文摘

客观的。本研究调查的影响执行N-desulfated肝素在碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)表达、肿瘤血管生成和转移的胃癌。方法。orthotopically人胃癌sgc基地- 7901组织植入点头SCID小鼠的胃。二十小鼠被随机分为两组,分别接受了静脉注射0.9%的氯化钠溶液(生理盐水组)或10毫克/公斤N-desulfated肝素(N-desulfated肝素组)两次每周三个星期。体外,人胃癌sgc基地- 7901细胞治疗N-desulfated肝素在不同浓度(0.1毫克/毫升,1毫克/毫升,N-desulfated肝素组),并与介质(对照组)治疗。结果。体内,生理盐水组的肿瘤转移率是9/10和2/10 N-desulfated肝素组()。瘤内微血管密度在N-desulfated肝素生理盐水组高于集团()。bFGF的表达在胃癌组织中被N-desulfated抑制肝素()。没有出血N-desulfated肝素组。体外,N-desulfated肝素显著抑制bFGF蛋白和mRNA的表达胃癌细胞()。结论。N-desulfated肝素可以通过抑制肿瘤抑制胃癌的转移bFGF的表达与肿瘤血管生成没有明显的抗凝活性。

1。介绍

胃癌是我国常见的消化道癌症的发病率。这是一种恶性肿瘤,严重危害人们的健康具有高死亡率和缺乏有效的治疗方法。最近的研究表明,血管生成在肿瘤的生长和转移中扮演着关键角色。血管生成,新血管的过程开发从先前存在的血管,反对信号是由一个非常复杂的网络,在正常生理条件下,由各种高度管制引起血管生成刺激器和抑制剂1]。血管生成是肿瘤生长所必需的除了几毫米直径,因为肿瘤血管网络的要求提供氧气和营养和清除代谢废物。在肿瘤相关血管生成,血管生成刺激器和抑制剂的平衡倾向于血管生成的低氧诱导因子- 1基因表达(2]。抑制血管生成可以控制肿瘤转移和改善预后3- - - - - -6]。血管内皮生长因子(VEGF)和纤维母细胞生长因子2 (FGF-2)是促进血管生成的主要因素(7,8]。尽管VEGF是血管生成反应的主要中介,bFGF比VEGF更强有力的刺激血管内皮细胞有丝分裂发生。抗血管治疗是有效的抑制血管生成和转移的肿瘤(9,10]。高核心蛋白聚糖的硫酸肝素,被广泛用作抗凝药物很长一段时间。除了其抗凝作用,肝素结合各种生长因子、细胞因子和细胞外蛋白质,因此可以影响肿瘤细胞的迁移和血管生成在肿瘤。肝素的潜在抗癌活动支持来自体外的数据和实验研究11]。史蒂文森等。12)报道,肝素主要是减少转移性疾病通过抑制P -和L-selectin交互。然而,临床使用肝素治疗的肿瘤局限于其强劲的抗凝活性,这可能会导致严重的出血并发症。化学改性肝素显示了显著降低抗凝与FGF交互活动和增强能力,VEGF,和肝细胞生长因子促进血管生成(13]。在这项研究中,我们调查的影响N-desulfated肝素bFGF的表达,体外和体内血管生成和肿瘤转移。

2。材料和方法

2.1。材料

山羊反CD34抗体和山羊反bFGF抗体来自圣克鲁兹Biotechnical公司。bFGF实时PCR探针是由中山大学她女儿基因公司提供。人胃腺癌国网公司- 7901细胞株细胞生物学研究所获得中国科学院上海。

2.2。胃癌细胞培养

人类胃癌sgc基地- 7901细胞保持rpmi - 1640年补充10%胎牛血清的边后卫,37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司₂。人类胃癌sgc基地- 7901细胞悬浮在一个3×10的浓度⁶/ 10毫升。不同浓度(0.1毫克/毫升,1毫克/毫升)N-desulfated肝素和介质添加到细胞中。细胞在12 h和24 h后收获。细胞被洗一次PBS和刮洗缓冲区。这些细胞被洗的缓冲区,均质在150年μL细胞裂解缓冲,孵化冰30分钟。,并将回收的上层清液snap-frozen在液氮和存储−80°C。

