参与胰腺癌肿瘤发展的微环境因素

抽象

介绍。尽管经过多年的深入研究，胰腺癌仍然是最致命的癌症之一。手术干预仍然是治疗的主要可能性，因为化疗和放疗对长期生存的影响很小。我们仍在寻找这种毁灭性疾病的弱点。材料和方法。收集了36例胰腺肿瘤组织标本。免疫组织化学染色评价生长因子的表达和免疫浸润。在7.5%的SDS-PAGE凝胶和0.1%的明胶上，通过明胶酶谱检测MMP2和MMP9的活性。结果。所有生长因子胰腺肿瘤组织中高表达。我们发现c-Met受体的表达这一水平是对G3的肿瘤比G2肿瘤高。此外，我们发现，积极MMP2出席，而活性MMP9只是在更先进的肿瘤肿瘤的所有阶段。丰富的免疫细胞浸润为鲜明的肿瘤组织，特别是巨噬细胞浸润的肿瘤组织。我们发现巨噬细胞的量与淋巴结转移有关。结论。在我们的研究表明，影响肿瘤微环境中的c-Met受体，巨噬细胞浸润和MMP2许多因素对胰腺癌的发展和侵袭显著的影响。

1.背景

尽管经过多年的深入研究，胰腺癌仍然是最致命的癌症之一。手术干预仍然是治疗的主要可能性，因为化疗和放疗对长期生存的影响很小。研究在过去的二十年里取得了很大的洞察胰腺癌生物学，但既没有改进的诊断方法，也没有治疗的方法。我们仍在寻找这种毁灭性疾病的弱点。

近年来研究表明，肿瘤微环境在肿瘤进展中起关键作用[1]。在胰腺肿瘤中，这种微环境是特别不均匀的。它由肿瘤细胞、星状细胞、浸润性炎症细胞和残存的胰腺正常结构组成。这些细胞是各种生长因子和促血管生成因子的来源。肿瘤组织中的成纤维细胞负责产生胶原和纤维连接蛋白，增加肿瘤的化学抵抗。由于肿瘤组织丰富，肿瘤环境缺氧[2,3.]。所有这些因素都导致了该病的侵袭性和早期转移的发生。

浸润性炎症细胞是影响肿瘤生长、侵袭和转移的丰富因素来源。巨噬细胞尤其值得关注。近年来对其在肿瘤环境中的作用进行了研究[4]。已知它们是EGF、PDGF-BB、HGF等刺激细胞增殖的生长因子的丰富来源α,TGF。此外，它们还产生基质金属蛋白酶-9（MMP9），其发生在各种基本过程的一部分[5]。

基质金属蛋白酶是一组20种蛋白酶，分为4个亚类:胶原酶、明胶酶、溶酶和膜型基质金属蛋白酶。它们参与细胞外基质的修饰，是血管生成、细胞迁移和转移形成等过程的重要组成部分。它们还参与许多蛋白质的激活，从而调节增殖和凋亡[6]。

mmp2和mmp9被归为明胶酶。它们在转移形成中的作用是重要的，因为它们的底物是IV型胶原，是基底膜的组成部分。它的降解使得癌细胞迁移成为可能。mmp2和mmp9在多种癌症中表达增加。对乳癌的影响[7它们的活性与远处转移有关，如果是食管癌，则侵袭性增加[8]。

在胰腺癌中也显示了MMPs的强表达。通过对6个细胞系的研究发现，MMP2表达和活性的增加与胰腺癌细胞的侵袭潜能增大有关[9]。

我们研究的目的是调查可能对肿瘤的发展的影响三点：生长因子，炎性细胞浸润的表达，和基质金属蛋白酶的酶活性，从而具有胰腺癌肿瘤的更完整的画面。

2.材料和方法

2.1。患者及标本采集

我们收集了36例因胰腺癌而行手术切除的患者的胰腺肿瘤组织样本。根据华沙医科大学生物伦理委员会批准的方案收集组织。根据TNM分期和肿瘤分级进行肿瘤分类。PDAC患者T1 - t4 (T1 ()、T2 ()、T3 ()，及T4 (N0)) ()、N1 (),M0 ()及M1 ()阶段。组织学分级也进行了评估:G1 (),G2 ()和G3 ()。

