文摘

目的。氨基酸代谢在癌症患者与健康人。在这项研究中,我们进行了urine-free氨基酸的胃癌不同阶段和健康主题探索潜在生物标志物诊断或筛查胃癌。方法。四十三收集尿液样本从住院病人和健康的成年人被分成4组。健康的成年人在A组( ),早期胃癌住院病人在B组( ),和先进的胃癌住院病人在C组( );此外,两个健康成年人和三个高级胃癌住院病人在D组( 测试模型。我们进行尿氨基酸的每组采用离子色谱法(IC)技术和分析尿氨基酸根据氨基酸标准溶液色谱图。我们获得的数据处理与统计分析。诊断模型构建的区别从健康个体和另一个诊断胃癌临床分期的主成分分析模型。分化验证了性能曲线下的面积(AUC)接受者操作特征(ROC)曲线。结果。urine-free氨基酸的胃癌患者改变在某种程度上比健康的成年人。与健康的成年组相比,水平的缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸增加( ),但是组氨酸和蛋氨酸水平下降( )和天冬氨酸显著降低( )。尿氨基酸概要文件也不同的早期和晚期胃癌组之间。与早期胃癌相比,异亮氨酸和缬氨酸的水平减少高级胃癌( )。胃癌的诊断模型构造的AUC值为0.936 D组的测试显示,4样品可以配合。另一个诊断模型对临床分期的AUC值0.902测试3 D组的晚期胃癌住院病人显示所有可能与模型一致。结论。urine-free氨基酸概要文件之间的明显差异胃癌患者和健康成人表明,缬氨酸等氨基酸,异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、组氨酸和天冬氨酸是重要的代谢产物在细胞增殖和肿瘤的生长和转移过程中基因表达。研究表明urine-free氨基酸分析筛查或诊断胃癌的潜在价值。

1。介绍

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,全世界癌症死亡的第二个原因(1,2]。早期诊断是非常困难的,因为没有具体的症状在早期胃癌,和早期胃癌通常是小(3,4]。临床上,胃癌症大部分是确定当他们处于高级阶段。晚期胃癌有高死亡率的局部和远处转移是一个极大的危害人类的健康4- - - - - -8]。到目前为止,我们无法进行任何有效的因果预防因为胃癌的发病机理是没有定义9,10];因此,早期诊断或筛查胃癌是特别重要的。尽管内镜活检相结合是一个相当成熟的方法现在,诊断的速度仍依赖英国的经验和胃肠道病理学家(11,12]。东航等血清学的检测胃癌几乎没有诊断价值的特异性和敏感性较低(13- - - - - -15]。

氨基酸在人体包括外源性和内源性氨基酸。他们是依托遍布身体参与代谢,称为氨基酸代谢池。内源性氨基酸产生蛋白质降解的组织可以参与各种生理调整,如基因表达、细胞增殖和炎症反应。细胞增殖的速度快和繁荣的新陈代谢是恶性肿瘤的特征(16]。所以恶性细胞需要大量的氨基酸,氨基酸合成蛋白质和核酸代谢池。异常plasma-free氨基酸(PFAA)配置文件可能提出癌症蛋白质代谢的全反射肿瘤,癌症患者的骨骼肌和肝脏。一些研究表明,氨基酸代谢不一样在不同类型的恶性肿瘤。日本久保田公司等。17]研究PFAA浓度在58个癌症患者,包括22个乳腺癌、胃肠道癌症,24和12头颈癌。结果表明,7个氨基酸(谷氨酸盐、苏氨酸、组氨酸,半胱氨酸,丙氨酸,精氨酸,和鸟氨酸)与特定的癌症有密切的联系,表明PFAA概要文件与organ-site起源的三种不同的恶性肿瘤。减少gluconeogenic氨基酸被观察到在早期肿瘤生长在动物研究[18]。减少发生早在肿瘤细胞接种后6天,当肿瘤没有检测到。癌症的分期特征是肿瘤大小、深度的入侵和转移被认为是与PFAA概要文件(19]。

