转基因Lactococcus lactis对人白细胞介素10的递送至树突状细胞

摘要

白介素-10 (IL-10)通过编程树突状细胞(DCs)诱导抑制因子th细胞，在粘膜耐受中发挥不可或缺的作用。我们测试了的调制效果l . lactis分泌人IL-10（)对体外DC功能的影响。单核细胞来源的DC与孵育诱导效应t细胞明显抑制同种异体t细胞的增殖l . lactis。当DC显示增加CD83和CD86表达，只看到这抑制作用。此外，增强的IL-10生产在两个测定-衍生DC和th细胞比较l . lactis衍生的DC和Th细胞。DC-钍 - 细胞相互作用和共培养期间中和IL-10在transwell系统中，-来源的抑制性th细胞与异源性th细胞一起阻止了抑制性th细胞的诱导。在DC启动过程中，抑制th细胞的产生只需要130 pg/mL的细菌来源的IL-10和40倍于外源添加的重组人IL-10。食品级细菌在空间上限制IL-10的传递是诱导抑癌th细胞的一种有前途的策略在活的有机体内治疗炎症性疾病。

1.简介

胃肠粘膜免疫系统朝向非致病细菌耐受性和主动免疫朝向致病菌之间连续地平衡[1]。动物模型中已清楚地表明IL-10是在这种情况下为IL-10敲除小鼠发展成慢性肠道炎症和IL-10治疗的重要调节剂是有效的实验性结肠炎的几种模式[2- - - - - -4]。不幸的是，几次使用IL-10治疗炎症性肠病的临床尝试都失败了，这可能是因为低粘膜利用率和大剂量全身给予IL-10的促炎作用[5- - - - - -8]。人类IL-10的产生Lactococcus lactis(l . lactis^伊尔-10)可以规避这些问题。的确,l . lactis^伊尔-10在预防和治疗动物结肠炎方面是否有效l . lactis^伊尔-10对克罗恩病患者的临床益处[9]。树突状细胞(DC)是适应性免疫系统的调节器，控制外周耐受和免疫激活[10]。在没有致病微生物的情况下，DC通过微环境因子调节，诱导和维持肠道内的耐受性。这种体内平衡状态受到包括IL-10在内的细胞因子的严格控制[11]。用IL-10培养未成熟的DC会导致th细胞反应，这种反应以接触依赖的方式抑制同种异体th细胞的增殖，而这种方式不依赖于(抑制因子)th细胞产生IL-10 [12]。我们假设l . lactis^伊尔-10能够将未成熟的DC调节为调节性DC，进而诱导抑制性T细胞。

2.材料和方法

2.1。菌株

的一代的Lactococcus lactisMG1363 il - 10 (l . lactis^伊尔-10),Lactococcus lactisMG1363（l . lactis)，使用质粒pOTHY12 (Lothar Steidler, ActoGeniX，比利时)。质粒包含一个1kb的区域，包括组成部分thyA启动子（PthyA) from L. lactis MG1363, the usp45 secretion leader, hIL-10, and a 1 Kb region downstream ofthyA基因。这导致了铂的功能耦合hyA对usp45-hIL-10，前体的表达，前体的正确n端处理，以及成熟hIL-10的分泌。在优化在体外增长，l . lactisMG1363 pOTHY12将在其培养上清中产生约1μg hil10 / 2×10⁹细菌。产生负面控制(l . lactis),l . lactisMG1363用空质粒转化。都l . lactis^伊尔-10和l . lactis物在补充了0.5％葡萄糖和50在M17肉汤37℃（Elbanton培养箱）（Difco）中生长过夜 μ克/ mL琥乙红霉素（雅培，阿夫尔河畔圣雷米，法国）。Bacteria were diluted 1 : 50 in IMDM 5% FCS, grown for three hours at 37°C, and harvested at exponential growth phase (approximately 1 × 10⁷ cfu/mL).