为了分离蛋白，样品被冷冻并保存在- 20℃，直到它们被使用。用于免疫组化分析的样本，尺寸为mm用干冰在丙酮中冷冻45秒，温度为- 70℃，储存温度为- 80℃。

2.2。凝胶Zymography

使用总蛋白提取试剂盒(Millipore, Billerica, USA)从肿瘤组织中分离蛋白。10μg从组织中分离的总蛋白用2份Zymogram样品缓冲液(Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA)稀释，用7.5%的SDS-PAGE(含0.1%的明胶)解析(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)。电泳后，凝胶用2.5% Triton X-100洗涤两次以去除SDS，时间为30分钟，然后在显影缓冲液(50 mM pH 7.5 TRIS缓冲液，5 mM CaCl)中孵育₂和0.2 M NaCl) for 20 h at 37°C. Gelatinase activity was visualized by staining the gels with 0.5% Comassie blue for 1 h followed by incubation in the destaining solution (methanol 40%, acetic acid 10%). Afterwards the destained gel was rinsed with water. For semiquantitative evaluation, a photo of gel was taken and MicroImage (Olympus, Japan) software was used.

2.3。免疫组织化学

胰腺癌的冷冻组织被冷冻成5μ米的部分。苏木精-伊红染色(H&E)。免疫染色采用Dako REAL EnVision检测系统、过氧化物酶/DAB+、兔/小鼠。室温干燥后，用丙酮固定10min。双内源性酶阻滞(Dako, Glostrup，丹麦)孵育5分钟。切片用适当的抗体孵育EGF (Z-19)、EGFR (EGF- r2)、PDGF-BB (N-30)和HGF 25分钟α(H-145)和c-Met (C-12)(均来自Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA)和CD68和CD3 (EBM11;F7.2.38, Dako, Glostrup，丹麦)。随后与Dako REAL EnVision/HRP孵育，兔/小鼠(ENV)在室温下孵育25分钟，使用Dako REAL DAB+ chromogen进行染色反应3分钟。幻灯片被梅耶的苏木精染色了。

2.4。免疫组化染色半定量分析

定量评估，低倍40x扫描肿瘤切片后，选择5个区域。使用MicroImage软件(奥林巴斯，日本)在200x放大率下分析这些场，计算总染色面积。

2.5。统计分析

比较两组的Mann-Whitney患者对三组进行Kruskal-Wallis检验。最低显著性水平定义为。

3.结果

3.1。胰腺癌的生长因子

25个肿瘤组织对肿瘤组织中的生长因子的表达免疫组织化学研究（图1)。所有病例均有生长因子的表达。EGF在癌细胞细胞质中的免疫反应性为弱至中度。对于EGFR，我们发现其在癌细胞细胞质中表达为中度到强表达，在小导管细胞中表达为弱表达。PDGF-BB的免疫反应性在癌细胞的细胞质中呈中到强，在6例中我们发现癌细胞和浸润性免疫细胞的核染色。HGF的膜质和细胞质染色α在肿瘤细胞中呈强染色，而c-Met呈中到强染色。

物针对肿瘤分级和N阶段相比的生长因子的表达。使用所有考虑的生长因子的表达的半定量估计，统计分析的结果表明，在G2和G3之间组表达的唯一的区别是在c-Met受体的情况下统计学相关（)(图2)。

3.2。炎症细胞浸润

我们使用抗CD68、HLA II、中性粒细胞弹性酶、CD3和CD56的单克隆抗体来评估细胞浸润。大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润。中性粒细胞弹性蛋白酶也有较强表达。未见NK细胞浸润。肿瘤腺体周围可见炎性细胞，癌细胞浸润的神经周围也可见炎性细胞(图)3.)。

我们比较了由于N档位的结果，我们发现，在肿瘤组织中的巨噬细胞的数目是该组中的显著高于转移到淋巴结（401）比在N0组（167）（)(图4)。

3.3。凝胶Zymography

研究了30株胰腺肿瘤组织分离物的基因溶解活性。活跃的MMP2 (62 kDa)占88%，活跃的MMP9 (83 kDa)占38%。对于6个样品，由于凝胶图像不清晰，我们不能测定MMP的活性。