近年来,代谢组学作为系统生物学的一个分支发展迅速。现在,它已经建立了一个极其强大的分析工具,从而发现成功的应用在许多研究领域包括分子病理学和生理学、药物疗效和毒性基因的修改和功能基因组学、环境科学和疾病诊断(20.- - - - - -26]。代谢组学在肿瘤,可以应用各种先进的技术,如核磁共振(NMR)、高效液相色谱/质谱法(高效液相色谱/ MS和LC / MS / MS),傅里叶变换红外(FT / IR)光谱、气相色谱/质谱(GC / MS)检测和测量低分子量代谢物在动物和人类体液(血液、尿液等)27- - - - - -32]。代谢组学结合化学计量学可以揭示代谢变化在恶性肿瘤在临床研究和展示强大的值。

离子色谱法(IC)已被证明是一个优秀的metabonomic工具和应用在代谢物识别和量化基于其方便,灵敏度高,分辨率,峰值和再现性。在这项研究中,我们使用IC检测urine-free氨基酸的早期胃癌,晚期胃癌,健康的人。氨基酸在人体内进行相互依存的监管;比较单一的氨基酸浓度之间的病人和控制可能不足以说明氨基酸变化与癌症的发展。因此,三组的差异氨基酸概要文件以主成分分析(PCA)在目前的研究中。基于模式的结果,我们试图建立一个诊断模型从健康个体歧视胃癌临床分期和另一个诊断模型。

2。材料和方法

2.1。材料

所有标准和样品准备好了去离子水(Labconco,堪萨斯城,密苏里州,美国)。氢氧化钠(氢氧化钠)(50%,w / w)购买的费舍尔科学(美国NH汉普顿)。Omithine(≥99.5%),胱氨酸(≥99%),醋酸钠(≥98%)和氨基酸标准解决方案从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。亚精胺三盐酸化物(> 98%)和精胺tetrahydrochloride(≥99%)从Calbiochem购买(美国圣地亚哥,CA)。

2.2。样本收集和保存

二十6个住院病人,年龄在53至86年诊断出患有胃癌,是分类根据内镜检查加上组织病理学特点和阶段根据国际抗癌联盟第七版(UICC) TNM:阶段I和II(早期癌症),7例(女/男,3/4),53到86岁(平均年龄72岁);第三和第四阶段(到了晚期),19个病人(男性/女性,9/10),54至84岁(平均年龄76岁)。患者进入本研究样本集合之前并没有服用任何药物。所有患者的临床诊断和病理报告从医院得到。17名健康受试者(女/男,8/9),50到86岁(平均年龄68岁),被选中的一次例行体检包括内窥镜检查,与化疗和任何科目,肾脏疾病,内分泌障碍被排除在外。收集尿液样本在早上早餐前26胃癌患者和17名健康的志愿者在上海第六医院,上海交通大学医学院(上海,中国)。所有的病人和受试者汉族生活在中国和营养状况正常。协议是由上海第六医院的机构审查委员会批准,和所有参与者知情同意之前他们参与这项研究。在这项研究中,我们使用IC检测尿液游离氨基酸的胃癌和健康的人。研究urine-free氨基酸概要文件筛查或诊断胃癌特别是对早期胃癌,尿液样本分为3组。

2.3。离子色谱法

色谱系统由一个Dionex ics - 3000 Reagent-Free TM离子色谱仪(Dionex公司,桑尼维尔,美国)以dp - 3000双梯度泵,dc - 3000探测器室传导单元和一个电化学的电池,如- 3000洗脱液发生器与一个EluGen EGC II MSA盒,和一个autosampler。

氨基酸分离与AminoPac逃走PA10Pac CS18 ( 身份证,Dionex Corporation) analytical column and its respective guard column, CG18 ( 身份证)和0.25毫升/分钟的流量和恒温器的温度为30°C。csr超二(2 mm)、能够自我再生抑制操作在40 mA外部水模式被用于抑制电导检测。一个25μL进样体积是在整个实验过程中使用。操作反压力小于3000 psi。梯度洗脱条件由去离子水从0到42分钟,40毫米到200毫米从0到42分钟,氢氧化钠和400毫米到700毫米醋酸钠从18岁到42分钟。