2.2。产生和DC的成熟

所有的培养均在Iscove改良的Dulbecco 's培养基(IMDM)中进行，该培养基含有1%的FCS (HyClone, Logan, UT)和红霉素(50 mg/mL, Abbott)。如前所述，使用健康志愿者外周血产生未成熟DC [14]。在第6天添加1×10成熟⁵cfu细菌是否有成熟因子(MF)，重组人(rh)-IL-1β(5 ng / mL;德国勃林格曼海姆出版社)，rh-TNF-(25 ng / mL;PBH，汉诺威，德国)，LPS(西格玛)。4小时后收集50 mL上清检测细菌IL-10 (ELISA;和庆大霉素(86μ加入g/mL, Sigma)杀灭所有细菌。第8天，收获成熟的树胶，洗涤，DC在M17琼脂上培养，证实细菌杀灭完全。成熟的树突状细胞通过CD83和CD86表达或使用以下刺激之一来评估成熟:IFN-(P van der Meide博士赠送的礼物;和/或cd40l转染的J558浆细胞瘤细胞(英国伯明翰医学院P. Lane博士捐赠)。48小时后用上清液ELISA检测IL12p70 (R&D Systems，限检31.2 pg/mL)和IL-10 (CLB，限检31.2 pg/mL)的细胞因子。

2.3。成熟DC的t细胞指令

成熟直流(5×10)^3.细胞/ 200μL) 2.5×10孵育⁴纯化CD4⁺CD45RA⁺CD45RO⁻幼稚T细胞（>通过流式细胞术90％评估）使用MACS分离系统（美天旎，德国）从PBMC。当指示的大鼠抗人IL-10的中和IgG抗体₁(1 : 1000, BD Pharmingen, San Jose, Calif, USA) antibodies were added, purified rat IgG₁(BD Pharmingen)作为同型对照。可溶性小鼠抗人cd3和小鼠抗人cd28(均为CLB)进一步扩大和刺激th细胞。48小时后用上清液ELISA检测IFN-的细胞因子(R&D Systems, detection limit 31.2 pg/mL) and IL-10 (CLB). Moreover, expanded Th-cells were used in a Th-cell coculture model to assess suppressor function of DC-derived Th-cells [15]。简而言之，就是用CD4培养扩张(效应)的th细胞⁺(自体)T细胞和T细胞增殖使用细胞周期跟踪染料测定;细胞分裂导致分离细胞的荧光强度降低。同种异体T细胞与来自mf成熟DC的效应T细胞培养后的荧光强度为100%(参考条件)。

2.4。统计数据

对于细胞因子产生的比较，异方差学生t-test进行，而对于百分比，一个比较-进行百分比比较检验。当多组存在时，进行Kruskall-Wallis单向方差分析(SPSS, version 11.01, Chicago, Ill, USA)。统计学显著性定义为a，置信区间95%。

3.结果

3.1。l . lactis^{(il - 10)}使DC成熟，促进抑制T细胞的发育

树突状细胞在MF或带细菌的MF下成熟(l . lactis或l . lactis^伊尔-10)，并用于将初始th细胞分化为效应性th细胞。随后，分析产生的效应体th细胞在共培养模型中对th细胞增殖的影响[15]。以mf成熟DC的效应体th细胞培养后同种异体th细胞的荧光强度为100%(参考条件)。MF/产生效应性th细胞l . lactis-DC允许67%的同种异体th细胞增殖(图)1(一)），而通过MF产生的效应的Th细胞/l . lactis^伊尔-10-DC只允许42%的同种异体th细胞增殖(图)1(一))。从五个独立的实验的平均值增殖率为72％（)及42% ()l . lactis和l . lactis^伊尔-10分别，表明IL-10产生l . lactis明显改善效应细胞对同种异体th细胞增殖的抑制(图)1 (b))。

(一)