2.3。酶联免疫吸附试验

一96 - microwell板(Nunc、Kamstrup、丹麦)涂上了100μL 1: 4000稀释净化IgY-anti bFGF在碳酸氢钠缓冲(pH值9.6)和孵化一夜之间在4°C。包含0.05%的板与PBS洗两次补间20 (PBST),和100年μL的重组bFGF-p24补充道,稀释1:100年5 g / L pluripeptone, 3 g / L肉膏含有0.05%渐变20 (PMET)。孵化进行120分钟的37°C。microwell板洗四次PBST和孵化在37°C与100年60分钟μL对p24 (VMRD)单克隆抗体,在PMET稀释1:2000。盘子洗了四次PBST和孵化与100年60分钟37°Cμ在PBST L anti-mouse-peroxidase稀释1:4000。板又洗了PBS和与90年发现的μL (tetramethylbenzidine(三甲)5 ~ 10分钟37°C。反应停在增加30μL 2摩尔/ L H₂SO4。光密度值(OD)测量的波长492纳米。每个试验进行了三次,平均结果计算,使用提升软件Multiskan读者。

2.4。动物模型

男性点头重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠获得中国科学院上海实验动物中心。动物实验过程进行按照相对伦理规定的实验动物保健和使用我们的大学。动物使用6周大,体重20 - 25 g。人类胃癌sgc基地- 7901(上海癌症研究所),低分化腺癌行,最初来自原发肿瘤和维护通道的裸体小鼠的皮下组织。动物模型是用原位植入人类胃癌组织学上完整的组织(14]。无菌切除肿瘤。坏死组织被削减,剩下的健康的肿瘤组织是剪刀绞成碎片(直径约5毫米×7毫米)在汉克的平衡盐溶液。每个肿瘤称重和调整是150毫克。小鼠麻醉trichloraldehyde水合物为4.3%。通过了一个口子左上腹pararectal线。然后,腹腔仔细暴露,浆膜膜的一部分中间的大曲率的胃机械受伤使用剪刀。150毫克的肿瘤块固定在每个受伤的浆膜表面的网站。胃是返回到腹腔,腹壁和皮肤被关闭。后转移模型,小鼠随机分为N-desulfated肝素组()和生理盐水组()。手术后一周,老鼠N-desulfated肝素组输液注射N-desulfated肝素(中国科学院上海细胞生物学研究所,10毫克/公斤·d)为3周每周两次。生理盐水组的小鼠静脉输液注射生理盐水(100μL)每周两次为3周。老鼠体重每周两次。

2.5。样本收集和病理检查

所有动物都牺牲在第6周后植入。通过腹壁被开一个切口,然后腹腔小心地暴露出来。肿瘤长在胃墙被移除和固定在10%福尔马林处理和常规石蜡包埋。组织所有器官和淋巴结收集和固定在10%福尔马林处理和常规石蜡包埋后仔细的宏观检验。Four-micron-thick部分被苏木精和伊红染色和评估组织学检查对肝转移或显微镜下淋巴结转移或其他器官转移。

2.6。意思是肿瘤微血管密度(MVD)

疣状进行了使用标记链霉亲和素生物素的方法。Four-micron-thick部分与分级酒精deparaffinized二甲苯和水化。进行免疫组织化学染色检测CD34表达后,制造商的协议。anti-CD34抗体的浓度是1:300。MVD(微血管cd34多)200倍显微镜下计算。魏德修改的方法被用于评估MVD根据CD34内皮细胞免疫染色。微血管计数,阳性染色的MVD 5血管最高的区域每个部分计入200×字段。MVD表达为平均微脉管计数的地区。

2.7。检测bFGF的表达

疣状进行了使用标记链霉亲和素生物素的方法。Four-micron-thick部分与分级酒精deparaffinized二甲苯和水化。进行免疫组织化学染色检测bFGF的表达后,制造商的协议。anti-bFGF抗体的浓度是1:60。阳性细胞在被定义为积极的+ 10%,10%以上为+ + +。积极表达被定义为积极+或+ + +。

2.8。检测bFGF mRNA的表达

bFGF引物和探针使用bFGF f: 5′-GTCACGGAAATACTCCAGTTG, bFGF r: 5′- CCGTTTTGGATCCGAGTTTATACT-3, bFGF调查:5′-TGTGGCACTGAAACGAACTGGG-3。bFGF信使rna分离试剂盒的方法。合成第一链cDNA进行逆转录装备,按照说明使用人类bFGF反义链引物和逆转录酶。在37°C 1 h孵化后,样本热灭活3分钟在95°C和保持在−80°C到使用。5整除μL (cDNA被放大在最后一卷50μL使用PCR缓冲1的存在μTaq DNA聚合酶和0.5 LμL bFGF的调查。样本被放大在93°C 2分钟,在93°C 0.5分钟,在55°C 1分钟紧随其后40周期。实时PCR进行自动实时PCR循环(美国ABI 7000)。

2.9。统计分析

所有数据都表示为平均数±标准差。学生的以及和精确的方法被用来确定不同群体的变化。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。抑制N-Desulfated肝素在人类胃癌的转移

