胃食管反流病患者胆汁反流的组织学和免疫组化研究

抽象

介绍。GERD的发病机制与混合酸和胆汁反流密切相关。食管和胃的良、恶性病变与这些参数之间的协同活性有关。胆汁反流引起反应性胃病用胆汁反流指数(BRI)评估。目的是调查序列是否:胆汁reflux-intestinal metaplasia-GERD-esophagitis,与细胞凋亡/ oncogenetic紊乱有关。材料/方法。Fifteen asymptomatic subjects and 53 GERD patients underwent gastroscopy with biopsies. The specimens examined histologically and immunohistochemically for p53, Ki-67, Bax, and Bcl-2.结果。在47%(25/53)的GERD患者和13%(2/15)的对照组()。BRI(+)患者(14/25)明显比BRI(−)患者更常见()。免疫组化分析没有显示BRI评分和生物标志物表达之间的关联。结论。胆汁反流性胃病与GERD的严重程度有关，但与上消化道粘膜的癌基因表达或凋亡差异无关。

1.介绍

胃食管反流病(GERD)是最常见的胃肠疾病之一，尤其是在西方国家[1，2]。这是由于食管粘膜暴露于酸性胃液和/或含有胆汁的十二指肠反流，通过不正常的食管下括约肌。24小时的监测方法显示，胃食管反流病例的酸和胆汁暴露时间有很大的重叠，内镜下表现多样，从正常黏膜(非腐蚀性反流性疾病(NERD))到严重反流性食管炎、巴雷特食管，以及狭窄或溃疡等并发症[3-6]。

虽然在过去胃反流的发病机制与胃酸密切相关，但在过去二十年，混合反流的作用已得到越来越多的研究。酸和胆汁之间的协同活性在GERD的临床谱中有很大的体现，Bilitec 2000和多通道腔内阻抗等方法目前被广泛用于全面评估该病[7]。最高食管暴露于胆汁一直患者的Barrett不典型增生及食管腺癌被观察到。然而，它也与糜烂性食管炎，Barrett食管没有发育不良和胃窦部肠上皮化生有关[8-15]。

十二指肠内容物通过胃产生了一致的胃黏膜组织学变化(反应性胃病)，而胃窦上皮化生是最显著的组织学特征之一。胆汁反流与腺萎缩、慢性炎症、固有层水肿和中央凹增生的严重程度呈正相关。因此，一个组织学指标，即胆汁返流性指数（BRI分），推导出用于测量的在胃窦部黏膜[胆汁诱导的组织学变化的严重程度16]。

其中GERD的最严重的并发症是Barrett食管。它代表其中鳞状上皮细胞被包含杯状细胞化生肠状柱状上皮取代远端食管的癌前病变。细胞凋亡似乎维持食管组织稳态，这是由p53基因调节，并在Barrett食管的上皮化生，非典型增生，癌序列逐渐丧失[17]。同样，细胞凋亡也参与胃上皮的稳态和完整性，因为细胞凋亡的异常与萎缩性胃炎、消化性溃疡、肠上皮化生和胃恶性肿瘤等病变的发生有关[18]。

在之前的研究中，我们报道了GERD患者胆汁反流性胃病与更严重的疾病相关[19]。本研究的目的是探讨胆汁反流进入胃和食管是否与凋亡障碍和异常癌基因表达相关。为此，我们对生物标志物p53、Ki-67、Bax和Bcl-2的黏膜表达进行了免疫化学检测。

2.材料和方法

53例(42岁男性和11个女性,平均年龄33.3岁,范围18 - 76)至少12周总反流症状的持续时间和频率每周3次/每天四个小时在上个月,接受上消化道内镜(GI),在完成一个标准化的问卷与人口统计学和临床细节。

排除标准:(1)既往有前肠手术史;(2)非类固醇类抗炎或抗血小板药物治疗;(3)以前的历史幽门螺杆菌(h p。)根除;(4)门脉高压性胃病或胃食管静脉曲张;(5)毒物引起的腐蚀性食管炎;(6)酗酒;(7)硬皮病;(8)活动性溃疡病;(9)上消化道瘤变或克罗恩病;(10)系统使用PPIs。

