸纤维素膜上。用含5%脱脂乳的PBS- t缓冲液(含0.05% Tween 20的PBS)阻断膜，然后与小鼠抗人BMP-2多克隆抗体(1:20 00)和兔抗his标签抗体(1:50 000)孵育2小时。用PBS-T缓冲液洗涤3次，然后用抗小鼠和抗兔的酶标二抗1:20 00稀释在PBS-T缓冲液中孵育1小时。用PBS-T缓冲液洗涤3次，表达蛋白用ECL + western blotting检测系统(Amersham)进行可视化。

2．5．DLD细胞与大肠杆菌Caspase活性测定

原核表达载体产生的BMP-2对癌细胞凋亡的影响实验如下:将BMP-2含载体培养过夜大肠杆菌被接种在LB-Brooth直到OD₆₀₀达到0.6并诱导1毫米IPTG。将诱导的细菌与汇合的DLD-1细胞培养物（用10％FCS）温育5小时。裂解细胞，使用Bio-rad DC蛋白质测定试剂盒（Bio-rad）估计蛋白质浓度。根据制造商的说明，使用荧光试剂盒（Promega）在细胞中测定Caspase-3活性。简而言之，通过Caspase-3切割含有DeVD（序列中的序列中的序列中的含有的含有DeVD（序列）。在胱天悬浮酶切割后，释放用于荧光素酶（氨基葡萄球菌素）的基材;这导致荧光素酶反应和发光信号的产生。等量的试剂和20体积 μg/mL处理后的DLD-1细胞的蛋白加入到96孔白壁板中，室温孵育1 h。每个样品的发光用平板读光度计测量[32.-35.］．

3.结果

3.1。施工Ptrisbmp-2

虽然通过转基因细菌将肿瘤抑制细胞因子传递给癌细胞来预防结直肠癌是一种很有吸引力的方法，但还没有证据表明这种细胞因子在细菌环境中产生时能够影响癌细胞。为了解决这一概念问题，我们从正常回肠的cDNA中扩增出人BMP-2基因。成功地将1088 bp的产物克隆到pTris中，获得了pTrisBMP-2载体，并通过PCR和限制性内切分析选择了正确定位的BMP-2基因载体。随后的序列分析显示，获得的BMP-2在正确的阅读框中，观察到3个突变，其中一个导致了氨基酸的变化。这种突变可能是由于Taq错误，或者是源于BMP-2基因的志愿者的获得性突变。获得的载体可以很好地用于原核转化，随后开始了一些实验，在一定程度上它也可以通过细菌产生BMP。

３．２．BMP-2表达大肠杆菌

小型培养（10 对pTrisBMP-2的阳性克隆进行IPTG诱导，以鉴定能够表达高水平重组蛋白的克隆。10个克隆显示出独特的表达 IPTG诱导后的kDa蛋白。BMP-2产量随着诱导持续时间平行增加。未经IPTG诱导，两个克隆未显示SDS-PAGE证实的该蛋白表达。使用抗BMP-2和抗His标记抗体通过western blot进一步证实BMP-2的表达（图3.)．我们的结论是，我们可以通过一个细菌载体有效地表达BMP-2，并且由此产生的细菌克隆将允许测试在这种细菌环境下产生的肿瘤抑制细胞因子是否具有抗癌活性。

3.3.细胞凋亡测定

大肠杆菌用DLD-1细胞与不同的时间段与DLD-1细胞一起获得菌落，然后使用Caspase-3活性作为假终点评估细菌对癌细胞上的细菌的潜在和结肠癌活性。重要的是，表达LacZ基因（我们假设是惰性的）的控制细菌不会引起结肠直肠癌培养物的标记细胞凋亡;因此细菌本身似乎没有在这方面进行重大活动。然而，结肠癌培养，与含有BMP-2基因的细菌共培养，显示出显著的caspase-3活性，证明了其有效的抗癌活性(图)4.)．虽然caspase-3在凋亡过程中是一个相对较晚的标记物，但在共培养5小时后，半胱氨酸蛋白酶的明显激活已经清晰可见。这种效应的特异性通过其对BMP特异性拮抗剂noggin的敏感性来证明(数据未显示)。我们的结论是，肿瘤抑制细胞因子可以通过原核生物产生，并在细菌环境中保持效力。因此，我们提出粘膜输送肿瘤抑制细胞因子是可行的。