2.4。统计分析

色谱峰面积归一化后,PCA分析了构建尿氨基酸代谢的胃癌患者和对照组的不同阶段。所有数据都表示为平均数±标准差。使用Wilcoxon等级和测试执行统计分析。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。色谱图22个氨基酸的标准解决方案

从图1,这是显示22个氨基酸都在40分钟有效分离。标准溶液的浓度是8μM。


图1
集成电路的22个氨基酸标准溶液色谱图:(1)精氨酸;(2)omithine;(3)赖氨酸;(4)谷氨酰胺;(5)天冬酰胺;(6)丙氨酸;(7)苏氨酸;(8)甘氨酸;(9)缬氨酸;(10)丝氨酸; (11) proline; (12) isoleucine; (13) leucine; (14) methionine; (15) histidine; (16) phenylalanine; (17) glutamic acid; (18) aspartic aid; (19) cysteine; (20) cystine; (21) tyrosine; (22) tryptophan.
3.2。总离子流色谱图对健康成人组和胃癌组

从数据可以看出2和3,尿液色谱的健康成人组和胃癌组IC的检测显示,总离子电流(TIC)峰的两组是不同的。在相同保留时间、峰值大小和峰高被不同组。


图2
总离子电流的一个正常的尿液。

图3
总离子流的胃癌住院病人的尿液。

集成电路分析之后,每个样本代表是抽搐,氨基酸的峰区域整合。我们每个尿样的22个氨基酸作定性分析色谱的色谱图22个氨基酸标准溶液,和每个化合物的峰面积比相应的内部标准被使用peaknet6软件计算的响应。使用Wilcoxon等级和测试执行统计分析。表1表明urine-free氨基酸的胃癌改变在某种程度上与健康成年受试者。与健康的成年组相比,水平的缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸增加( ),但组氨酸和蛋氨酸下降( )和天冬氨酸显著降低( )在胃癌患者。

表1
尿氨基酸的健康成年人组和胃癌组( (健康的成年组−胃癌组)/胃癌组)。

当我们比较尿氨基酸的早期胃癌晚期胃癌,缬氨酸水平降低了 在晚期胃癌和异亮氨酸水平显著下降 如表所示2。

表2
尿氨基酸的早期和晚期胃癌组( (早期胃癌组−晚期胃癌组)/高级胃癌组)。
3.3。模式识别

SPSS16.0软件用于PCA分析数据;PCA得分图显示不同的尿液样本(健康控制和胃癌组)被分散到两个不同的区域(图4)。ROC分析,使用的值取决于执行的第一个两个组件PCA模型,证实了PCA模型的鲁棒性。每个变量的敏感性和特异性的权衡进行了综述与曲线下的面积(AUC)。这个PCA模型的AUC值为0.936(图5),它演示了一个胃癌的好差值。