标准完整上消化道内窥镜用由相同的内镜（A.科斯）12小时禁食时期之后，富士250 HR胃镜进行。Reflux oesophagitis was graded from A (least severe) to D (most severe), according to the Los Angeles classification system, whereas hiatal hernia was considered if gastric folds were extending ≥3 cm above the diaphragmatic hiatus. After detection of the lesions, two biopsies were taken from gastric antrum, two from gastric body and cardia, and two from the esophagus. The biopsies from the esophagus were taken from its lowest 5 cm, each specimen from the right and left esophageal wall, respectively. In case of erosions, biopsies were taken besides them. If Barrett’s esophagus was present, both columnar and squamous epithelium were biopsied. Control biopsies obtained from 15 healthy control (HC) subjects (9 men and 6 women, mean age 40.4 years, range 23–67) were without symptoms of GERD and no endoscopic evidence of erosive oesophagitis or Barrett’s. Nine of the healthy controls underwent endoscopy to exclude gastric pathology and the other 6 were healthy volunteers. Informed consent was obtained from each patient and healthy control volunteer, and the study was approved by the local research ethics committee.

所有活检标本用10%中性福尔马林固定至少3小时，处理，4小时切片μ米，并通过苏木精 - 曙红，阿尔新蓝/高碘酸 - 希夫（AB / PAS），和Giemsa染色。组织学检查，以更新的悉尼系统包括用于急，慢性炎症，水肿和萎缩的情况下进行调查，幽门螺旋杆菌状态、肠上皮化生、发育不良、BE。每项发现按0-3分(缺失、轻度、中度、标记、resp.)进行评分，根据公式计算胃腔活检中的BRI评分:(7水肿)+ (3IM) + (4chronic inflammation) − (6幽门螺旋杆菌)。胆汁反流指数大于14为异常，最能预测胃酸浓度升高[16]。

除了常规的组织学评价和BRI分数计算，四张幻灯片承载两部分，每个部分进行免疫组织化学检查p53的，Ki-67的和Bax和Bcl-2表达（Biogenex Laboratories公司，加州圣拉蒙，USA)。Bax和Bcl-2仅在柱状上皮，这意味着胃粘膜，Barrett食管，而P53和Ki-67在所有的标本检查进行了检查。根据染色的上皮细胞的百分比，所述免疫组织学切片进行评分和分级如下：没有染色,染色达5％，染色> 5%，染色> 10%，染色> 25％,染色> 51%。活检由一位经验丰富的胃肠病理学家(E. Sivridis)进行评估，但他并不知道该临床情况。

在统计分析中，连续数据以平均值表示，CI为95%，分类数据以比例表示。BRI评分>14的患者和HCs表现为胆汁返流的积极(BRI +)和BRI评分≤14 a胆汁反流负(BRI−)。在GERD患者中，首先比较两组在人口学资料、临床参数、内镜和组织学方面的差异。随后对两组的胃和食管黏膜的免疫组织化学特征的差异进行了评价。同时进行相关分析和logistic回归分析，以评估哪些人口学、临床、内镜或组织学参数对生物标志物在胃和食管黏膜的免疫组化表达的严重程度有显著影响。在这些分析中，我们假设免疫组化染色0 - 3级为0分，染色4-5级为1分。在HC组进行了类似的分析，并研究了GERD患者与HCs之间的差异。统计学显著性水平为。

3.结果

GERD患者和健康对照的人口学、临床、内镜和组织学数据见表1和2。47.1%(25/53)的GERD患者(胆汁反流阳性组)BRI评分升高(>14)，13.3%(2/15)的对照组(Fisher确切双尾检验);)。此外，GERD患者BMI较低的分数（表1），而胃炎，与健康对照（表的胆汁的存在进入胃，萎缩和肠溶化生是在GERD患者胃镜检查和组织学更常见2)。

BRI阳性和BRI阴性GERD患者的人口，临床，内窥镜和组织学数据列于表3和4。Overall, severe esophageal lesions (oesophagitis ≥ grade B and Barrett’s) were significantly more common in BRI (+) GERD patients (14/25) compared to BRI (−) (5/28) (56% versus 17.9%, respectively, Fisher’s exact two-tailed test;)。1例BRI (+) GERD患者同时观察Barrett食管和重度食管炎，2例仅观察Barrett食管，无食管炎。食管炎的组织学分类未被采用。在绝大多数病例中，炎症浸润是轻微的，与内镜表现无关。在一些对照病例中，它的出现也很少(数据未提供)。在Barrett食管患者中，所有病例的典型内镜表现均得到组织学证实。所有患者的上皮细胞均未发育不良。此外，18例GERD严重食管病变患者中有13例胆汁反流指数评分升高(72,2%)。

