分析喀斯特在比较外显子2的密码子12和13通过快照分析的突变以普通的DNA测序

摘要

由于要求快速喀斯特需要治疗的患者为转移性结直肠癌，敏感，经济和容易可行的方法，单克隆抗体突变状态分析。在此方面，所述快照分析相比于常用的DNA测序的灵敏度和特异性被检查。我们检查喀斯特胰腺癌、结直肠癌和非小细胞肺癌原发肿瘤或转移灶的100个福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织样本的DNA测序和快照分析显示外显子2密码子12和13的突变。这些样本中有40%发生了突变喀斯特基因测序和快照分析;另外五个示例(45/100)仅通过快照识别。喀斯特突变检测是可靠的快照分析方法是可行的。更频繁的突变检测由快照分析表明，该方法具有准确的检测概率高喀斯特基因突变与排序的比较。

1.介绍

结直肠癌，非小细胞肺癌（NSCLC），癌和胰腺癌三种在世界癌症死亡的最常见原因。

现有的治疗方法针对表皮生长因子受体(EGFR)，如帕尼单抗[1- - - - - -4和西妥昔单抗[5- - - - - -8(两种单克隆抗体)治疗转移性结直肠癌，吉非替尼治疗NSCLC，埃罗替尼治疗NSCLC和胰腺癌。使用西妥昔单抗和帕尼单抗治疗转移性结直肠癌的成功取决于非突变喀斯特基因;治疗是无效的，如果喀斯特基因有任何突变[1,5,6,8，即使在没有配体(如表皮生长因子)的情况下，也会产生活化的g蛋白[9,10]。这导致进一步恶性增殖的细胞，尽管治疗。

两个密码子喀斯特基因主要是产生交替的蛋白，这些蛋白在没有配体与EGFR结合信号的情况下被组成性激活。这是密码子12和13在第2外显子喀斯特基因(9,10]。两个密码子编码的野生型蛋白质的氨基酸甘氨酸。在两个密码子的前两个碱基引线之一为氨基的KRAS蛋白酸交换的更换，从而导致肿瘤的电阻向上述处理。

甘氨酸的替代导致缺口的抗性，这些缺口是导致KRAS水解并结合GTP与GDP的蛋白质。在突变KRAS中，缺口无法影响GTP水解，从而导致组成性活性蛋白[10]。

到现在喀斯特突变分析主要是通过DNA测序进行[5]和DNA-DNA杂交商业化测试系统(如德国柏林Chipron)，焦磷酸测序[11，或Qiagen的Therascreen: K-RAS突变试剂盒[12基于]实时PCR技术。考虑不均匀基因型有关喀斯特对于肿瘤细胞的突变状态，需要更灵敏的检测方法。如果肿瘤有少量的内容物喀斯特DNA测序无法检测到突变细胞，抗表皮生长因子受体治疗可能对这些细胞没有抗增殖作用。

快照分析被认为比普通DNA测序更可靠[8并且能够检测微小的等位基因数量的突变喀斯特。本研究的目的是测试快照法与DNA测序筛选喀斯特突变。

2。材料和方法

2.1。肿瘤组织样本和DNA提取

我们的研究使用了不同来源的肿瘤组织样本:非小细胞肺癌的正常诊断病例(、33例手术切除标本及8例活组织切片标本)及结直肠癌(， 18例手术切除标本和2例活检标本)，存档的胰腺癌(和FFPE(福尔马林固定石蜡包埋)材料对结直肠癌标本的载玻片进行实验室间比较喀斯特2008年春天，由德国病理学学会组织的突变筛选。所有标本都是匿名制作的，由病理学家进行检查，病理学家选择至少有70%重要肿瘤细胞的肿瘤区域进行dna分离。Weichert等[13]提到标本habroring少于10％的肿瘤细胞显示出降低的突变率而不管所使用的方法。

将肿瘤组织固定在载玻片上(3)μ采用QIAamp DNA微试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)对组织材料进行微解剖提取DNA。从载玻片的实验室间比较中提取的组织材料经显微镜鉴定为肿瘤和正常组织，并从两个组织样本中提取DNA ()。