（b）中

(一)
（b）中

图1

⁵ l . lactis^{伊尔 -10} l . lactis ^{−5 4 +} 13 l . lactis^{伊尔 -10} l . lactis （a）中未成熟DC用无细菌成熟，1×10 cfu of viable或在曼氏面前。成熟的DC与幼稚的th细胞一起培养，诱导效应体th细胞收获，洗涤，3×10染色mpkh -26，一种红细胞循环跟踪染料。则为2.5×10在圆底96孔板中，用抗cd3(1:5 00)和抗cd28 (0.5 mg/mL)隔夜预活化效应细胞。第二天是异源性(CD4)用CFSE(一种绿色细胞周期跟踪染料)标记th细胞。5天后，流式细胞仪检测异源性th细胞中CFSE的细胞含量[]。所描绘的是同种异体的Th细胞在MF的存在刺激了细胞周期进程导出效应的Th细胞（白色柱状图，参考条件），并在MF的存在下培养同种异体的Th细胞/或MF /衍生效应th细胞(灰色直方图)。(b)示出的是在指示条件下，5个单独实验中异源性th细胞荧光强度的平均抑制。在有来自于msc成熟DC的效应细胞的情况下培养的同种异体th细胞的增殖被认为是100%(参考条件)。给出了具有平均标准误差的平均百分比;*表示和* *表示使用-比较百分比与参考条件(MF)的检验。

3.2。抑制器的诱导的Th-细胞由乳酸乳球菌^伊尔-10直流成熟依赖于直流完全成熟

DC成熟与l . lactis^伊尔-10在没有MF的情况下，平均荧光强度表达的CD83和CD86的表达略有增加。当MFs在成熟期添加时l . lactis^伊尔-10从直方图中可以看到CD83和CD86的强烈上调(图)2(一个))。与参考条件相比，直流在没有MF的情况下成熟，但存在l . lactis^伊尔-10-诱导的效应t细胞不能显著抑制原始t细胞增殖。而MF加在一起则相反l . lactis^伊尔-10在DC成熟过程中，这些DC能够诱导效应T细胞，有效地降低幼稚T细胞的增殖。因此，CD83和CD86表达降低l . lactis^伊尔-10成熟的DC显著降低了诱导效应th细胞的能力，从而抑制异源th细胞的增殖(图)2 (b))。

(一)

（b）中

(一)
（b）中

图2

⁵ l . lactis^{伊尔 -10 5} l . lactis^{伊尔 -10 5} l . lactis^{伊尔 -10} l . lactis^{伊尔 -10} l . lactis^{伊尔 -10} (a)未成熟的树突状细胞未成熟(灰色直方图)，成熟数为1×10cfu可行(连续线)，或MF和1×10成熟cfu可行（虚线）。CD83（左图）和CD86（右图）的表达48小时通过流式细胞术之后进行评估。（b）中未成熟DCs用MF底漆或1×10cfu可行有和没有MF。图中所示为同种异体th细胞与来自于msc成熟DC的效应体th细胞共培养的细胞周期进展情况(白色直方图，参考条件)，而同种异体th细胞与来自于msc成熟DC的效应体th细胞共培养的细胞周期进展情况(左面板)或/MF-(右图)成熟DC(灰色直方图)。

3.3。l . lactis^伊尔-10成熟DC产生IL-10，并诱导产生IL-10的Th-细胞

l . lactis^伊尔-10和l . lactis，与MF相结合，用于成熟直流。4h后用抗生素杀死细菌，48h后用CD40L或CD40L/IFN-重新刺激成熟的DCsγ分别评估IL-10、IL-12p70和IL-6的产量。DC成熟后产生IL-10 3200 pg/mL和1600 pg/mLl . lactis^伊尔-10和乳酸乳球菌，分别为(相比,l . lactis,图3(一个))。IL-12p70的生产(图3(一个))和IL-6(数据未显示)在两组间无显著差异。此外，IL-10和IFN-测量不同DC组诱导的效应t细胞的产量。直流熟化l . lactis^伊尔-10或l . lactis联合MF可诱导效应细胞产生2400pg /mL和700pg /mL IL-10 (相比,l . lactis,图3 (b))。IFN-的产生各组间差异无统计学意义(图3 (b))。最后，添加中和IL-10抗体在未成熟的DC与成熟l . lactis^伊尔-10显著逆转成熟DC细胞和效应th细胞产生IL-10 (相比，同种型对照，图3(一个)和3 (b))。

(一)