4.讨论

利用IL-10表达的临床试验l . lactis对于克罗恩病的治疗证实，这种细菌代表了治疗激发蛋白粘膜释放的可行方法。这已经开辟了新的途径来探索和使用转基因细菌作为用于局部递送这种类型的靶分子的载体，因此避免了这种治疗剂全身施用时发生的不希望的副作用。这种方法是否也是可行的肿瘤抑制细胞因子仍然不清楚。特别是原核生物产生功能相关的这种分子的能力，以及这些分子是否会在细菌环境中递送到癌细胞时会保持功效，其仍未探明。在这里，我们显示大量的BMP-2表达大肠杆菌．此外，我们还报道了一种可能的方法，通过产生的重组BMP-2蛋白介导的凋亡诱导结肠癌细胞死亡大肠杆菌．近年来，对结肠癌发病机制的深入研究为结肠癌的治疗提供了新的靶点和策略。这些变化从新的化疗药物、治疗性抗体到信号转导中的小分子。成功的临床试验治疗IBD患者使用l . lactis产生IL-10现在打开了通过重组细菌口服治疗传递抗癌药物的窗口。因此，转基因细菌可能成为局部传递相关靶分子的载体，从而避免与全身给药相关的不良副作用。

BMP-2表达大肠杆菌与DLD-1细胞共培养时表现出明显的促凋亡作用。虽然大肠杆菌不具有与人相同的翻译后修饰系统，正常的肠道BMP-2产生载体，由该细菌产生的BMP-2，具有明显的生物活性，因此可以克服原核和真核蛋白加工的差异。近年来，人们发现了许多与癌症有关的信号通路介质，这些介质是癌症治疗的重要靶点。这些分子应该通过靶向肿瘤细胞而被特异性地传递到肿瘤细胞。基于这些要求，我们开发了重组人BMP-2分子。加入对BMP-2有拮抗作用的noggin可抑制细胞凋亡，进一步说明了其特异性。总计，我们的实验证明了治疗性蛋白的粘膜递送是可行的，并且获得的有希望的结果进一步鼓励了通过在表皮表达重组BMP-2来继续l . lactis这将是通过转基因细菌对抗结肠癌的下一步。