相反，免疫组织化学研究的结果没有在BRI阳性和BRI阴性GERD患者之间的差异。（ - ），我们在15个BRI（+）和21 BRI发现缺乏p53的染色在食管的病人，分1在9例BRI(+)和7例BRI(−)患者中，和分31例病人。对照组食管p53缺失或极低表达。食管粘膜p53表达在正常对照组和GERD患者，以及/或brim阳性和brim阴性患者之间无显著差异(图)1)。

在胃，大部分GERD患者没有p53染色(53例中47例;88.6%;BRI(+)患者21例，BRI(−)患者26例分153例(11.4%)GERD患者中的6例(≤5%)(4例BRI(+)和2例BRI(−)患者，resp.)。在对照组中，胃中也检测到p53缺失或极低表达。胃粘膜p53表达在正常对照组和GERD患者，以及/或brim阳性和brim阴性患者之间无显著差异(表)五)。

Ki-67的染色存在于食管上皮几乎在所有组织样品或者从BRI（+）或BRI（ - ）GERD的患者。然而，在大多数GERD患者中检测食管癌Ki-67的表达的低表达，因为它也与对照组中发生了。有在食管粘膜Ki-67的表达健康对照和GERD患者，和/或BRI阳性和BRI阴性受试者之间没有显著差异。

同样的，胃黏膜Ki-67在两组间表达相同。另一方面，在健康对照组中检测到低表达，但表达升高(分4在1健康BRI阳性受试者中检测到的Ki-67）的表达。一般情况下，有在健康对照和GERD患者之间食管粘膜Ki-67的表达没有差异显著，和/或BRI阳性和BRI阴性受试者（表6)。

促进细胞凋亡的生物标志物Bax在胃黏膜中过表达。然而，它不受BRI评分水平的影响。与预期的一样，在造血干细胞中也发现了Bax的表达增加。胃Bax表达在正常对照组和GERD患者、以及/或brim阳性和brim阴性患者之间无显著差异(图)1)。

另一方面，尽管67.9%(36/53)的GERD患者胃窦黏膜中缺乏抗凋亡因子Bcl-2，但其高表达(分5)与BRI水平无相关性(两组均表达相同)。此外，在对照组中检测到Bcl-2缺失或极低表达。胃Bcl-2表达在正常对照组和GERD患者、以及/或brim阳性和brim阴性患者之间无显著差异(图)2)。也没有发现的联系之间的存在幽门螺杆菌和胃粘膜生物标记物的表达(数据未显示)。

总体而言，相关和回归分析没有发现关于在胃和食管粘膜免疫组织化学研究结果的严重性人口统计，临床，内窥镜，或组织学参数的任何显著影响（数据未显示）。

4.讨论

胃食管反流病的发病机制与胃酸和胆汁反流均有关。酸与十二指肠内容物之间的协同作用已被证实与显著的食管损伤和向Barrett食管发展的化生有关[20.-22]。虽然大多数GERD患者没有食管病变(NERD)，但相当比例发展为食管炎，而Barrett的诊断约占10%。

目前对十二指肠-胃-食管反流的定量评估采用了非常先进和可靠的方法，如Bilitec 2000或多通道腔内阻抗法[23]。然而，胆汁回流还组织学根据胆汁诱导的反应性胃病评价并通过胆汁反流指数[表达24]。

在先前的研究中，我们使用的BRI分数，结果发现，约半数GERD患者进行了组织学病变是由于胆汁返流进入胃和BRI评分与食管疾病的内镜严重程度有关。因此，评估在胃胆汁反流的组织学证据，我们间接表明十二指肠胃食管反流（DGER）暗示在GERD发病机制[19]。

在本研究和同一组患者中，我们使用免疫组织化学方法评估肿瘤和凋亡标记物的粘膜表达。目的是调查GERD/DGER与早期癌变之间可能存在的联系。为此，我们评估了生物标志物p53、Ki-67、Bax和Bcl-2的黏膜表达。

P53是一种肿瘤抑制基因，它编码一种核蛋白，在细胞周期控制、DNA合成与修复、细胞分化和凋亡等方面发挥重要作用。突变体的形式P53基因通常与在细胞中的蛋白质，这可以通过使用特异性抗体[被检测的积累相关25]。Bcl-2蛋白延长细胞存活，被认为是细胞凋亡的抑制，而Bax蛋白起着通过细胞凋亡刺激后，加速细胞死亡在细胞凋亡中发挥关键作用。Ki-67的是，存在于增殖细胞核抗原，它已被用作细胞增殖的指标[26-29]。