（b）中

(一)
（b）中

图3

⁵ l . lactis l . lactis^{伊尔 -10} l . lactis^{伊尔 -10} α l . lactis^{伊尔 -10} ₁ ⁴ μ γ t ⁵ l . lactis l . lactis^{伊尔 -10} l . lactis^{伊尔 -10} α l . lactis^{伊尔 -10} ₁ μ t (a)未成熟的DCs未成熟、MF成熟或1×10成熟 cfu of viable,,/-伊尔-10或/鼠免疫球蛋白在曼氏面前。48小时后收获成熟的树突状细胞，洗涤后再进行二次刺激(2×10)细胞在200年L)与转染CD40L的辐照杂交瘤细胞共48小时，以评估IL-10的产生或与IFN-联合使用到驴的IL-12p70的产生。给出了均值的标准误差;*表示和* *表示使用异方差的学生以及。(b)未成熟的DCs未成熟、MF成熟或1×10成熟 CFU of viable,,/-伊尔-10或/鼠免疫球蛋白在曼氏面前。成熟的DC细胞与未成熟的th细胞一起培养5天，将这些DC来源的th细胞洗净，用CD3/CD28重新刺激(100.000 cell/200)L, final concentration 1 : 1000) to assess IL-10 and IFN-生产。给出了均值的标准误差;* *表示使用异方差的学生以及。

3.4。IL-10对抑制因子th细胞的诱导很重要，但对其功能不重要

中和IL-10共培养l . lactis^伊尔-10-matured DC和幼稚的Th细胞完全消除了对同种异体的Th细胞增殖的效应的Th细胞的抑制效果（图4(一))。而在共培养过程中和IL-10l . lactis^伊尔-10衍生抑制的Th细胞和同种异体的Th细胞没有影响异体的Th细胞增殖的抑制作用（相比，MF，图4 (b))。同时,中和TGF -或CTLA-4共刺激不影响的抑制作用l . lactis^伊尔-10-来源抑制th细胞对异源性th细胞增殖的影响(相比，MF，图4 (b))。最后，压制l . lactis^伊尔-10通过物理分离抑制th细胞和同种异体th细胞，抑制th细胞在同种异体th细胞增殖中的作用完全消失(图)4 (b))。

(一)

（b）中

(一)
（b）中

图4

⁶ α （a）中所描绘的是与MF-衍生效应的Th细胞（白色柱状图，参考条件）和同种异体的Th细胞的共培养同种异体的Th细胞的细胞周期进程与效应的Th-细胞共培养时，没有加入-IL-10-伊尔-10),-伊尔-10在DC-naive t细胞(-伊尔-10 DC-T)共培养或il -10在效应t细胞和同种异体t细胞期间(-伊尔-10 T-T）共培养（灰色直方图）。（B）柱状图表示同种异体的Th细胞一式三份所指出的条件的荧光强度的平均抑制。与MF-成熟DC诱导的效应的Th-细胞共培养同种异体的Th细胞的增殖被认为是100％（基准状态）。对于Transwell实验，2×10pkh标记的测试细胞置于24孔板transwell系统的上室。给出了具有平均标准误差的平均百分比;* *表示使用-比较百分比与参考条件的检验(-伊尔-10 DC-T和转孔，RESP）。

3.5。有效地将细菌产生的IL-10输送到直流

数量为10⁵ cfu ofl . lactis^伊尔-10无DC时产生85 pg/mL IL-10(数据未显示)。4小时后，DC上清液与活菌一起培养l . lactis^伊尔-10MF含130 pg/mL(数据未显示)。增加重组人IL-10 (500 pg/mL, 5000 pg/mL，和50.000 pg/mL)在DC培养活菌l . lactisMF可将dc衍生效应细胞对同种异体th细胞增殖的抑制作用提高至67.5% ((MF)、46.5% ((MF)和48.5% (相比，MF），分别，（图5)。

图5

l . lactis 未成熟的直流启动MF/和增加重组人IL-10的数量(0、0.5、5和50 ng/mL)。柱状图表示的是在duplo条件下同种异体th细胞荧光强度的平均抑制。同种异体th细胞与来自于msc成熟DC的效应细胞共培养的增殖被认为是100%(参考条件)。给出了具有平均标准误差的平均百分比;*表示和* *表示使用-比较百分比与参考条件(MF)的检验。