工具书类

1. B. Bragdon, O. Moseychuk, S. Saldanha, D. King, J. Julian, and a . Nohe，《骨形态发生蛋白:批判性评论》，细胞信号，卷。23，pp。609-620，2011。视图:出版商网站|谷歌学者
2. A.H.Reddi，“骨形态发生蛋白和同源结合蛋白在骨和软骨发育中的相互作用：Noggin，chordin和DAN，”关节炎研究，第3卷，第1期，第1-5页，2001年。视图:出版商网站|谷歌学者
3. J. C. Hardwick, L. L. Kodach, G. J. Offerhaus，和G. R. Van Den Brink，“结直肠癌中的骨形态发生蛋白信号”，自然评论癌症，第8卷，第2期10, pp. 806-812, 2008。视图:出版商网站|谷歌学者
4. 成田T.Narita，K.Saitoh，T.Kameda等人，“BMP是鸡胚胃腺形成所必需的：一项使用病毒诱导BMP-2和Noggin表达的研究，”发展，第127卷，第127期5，页981-988,2000。视图:谷歌学者
5. G.R.Van den Brink，J.C.H.Hardwick，G.N.J.Tytgat等人，“声波刺猬调节人和小鼠胃腺的形态发生，”胃肠病学号，第121卷。2，页317 - 328,2001。视图:谷歌学者
6. S. A. Bleuming, L. L. Kodach, M. J. Garcia Leon等人，“幽门螺杆菌感染的胃中骨形态发生蛋白信号的改变，”病理学杂志，卷。209，没有。2，pp。190-197,2006。视图:出版商网站|谷歌学者
7. S. A. Bleuming, X. C. He, L. L. Kodach等，“骨形态发生蛋白信号抑制小鼠胃上皮过渡区肿瘤的发生”，癌症研究，卷。67，没有。17，pp。8149-8155,2007。视图:出版商网站|谷歌学者
8. G. R.Van Den Brink，S.A. Bleuming，J.C.H. Hardwick等，“印度刺猬是结肠上皮细胞分化中的WNT信号传导的拮抗剂”自然遗传学，卷。36，不。3，pp。277-282,2004。视图:出版商网站|谷歌学者
9. J. C. H. Hardwick，G. R.Van Den Brink，S.A.Bleuming等，“骨形态发生蛋白2表示，并作用于结肠的成熟上皮细胞”胃肠病学第126卷第1期1，页111-121,2004。视图:出版商网站|谷歌学者
10. L. L. Kodach, E. Wiercinska, N. F. C. de Miranda等人，“骨形态发生蛋白途径在大多数散发性结肠直肠癌中失活，”胃肠病学，卷。134，不。5，pp。1332-1341,2008。视图:出版商网站|谷歌学者
11. L.L.Kodach，S. A. Bleuming，A. R. Musler等，“骨形态发生蛋白途径在人结肠腺瘤中活跃并在结肠直肠癌中灭活，”癌症，卷。112，没有。2，pp。300-306,2008。视图:出版商网站|谷歌学者
12. J. R. Howe，J.L.Bair，M.G. Sayed等，编码骨髓蛋白骨髓组织中骨形态发生蛋白受体1A的基因的“种系突变”，“自然遗传学第28卷第2期2，页184-187,2001。视图:出版商网站|谷歌学者
13. X. Z. Wen, Y. Akiyama, S. B. Baylin, Y. Yuasa，“通过甲基化在胃癌中骨形态发生蛋白2基因的表观遗传沉默”，致癌基因，第25卷，第18期，第2666-2673页，2006年。视图:出版商网站|谷歌学者
14. L. L. Kodach, S. A. Bleuming, M. P. Peppelenbosch, D. W. Hommes, G. R. van den Brink, and J. C. H. Hardwick，“他汀类药物在结直肠癌中的作用是通过骨形态发生蛋白途径介导的。”胃肠病学号，第133卷。4, pp. 1272-1281, 2007。视图:出版商网站|谷歌学者
15. R.J.Jacobs，L.L.Kodach和J. C. Hardwick，“潜在的单一的结肠直肠癌化学普通”，“目前的药物靶点，卷。12，不。13，pp。1903-1908，2011年。视图:谷歌学者
16. L.L.Kodach，R.J.Jacobs，P.W.Voorneveld等人，“他汀类药物通过骨形态发生蛋白途径增强结直肠癌细胞的化学敏感性，诱导表观遗传重编程并减少结直肠癌细胞的“干细胞”胆量，第60卷，第2期11, pp. 1544-1553, 2011。视图:出版商网站|谷歌学者
17. C. P. Xu，W.M.M.JI，G.R.Van Den Brink和M.P.P.Pepelenbosch，“骨形态发生蛋白-2是再生肝脏下调的肝细胞增殖的负调节因子”世界胃肠病学杂志，卷。12，不。47，pp。7621-7625,2006。视图:谷歌学者
18. F. Milano，J.W.P.M.Van Baal，N.S.Buttar等，“在食管炎中表达的骨形态发生蛋白4在食管鳞状细胞中诱导柱状表型”，“胃肠病学第132卷第1期7，页2412-2421,2007。视图:出版商网站|谷歌学者