图4
PCA几十块urine-free氨基酸在健康成年人组和胃癌组(胃癌诊断模型)。

图5
中华民国为胃癌的诊断模型 。

我们根据PC1 PCA和PC2五个测试样本测试诊断胃癌(图模型6),我们可以看到两种情况正常的样品都是在正常的地区,这两例胃癌样品除了一例癌症地区胃癌的癌。


图6
PCA urine-free氨基酸的E组(胃癌诊断模型的测试结果)。

PCA也执行区分早期和晚期胃癌组。图7显示,大多数早期胃癌的尿液样本从晚期癌症样本中分离了出来。这也验证了ROC分析(PCA模型 ,图8)。


图7
PCA的尿液游离氨基酸在早期和晚期胃癌组(临床分期诊断模型)。

图8
中华民国为临床分期的诊断模型 。

没有早期胃癌样本测试样品,所以我们只需要3例晚期胃癌样本主成分分析(图9),我们可以看到,3例晚期胃癌样本都是晚期癌症地区。


图9
PCA的尿液游离氨基酸3晚期胃癌在E组(临床分期诊断模型的测试结果)。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们进行尿氨基酸代谢物轮廓识别标志。一些氨基酸差异表达在胃癌患者和对照组。胃癌的诊断模型由一个小规模的测试样本显示其潜在的临床诊断价值。高AUC值表明PCA模型健壮的歧视。胃癌分期的另一个诊断模型由小规模样本还测试了潜在的临床诊断价值。图7显示,一些早期胃癌样本位于晚期胃癌样本。癌症可以进步定量或定性,这些患者可能在中间阶段从早期胃癌晚期胃癌。

据报道,氨基酸代谢在癌细胞非常不安4,33),和尿氨基酸概要文件也改变了12,34- - - - - -36]。氨基酸代谢和糖质新生的增加的变化已经在癌症患者(有据可查35,36]。在目前的研究中,模型识别患者在胃癌的早期阶段和晚期胃癌,这表明尿氨基酸分析有助于胃癌的诊断。

结果表明,异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸水平的尿液胃癌患者明显高于正常对照组。作为恶性肿瘤迅速增长,他们需要大量的氨基酸代谢池为底物合成的蛋白质和核酸和其他物质。氨基酸的代谢身体肌肉组织的新陈代谢,总数的50%以上,支链氨基酸(BCAA)的分解代谢,如缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,主要参与骨骼肌。因此肿瘤组织对BCAA的高需求。许多实验表明,恶性肿瘤患者,包括胃癌,往往是高代谢。异亮氨酸是生成葡糖的生酮氨基酸分解成acetyl-coenzyme和succinate-coenzyme,柠檬酸循环的重要材料,被大大需要糖质新生(19),因此异亮氨酸的胃癌患者的水平高于正常组。大多数肿瘤细胞主要使用氨基酸产生更多的能量通过糖酵解而不是通过三羧酸氧化磷酸化(TCA)周期33,37]。缬氨酸是一种生成葡糖的氨基酸,亮氨酸是生酮氨基酸。所以,异亮氨酸的含量、亮氨酸和缬氨酸是重要的糖质新生的过程在癌症患者高。肿瘤细胞有一个活跃的核酸代谢,组氨酸是大幅absorbted进入肿瘤组织,和消费显著增加,导致其下降的身体。此外,特定氨基酸的代谢是与特定的器官,如肌肉,或肝脏和氨基酸含量的变化是影响身体的代谢器官。据报道一些氨基酸与特定癌症(17,38]。因此,分析血浆或尿液氨基酸可以检测特定器官的代谢改变,这可能是应用于早期癌症诊断。

从目前的研究中,患者的尿液中异亮氨酸和缬氨酸水平的早期胃癌略高于晚期胃癌。它可能是因为蛋白质在晚期癌症过度消耗,导致较低的缬氨酸水平比早期癌症组。Yamanaka等人提出了一个假设:障碍,肌肉组织蛋白质的增加提高了葡萄糖糖质新生在肝和增加了氧化BCAA的肌肉,这是BCAA的崛起的主要机制水平在早期胃癌的患者;肿瘤可以停止这个增加肌肉蛋白的进一步发展障碍,然后静脉BCAA和监管水平可能会下降。

总之,MS-based技术,如液相色谱/质谱(LC / MS)包括离子色谱及气相色谱/质谱(GC / MS),对许多疾病的诊断是非常重要的工具。在这项研究中,我们发现氨基酸平衡胃癌患者明显不同于健康人,也有先进早期胃癌及胃癌之间的区别。我们相信,离子色谱技术有巨大的潜力在早期诊断或筛查疾病尤其是胃癌和值得进一步评估和研究。

利益冲突

作者认为没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的关键项目上海科学技术委员会(09 jc1411600)和上海自然科学基金(08年zr1411300)。