2.2。快照和序列分析前扩增步骤

从样本中提取基因组DNA后喀斯特用PCR (HotStarTaq DNA聚合酶，Qiagen, Hilden, Germany)扩增基因外显子2，引物设置为:5’-AAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3’和5’-CAAAGAATGGTCCTGCACCAG-3’[8]。在琼脂糖凝胶上检测扩增产物后，用MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)对PCR反应进行纯化，并进行测序和快照反应。

每个PCR反应有25μL体积及含量:上述引物组，浓度为400 nM, 1×PCR缓冲液，2.5 mM MgCl₂,0.1μG/μ大号BSA，5个单位的聚合酶，200 μM of each deoxynucleotide, and 100 ng of genomic DNA. The PCR reaction ran with the following program: 95°C initial denaturation for activating the HotStarTaq DNA Polymerase for 15 minutes, step 2 denaturation at 94°C for 30 seconds, step 3 annealing of the primer to the template at 55°C for 30 seconds, and step 4 30 seconds at 72°C for primer extension. Steps 2 to 4 were repeated 45 times followed by a final extension step at 72°C for 10 minutes, then the PCR reaction was cooled down to 8°C. One PCR preparation is used for sequencing reaction and the SNaPshot analysis.

2.3。DNA测序

将纯化的DNA作为模板与BigDye Terminatorv1.1 Cycle sequencing Kit (Applied Biosystems, Forster City, CA)进行测序反应。测序反应用3′喀斯特引物（5'-CAAAGAATGGTCCTGCACCAG-3'）与上热循环仪下面的程序：1分钟DNA的在96℃下初始变性，然后进行10秒钟的变性的25个循环在96℃，进行退火引物在50℃下5秒，和在60℃的延伸步骤4分钟。该程序之后，将样品储存于4℃。

在3130基因分析仪上进行毛细管电泳，得到电泳图(图)1 (b))使用finchTV (Geospiza，美国华盛顿州西雅图市)软件(在线可接收)进行分析。

2.4。快照

快照所用的引物是根据Di Fiore等人的算法实现的[8]:密码子12 1位;5 ' -AACTTGTGGTAGTTGGAGCT-3 '，密码子12位置2;5 ' -GATCGTACTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 '，密码子13第1位;5’- gatcgatcttgtggtagttggagctggt -3’，密码子13位置2;5′-GATCGATCGATCGATCGATGTGGTAGTTGGAGCTGGTG-3′。这些引物在模板DNA上潜在突变碱基之前的一个核苷酸位置上，在与SNaPshot Multiplex试剂盒(应用生物系统公司，美国加利福尼亚州福斯特市)聚合的过程中，只有这个核苷酸作为二脱氧核苷酸添加到引物序列中。进一步聚合被排除，因为它们的核苷酸脱氧核糖上缺少3 ' -羟基。

快照反应发生在10μL容积为1μL PCR产物，5μ快照多路复用主控混合，和一个2μ每个引物的浓度。温度循环器上的程序是在96℃变性10秒，在50℃底漆退火5秒，在60℃延长30秒，然后冷却到4℃。快照反应完成后，需要进行纯化步骤以消除无干扰的核苷酸。加1μL虾碱性磷酸酶(1 U/μL) (NEB, Ipswich, MA)， 37℃孵育1小时，然后75℃变性15分钟，在3130遗传分析仪(应用生物系统，福斯特市，CA)上清理快速反应用于毛细管电泳。

毛细管电泳使用内部DNA大小阶梯，GeneScan-LIZ 120大小标准(应用生物系统，福斯特市，CA)。不需要进一步的分析程序;可直接从电图中读取相关数据[8(例如,图1(一))。

2.5。统计分析

分析中快照分析的灵敏度和特异性喀斯特将突变筛选与普通DNA测序进行比较。以DNA测序为标准方法，特异性和敏感性均为100%。

3.结果

在100个被分析的组织样本中，有45(45%)个，a喀斯特检测在密码子12或13突变。这些40（88.9％）的突变喀斯特基因通过DNA测序和快照发现，另外5个突变(11.1%)仅通过快照检测。结果敏感度为100%，置信区间为95%[91.2% - 100%]，特异性为91.7%，置信区间为95%[81.6% - 97.2%]。

数字1显示通过快照而不是排序检测突变的示例。所分析的肿瘤标本分别为非小细胞肺癌、结直肠癌和胰腺癌。对于非小细胞肺癌，我们发现15/41例(36.6%)喀斯特-突变的癌症组织样本，6/20 (30%)喀斯特在实验室间比较的结肠直肠癌标本中，有14/19例(73.7%)胰腺肿瘤标本突变，9/20例(45%)结肠直肠癌肿瘤标本突变。