根据组织学交易，我们可以告诉大家，对于G1肿瘤，我们没有观察到基质的活性的结果进行比较金属9.对于G2肿瘤活性MMP9在7存在（)，而G3只适用于4个()。有3宗G1个案声称出现活动MMP2 ()，所有病例为G2, 10例为G3 (z11)。

密度测量也证实，在分化良好的肿瘤中，基质金属蛋白酶的活性低于G2和G3 ()。MMP2活性分别为G1: 3。;G2: 16。;G3:2 ()。MMP9活性在G1组未见报道，其他组分别为G2组:;G3:。

4。讨论

在胰腺肿瘤中，我们观察到强烈的免疫细胞浸润。在胰腺癌中，之前有报道称巨噬细胞参与血管生成[10，支持肿瘤生长和癌细胞的侵袭。它们是血管生成因子如VEGF和降解细胞外基质的MMP9的来源。重要的事实是巨噬细胞可以抑制T细胞的反应。因此，巨噬细胞浸润胰腺肿瘤是产生转移的重要因素。我们发现淋巴结转移组巨噬细胞数量较高。这一观察结果支持了巨噬细胞参与转移的说法。

生长因子的丰富表达是胰腺癌组织的典型特征。由于它们参与受体酪氨酸激酶介导的信号通路，它们可能调节细胞的增殖、迁移和存活。以往对生长因子表达的研究提供了有趣的观察。有报道称，高水平的EGF和EGFR与淋巴结侵犯和远处转移以及中位生存降低有关[11]。只有血清中PDGF-BB水平高才有利于预后[12肿瘤中高表达与胰腺癌生长下降有关[13]。在我们的研究中，我们观察到生长因子的强表达;然而，只有c-Met受体，我们能够声称在G2组和G3组之间有统计学上的显著差异。在淋巴结转移方面未观察到显著差异。

我们的研究结果表明，c-Met的可能是胰腺癌的关键元素。这种受体酪氨酸激酶被激活肝细胞生长因子和生理学它在胚胎发育参与，并在肝再生的成年生活和伤口愈合[14]。但在胰腺癌中，甚至在癌变的早期也有过表达[15]。

c-Met的激活会导致增殖、活性增强和侵袭。因此我们推测，在G2和G3期c-Met表达的增加表明其具有更强侵袭性的表型，可能与上皮-间充质转化有关。EMT通常被认为是转移的第一步，因为它与E-cadherin表达减少和N-cadherin出现有关[16]。

另一个因素是有联系的淋巴结受累，存在的巨噬细胞，这也被我们的研究证实。我们的研究结果表明，巨噬细胞的量是用淋巴结转移的组中显著更高，因为它是以前报道[17]。最近有研究表明巨噬细胞也参与EMT过程[18]。它们不仅表达emt诱导的细胞因子，也表达切割E-cadherin/的MMP9连环蛋白复杂。Tan等认为巨噬细胞MMP9也通过破坏基底膜来支持EMT。这是癌细胞侵袭其他组织的一个重要机制。

我们对MMPs活性的分析表明，MMP2对胰腺癌的发展具有更大的影响。甚至在肿瘤的早期就可以观察到它的活性。而MMP9的活性仅在G2和G3组中观察到。此前有报道称，MMP2可以增强癌细胞的迁移能力[19]和胰液MMP2活性的测定被告知在诊断胰腺癌[是有用20.]。MMP9与转移和血管生成有关[21]。G1组缺乏活性可能提示其在肿瘤后期被触发。

五，结论

在我们的研究表明,在众多影响因素的肿瘤微环境c-Met受体,巨噬细胞浸润و和MMP2产生重大影响胰腺癌的发展和入侵。它们都可能与EMT有关，我们打算在进一步的研究中对此进行研究。

利益冲突

作者声明，他们没有利益冲突。

致谢

要感谢安娜Nasierowska-Guttmejer教授和博士这样Łącka肿瘤的组织病理学评价。本研究由国家科学和高等教育部批准文号资助开展。NN404/0693/33。

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