虽然Barrett食管和食管腺癌已被广泛研究了免疫组织化学方法，也缺乏良性疾病免疫组化研究，如联想糜烂性食管炎或NERD或不符合DGER [中30.，31]。另一方面，DGER、GERD和癌变之间的联系不断被提出，在最近的一项研究中，Shaheen和Ransohoff报告说，食道腺癌的风险增加了5倍于之前诊断的食管炎患者。然而，大多数腺癌发生在Barrett食管患者中[32]。

大量的研究和动物模型显示了DGER在食管黏膜中的致癌作用和致突变潜力。其机制可能是间接的，涉及氧化应激的诱导和活性氧的产生，损害DNA。DNA的反复损伤可能会增加突变率，包括抑癌基因和癌基因的突变率[33-35]。

在本研究中，我们的免疫组织化学方法显示了一个极小的癌基因表达，这表明无论胆汁反流的作用如何，胃食管反流患者发生食道癌的潜在风险都非常低。具体来说，表达的很低P53在食道标本中，96.10%的患者(52/53)中染色细胞高达5%，这意味着P53基因，这被认为是tumorigenetic过程中最严重的初始事件之一，并没有增加。甚至低p53蛋白表达无关与胆汁回流胃病的存在，BRI水平分数或食管损伤的内窥镜严重性。以前的研究已经证明，在食管粘膜p53蛋白表达的阳性率逐渐从正常增加到回流性食管炎，进而巴雷特化生和不典型增生[36]。

如上文所述，p53蛋白在细胞内的积累对P53基因突变。然而,积极的P53部分组织标本的免疫染色与p53蛋白失活的机制不同，而不是突变P53基因，如粘膜炎症。我们的患者食管活检的组织学检查显示，大多数患者存在轻至中度慢性炎症(45/53;84.9%,表2和4)，这可能与我们的GERD患者p53低表达有关。在这种情况下，我们的病例中p53低表达几乎没有致癌作用，因为它可能与炎症有关，而与突变无关[37]。

关于Ki-67的细胞增殖标志物，我们在病人的64.1％（45/53），发现了一个非常低的食管表达。类似地，费斯等人。调查Barrett食管的癌变显示，有中Ki-67在正常食管鳞状上皮（仅低表达细胞ki -67阳性，而柱状上皮化生(),发育不良(）和浸润性癌（)[38]。我们与BRI阳性或食道病变的严重程度没有发现统计学显著关联Ki-67的反应性之间的任一方，即使在6例（11.3％）具有中等或高Ki-67的表达（>细胞的25％染色）。

正如我们所发现的，胃食管反流性胃病患者食管粘膜中p53或Ki-67的表达与胆汁反流性胃病无关。因此，胆汁反流似乎并没有改变GERD对Barrett食管和食管癌发展和早期进展缺乏遗传易感性标记的理论[39]。

按照食道，我们发现胆汁返流胃病和细胞凋亡或癌基因表达的失调在胃粘膜之间没有关联。

少量患者胃粘膜中p53的极低表达也提示发生了野生型蛋白的积累，可能是炎症反应所致。我们的研究结果与Craanen等人的研究结果相一致，后者的研究描述了在胃良性病变中缺乏p53表达[40]。然而，许多调查人员已经对此表示支持幽门螺旋杆菌感染与p53在胃粘膜的表达升高有关[41，42]。

此外，Bax蛋白在我们患者胃粘膜的高表达表明细胞凋亡的过程不受影响，它对肿瘤的发生起着重要的保护作用。同样，我们的患者的Ki-67免疫反应细胞主要定位于上皮的基底部，这与自然发生的增殖区相对应(图)3)。

在我们的患者中，有15%的患者在胃中检测到Bcl-2蛋白过表达。然而，它与胆汁反流性胃病或胆汁反流性胃病没有统计学上的相关性幽门螺旋杆菌感染。此外，回归分析没有揭示人口统计，临床，内窥镜，或组织学参数对免疫组化表达的严重程度在胃粘膜的特定抗凋亡标记物的任何显著影响。然而，在与我们的发现相反，Bcl-2表达的在胃中的意义先前已经报道，发现在多步过程中被牵涉，从慢性胃炎到萎缩，肠化生，非典型增生，最后侵入性胃癌[43]。

5.结论

总之，我们可以说，我们的研究表明，虽然胆汁反流在GERD的发病显著贡献，但对细胞凋亡或在这些患者的上消化道黏膜的主要致癌作用的过程中几乎没有任何影响。然而，事实上，我们研究的患者都比较年轻指示该结果的意识的解读，特别是尽可能的免疫组化而言。在另一方面，大组病例和可能更具体和胆汁反流的评价敏感的方法，不是组织学证据而已，需要以评估我们的研究结果的意义。

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