所有小鼠局部肿瘤植入网站开发,低分化腺癌在显微镜。肿瘤生长的动物之间没有显著差异与生理盐水或N-desulfated肝素治疗。的10个动物生理盐水处理9发达区域淋巴结转移性肿瘤,肝8,6在其他器官。然而,老鼠N-desulfated肝素治疗后3周,显著的肿瘤转移抑制。的10个动物对待N-desulfated肝素2发达在肝转移性肿瘤。转移率高老鼠用生理盐水治疗比对待N-desulfated肝素(分别为90%和20%,)。N-desulfated肝素对身体的变化没有显著影响点头SCID小鼠。N-desulfated肝素组未发现出血并发症。

3.2。MVD N-Desulfated肝素的影响

在正常saline-treated老鼠,许多积极CD34染色血管在肿瘤广泛地分布和形成管状结构。然而,他们几乎没有N-desulfated heparin-treated老鼠。MVD显著降低在N-desulfated heparin-treated小鼠比正常小鼠saline-treated(4.7±1.8和9.1±3.4,)。

3.3。N-Desulfated肝素对bFGF蛋白表达的影响

在显微镜下,积极bFGF免疫染色发现肿瘤细胞的细胞质中。bFGF阳性表达率高于生理盐水组比N-desulfated肝素组(、表1)。

3.4。N-Desulfated肝素对bFGF mRNA表达点头SCID小鼠胃组织

bFGF mRNA表达NOD-SCID小鼠胃组织中检测到实时PCR在生理盐水组高于N-desulfated肝素组(ct值19.51±1.01和22.55±1.36,)。

3.5。N-Desulfated肝素对体外bFGF蛋白表达的影响

人类胃细胞的bFGF的表达显著增加随着时间的延长体外(12小时和24小时,)。0.1毫克/毫升或1毫克/毫升N-desulfated肝素12 h和24 h, bFGF的表达与对照组相比显著降低(表2,)。在0.1毫克/毫升,1毫克/毫升N-desulfated肝素组bFGF的表达显著降低在24 h比12 h ()。结果表明,N-desulfated肝素的抑制作用bFGF的表达人类胃癌细胞剂量和时间依赖性。

3.6。N-Desulfated肝素对bFGF的mRNA表达胃癌sgc基地- 7901细胞

在每个N-desulfated肝素组bFGF mRNA表达与对照组相比降低()。ct值越高意味着bFGF mRNA的低浓度。N-desulfated肝素的抑制作用bFGF mRNA的表达人类胃癌细胞体外与剂量相关。表3表明,ct值在0.1毫克/毫升N-desulfated肝素组高于对照组(),ct值高于1毫克/毫升N-desulfated肝素组相比,0.1毫克/毫升N-desulfated肝素组(),这表明它有剂量依赖性的影响。在同一个N-desulfated肝素浓度、bFGF mRNA的表达在24小时低于12 h (1毫克/毫升N-desulfated肝素组),这表明N-desulfated肝素的抑制bFGF mRNA的表达人类胃癌细胞有时间的影响(图1、表3,)。

4所示。讨论

肿瘤侵袭转移是一个多步骤的过程,促进癌症的扩散从遥远地方的主要网站。最近的研究表明,血管生成是固体肿瘤转移的一个关键决定因素,和抗血管新生治疗起着重要的作用在提高胃癌患者的预后15- - - - - -17]。VEGF是抗血管新生疗法的目标在一个大范围的疾病,包括癌症。作为新策略来生成nonanticoagulant抗血管新生的物质利用绑定VEGF同时防止受体参与,皮萨诺et al。18)评估了VEGF-antagonist活动产生的低分子量(流明瓦)化合物的解聚undersulfated glycol-split肝素衍生物。与肝素不同的是,它无法呈现125 i-vegf165高亲和性受体在内皮细胞和抑制VEGF165-induced新血管形成的小鸡胚胎绒毛膜尿囊的膜。因此,undersulfated流明瓦glycol-split肝素可能提供的基础设计新颖nonanticoagulant angiostatic化合物。此外,据报道,undersulfated和glycol-split肝素具有抗血管新生的活动。肝素结合bFGF和促进三元复合物的形成和内皮细胞表面受体,诱导血管生成反应(19]。修改后的肝素,N-desulfated肝素是已知更显著降低抗凝活性比O-desulfated肝素(1/76)肝素(5% - -30%的肝素)或对肝素(10%的肝素)20.]。然而,迄今为止没有报告N-desulfated肝素在肿瘤转移的影响。因此,N-desulfated肝素在肿瘤转移的影响,观察血管生成和bFGF的表达在人类胃癌原位移植的小鼠模型的组织。