4。讨论

The effective ability of DC to initiate different types of Th-cell responses makes this cell type an important target for innovative strategies requiring either polarized immunity (i.e., in vaccination or cancer) or tolerance (i.e., in chronic inflammatory, autoimmune, or allergic diseases) [16]。免疫调节细胞因子IL-10通过调节DC在诱导和维持粘膜耐受中发挥核心作用[1]。然而，在具有结肠炎人类IL-10处理时，由于低的粘膜可用性和促炎效应在较高剂量的令人失望IL-10 [7]。我们假设l . lactis^伊尔-10能够调节DC成为调节DC这反过来诱导抑制性T细胞。为了这个目标，我们培养可行l . lactis和l . lactis^伊尔-10在无DC和细菌的情况下，评估DC衍生效应细胞对异源性th细胞增殖的影响。我们观察到,l . lactis可以印出调控型DC表型，这在分泌IL-10时更为明显。最终抑制th细胞增殖的作用可能部分是由于固有的免疫调节作用l . lactis部分原因是由于在DC成熟过程中IL-10的存在。l . lactis与几种已知可诱导调节免疫反应的益生菌有许多同源性[15,17,18]。我们必须培养l . lactis^伊尔-10（临时）活以允许IL-10的产生和分泌。因此，分泌的细菌的因素也可能调制的成熟过程中，表型，和抑制DC的功能。IL-10的在我们的模型DC的灌注期间的免疫调节作用是根据与其他基团的结果[19,20]。有趣的是，低水平的IL-10产生l . lactis^伊尔-10在直流成熟期间，足以诱导调节性直流。l . lactis^伊尔-10在添加抗生素之前可以产生大约130 pg/mL的IL-10，我们需要高达5000 pg/mL的rh-IL-10才能产生类似的抑制作用。因此，在DC启动过程中，诱导抑制性th细胞需要大约40倍以上的IL-10，这表明空间受限的细菌IL10在诱导调节性DC方面比可溶性IL-10更有效。如果这种现象也正在发生，那将是很有趣的在活的有机体内如果其它因素，如跨越固有层和/或肠系膜淋巴结与DC上皮和物理接触细菌易位是必要的用于诱导这些抑制免疫应答[21]。

监管DC由感应l . lactis^伊尔-10的特点是完全成熟，较高的生产IL-10的，和低生产的IL-12p70和IL-6的。此外，IL-10需要抑制的Th细胞通过DC的感应而不是抑制的Th细胞的同种异体的Th细胞共培养时的抑制功能。IL-10生产的抑制的Th细胞的功能，不能从我们的实验推断，但它可能在外围对调控免疫反应通过反馈的持久性上的重要刚入未成熟DC在活的有机体内(22]。不幸的是，我们不能确定的驱动因素背后的抑制作用的th细胞诱导l . lactis^伊尔-10在T-T细胞相互作用期间。IL-10和TGF-β不参与效应t细胞对幼稚t细胞增殖的抑制作用。transwell实验表明，接触依赖因素很重要，但CTLA-4被阻断抗体排除。因此，其他接触依赖因子如ICAM-3和GITR可能在诱导的效应th细胞中发挥重要作用l . lactis^伊尔-10(15,23]。这是一个很有吸引力的想法，认为foxp3可能在诱导抑制th细胞中发挥重要作用l . lactis^伊尔-10-matured DC，但我们还没有能证明这种关系[24]。

综上所述，我们的数据表明，观察到的抗炎作用l . lactis^伊尔-10是通过调节直流功能来调节的。利用l . lactis用于递送的蛋白质具有几个优点，包括增加的粘膜可用性，易于给药，降低治疗剂量，和成本效益。这种策略可能是适用于炎症和感染性疾病的治疗[13,25,26]。

承认

作者感谢我们的实验室成员的有益讨论。MAS达席尔瓦被ALW格兰特＃81702002支付。

参考

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