19. X. Z. Wen, S. Miyake, Y. Akiyama, Y. Yuasa，“BMP-2调节正常和癌性胃细胞的增殖和分化，”生物化学和生物物理研究通信，卷。316，没有。1，pp。100-106,2004。视图:出版商网站|谷歌学者
20. R. Labianca, G. D. Beretta, B. Kildani et al，“结肠癌”，肿瘤学/血液学评论， vol. 74, pp. 106-133, 2010。视图:谷歌学者
21. N. H. Salzman，K. Hung，D. Haribhai等，“Enteric Defensins是肠道微生物生态的必需调节因素”，自然免疫学，第11卷，第5期。1, pp. 76-83, 2010。视图:出版商网站|谷歌学者
22. S. Yuvaraj，M.P.Pepelenbosch和N.A.Bos，“转基因丙蛋白作为药物递送系统：金子弹？”药物交付专家意见，第4卷，第1期，第1-3页，2007年。视图:出版商网站|谷歌学者
23. S. Yuvaraj，S. Lahham，R.K.R.R.Marmeddy等，“人体SCFV SIGA在乳酸乳球菌乳酸中表达为粘膜疾病的载体，”分子营养与食品研究号，第52卷。8，页913-920,2008。视图:出版商网站|谷歌学者
24. I. L. Huibregtse, V. Snoeck, A. de Creus等，“通过口服分泌卵蛋白的乳球菌诱导卵蛋白特异性耐受”，胃肠病学号，第133卷。2，页517-528,2007。视图:出版商网站|谷歌学者
25. I. L. Huibregtse, S. A. Zaat, M. L. Kapsenberg等人，“用于将人类白细胞介素-10输送到树突状细胞的转基因乳酸乳球菌”，胃肠病学研究与实践文章编号639291,2012。视图:出版商网站|谷歌学者
26. L. Steidler，W.Hans，L. Schotte等，“通过乳酸乳杆菌分泌白细胞介素-10的鼠结肠炎的”治疗“科学类第289卷，第289期。2 .中国科学院研究生院，2000。视图:出版商网站|谷歌学者
27. K. Vandenbroucke，W. Hans，J.Van Huysse等，“通过转基因乳乳球菌乳酸菌的Trefoil因素的主动传递预防并愈合小鼠的急性结肠炎”胃肠病学，第127卷，第127期2，pp。502-513,2004。视图:出版商网站|谷歌学者
28. H. Braat, P. Rottiers, D. W. Hommes等人，“在克罗恩病中表达白细胞介素-10的转基因细菌的I期试验，”临床胃肠病学和肝病学，第4卷，第4期。6，第754-759页，2006。视图:出版商网站|谷歌学者
29. 高玉华、杨丽英，“成釉细胞瘤中骨形态发生蛋白基因的原位杂交和免疫组化检测”，中华一学杂志，卷。74，没有。10，pp。621-647，1994。视图:谷歌学者
30. T. Ritritema，A. M. Gehring，A. R. Stuitje等，“酰基载体蛋白的嵌合嵌合体的功能分析表明了蛋白质识别的专业领域”分子和一般遗传学，卷。257，不。6，pp。641-648,998。视图:出版商网站|谷歌学者
31. H. H. Versteeg, B. B. Sørensen, S. H. Slofstra等，“via /组织因子相互作用导致组织因子胞浆结构域独立的蛋白合成激活，p70和p90 S6激酶磷酸化，”生物化学杂志第277期30, pp. 27065-27072, 2002。视图:出版商网站|谷歌学者
32. J. E.J.Guikema，E.Vellenga，W.H.Abdulahad，S. Hovenga和N.A.Bos，“博士”CD27-触发对原发性血浆细胞白血病细胞具有抗凋亡作用，涉及丝裂原激活的蛋白激酶“英国血液学杂志，第124卷，第3期，第299-308页，2004年。视图:出版商网站|谷歌学者
33. M. P. Peppelenbosch和S. J. H. Van Deventer，《T细胞凋亡与炎症性肠病》，胆量，卷。53，不。11，PP。1556-1558,2004。视图:出版商网站|谷歌学者
34. A. C. S. de Souza，L.Kodach，F. R.Gadelha等，“核黄素作为白血病细胞死亡的介质的有希望的作用”细胞凋亡，第11卷，第5期。10，页1761 - 1771,2006。视图:出版商网站|谷歌学者
35. L. L. Kodach, C. L. Bos, N. Durán, M. P. Peppelenbosch, C. V. Ferreira，和J. C. H. Hardwick，“在人类结直肠癌细胞中，紫色素协同增加5-氟尿嘧啶细胞毒性，诱导凋亡和抑制akt介导的信号转导，”致癌物，卷。27，不。3，pp。508-516,2006。视图:出版商网站|谷歌学者

版权

版权所有©2012 Saravanan Yuvaraj等。这是一篇发布在创意公共归因许可证，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。