在目前的研究中,肿瘤转移被N-desulfated肝素显著抑制。评估N-desulfated肝素对血管生成的影响,在肿瘤进行CD34免疫组织化学染色的。结果表明,N-desulfated肝素显著抑制这些肿瘤血管生成。李等人。21)生成方面或口服肝素使用低分子量肝素(LMWH)和脱氧胆酸可以有效地在胃肠道吸收,成为一个有吸引力的候选人作为抗血管新生治疗癌症的口服药物。肝素寡糖可能是一种生物活性的抑制剂在Caco-2 bFGF细胞(22]。Norrby [23)发现2.5 kDa, 5.0 kDa肝素片段可以专门抑制微脉管发芽和网络形成VEGF165-mediated哺乳动物的血管生成。小野et al。24)表明,periodate-treated nonanticoagulant heparin-carrying聚苯乙烯(NAC-HCPS)影响血管生成和抑制subcutaneous-induced肺肿瘤生长和转移。Mousa和默罕默德25演示了使用低分子肝素的抗血管新生活动,tinzaparin。Naggi et al。13)报道,对油菜和glycol-split肝素是潜在的抗血管新生和antimetastatic特工比普通肝素更有效,这表明N-desulfated肝素可以通过抑制血管生成抑制肿瘤转移。

bFGF广泛表达多肽生长因子,通常是隐藏在健康组织的细胞外基质(26]。它也表达了许多人类肿瘤细胞,包括前列腺癌、黑色素瘤细胞和被认为是重要的肿瘤血管的形成(27,28]。

在这项研究中,bFGF阳性表达率高于生理盐水组比N-desulfated肝素组和生理盐水组bFGF mRNA表达高于N-desulfated肝素组,证明N-desulfated肝素可以显著抑制肿瘤细胞的bFGF的表达。在体外,bFGF的表达人类胃细胞与时间的延长显著增加。肝素处理0.1或1毫克/毫升N-desulfated 12和24 h, bFGF的表达明显减少。此外,在每个N-desulfated肝素组,bFGF mRNA表达降低与对照组相比。bFGF mRNA表达1毫克/毫升N-desulfated肝素组低于0.1毫克/毫升N-desulfated肝素组。在同一个N-desulfated肝素浓度、bFGF mRNA的表达在24 h是低于12 h。因此,N-desulfated肝素的抑制bFGF mRNA表达人类胃癌细胞的剂量和时间的影响。结果表明N-desulfated肝素抑制肿瘤血管生成抑制bFGF的表达。

Sartippour et al。29日)得出的结论是,乳头流体bFGF水平逐渐升高在高风险和乳房癌与良性乳房。巴克莱et al。30.)发现,过度的bFGF mRNA相比肿瘤underexpressing bFGF肿瘤复发的风险显著增加。Hatziapostolou et al。31日)表明,bFGF多向性的生长因子,与前列腺癌的形成和发展。根据这项研究,他们发现外生bFGF显著增加人类前列腺癌LNCaP细胞增殖和迁移。肝素艾芬监管肽(竖琴)或pleiotrophin似乎是一个重要的中介bFGF刺激效应。bFGF,通过FGF受体(FGFRs)显著诱导竖琴由LNCaP细胞表达和分泌和增加荧光素酶报告基因载体携带的活动全身的竖琴基因的启动子。激活FGFR在LNCaP bFGF细胞导致NAD (P) H oxidase-dependent过氧化氢生产、磷酸化ERK1/2和p38 AP-1激活,竖琴,表达和分泌增加,最后,增加细胞增殖和迁移。Pardo et al。32]表明bFGF凋亡蛋白的表达增加,XIAP和Bcl-X(左)和触发在SCLC细胞化学抗性。他们发现这些影响是通过特定的形成包括b - raf multiprotein复杂,PKCepsilon, S6K2。在tetracycline-inducible系统中,增加S6K2激酶活性引发XIAP upregulation变化,Bcl-X (L)和prosurvival效果。赵et al。33)报道,测量等离子体等血管生成因子VEGF水平,bFGF, MMP-9晚期NSCLC有助于转移趋势预测和评价预后。VEGF mrna的表达、flt-1 flk-1, flg-1 bFGF(受体)分析了逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)和原位杂交(ISH) cRNA调查。VEGF、bFGF flt-1, flk-1免疫组织化学检测到肿瘤细胞中经营;染色强度比肝血管瘤(在经营34]。

在目前的研究中,出血N-desulfated从未观察到肝素治疗的老鼠,这表明N-desulfated肝素抗凝活性没有明显。总之,bFGF由肿瘤细胞是一种血管生成因子在人类癌症组织和肿瘤转移中起着重要的作用。N-desulfated肝素抑制肿瘤转移抑制bFGF的表达和血管生成。N-desulfated肝素可用于治疗肿瘤转移。

利益冲突

作者认为没有利益冲突。

承认

这项工作由上海自然科学基金的支持,没有。08年zr1411300。