在该类型的突变喀斯特外显子2密码子12和13可以归类为转换和转位。过渡的突变喀斯特外显子2密码子12和13在大多数胰腺癌中出现(71.4%)。非小细胞肺癌喀斯特突变主要以转位(78.6%)和喀斯特结直肠癌的突变以转移和转位分布均匀。NSCLC样本中出现G37T、G38A、G35T、G34T和G35A。结直肠标本显示G34A、G38C、G35A、G34T突变。胰腺癌表现为三种不同类型喀斯特突变:G35A, G34C和G35T。的那种喀斯特图中明确列出了在组织样本中发现的突变2与总人数突变的百分比。

4.讨论

给定百分比喀斯特NSCLC的突变率为21-43% [4,14]及33% [15结肠直肠癌和胰腺癌的比例为75-82.4% [15,16]。喀斯特在我们的检查中，突变频率显示NSCLC为36.6%，结肠直肠癌为30%。73.7%的突变喀斯特基因在胰腺癌中的是根据先前所描述的数据[15]。

关于目前的前提条件喀斯特突变与帕尼单抗和西妥昔单抗治疗前筛选，喀斯特是癌症诊断中一种强大的分子标记[1,5]。分子癌症诊断正在为这些患者提供更个性化的治疗。这一目的使得分子筛选肿瘤是必要的，它揭示了癌症特征与化疗反应相关。

多项研究表明西妥昔单抗对EGFR表达的转移性结直肠癌患者有更大的益处喀斯特野生型 [5- - - - - -7]。一线治疗中西妥昔单抗联合奥沙利铂、亚叶酸、氟尿嘧啶提高转移性结直肠癌患者的总有效率[17]。

接下来是对转移性结直肠癌药物反应的重要预测，喀斯特突变也可能是决定非小细胞肺癌药物选择的决定性因素，因为这些激酶抑制剂似乎在癌与喀斯特突变(12,16,17]。Eberhard等人[14]表明较短的位疾病进展时间和存活中由厄洛替尼和顺铂的情况下，治疗的患者的突变喀斯特与单纯接受顺铂治疗的患者相比。喀斯特似乎不是一个预测因素[15在一项使用吉非替尼和化疗治疗晚期结直肠癌的研究中。

特别是关于扩大的领域喀斯特突变状态检测，需要可靠地确定等位基因状态。因此，知识喀斯特作出决定治疗使用EGFR靶向帕尼和西妥昔单抗治疗的癌症患者前基因突变状态是至关重要的。也考虑到巨大的成本和治疗的副作用，在喀斯特基因突变分析是必要的。

喀斯特突变可以通过多种方式进行筛选:DNA测序、DNA杂交商业化测试系统和快照分析[8]。在本文中，我们比较了常用测序分析和快照分析，认为前者更可靠[8]。我们的研究结果揭示做一个更好的突变检测，通过统计分析中。灵敏度达到100％，特异度为91.7％，这意味着该快照的精确度的可能性高。

为了确保突变阳性结果和避免假阳性结果，还建议在无核酸对照样本(“水控制”)旁运行a喀斯特通配型控件，具有已知的通配型喀斯特序列。

快照分析除了增强了可靠性外，还显示了一些优点。它比测序分析更便宜、更快速(快照11)€和19€DNA测序），并无需额外的软件可以分析，除了的GeneMapper程序（应用生物系统公司，福斯特市，CA，USA）。考虑到这些优势，快照分析可以取代DNA测序中喀斯特突变筛查。

Qiagen的Therascreen: K-RAS突变试剂盒[12]使用的ARMS-技术和蝎子引物的组合，所以它能够确定在野生型基因型的背景技术的只有1％的突变的等位基因突变。但是，该试剂盒可以检测到只有7个可能的突变类型喀斯特但是密码子12和13中有12个突变。在我们的分析中，我们检测了2个突变类型，一个在结直肠癌标本中，这将被therascreen试剂盒检测为假阴性。

的喀斯特突变可以细分为转位和转移。这两个事件导致氨基酸甘氨酸与蛋白质中的另一个氨基酸交换。过渡是指一个嘌呤碱基替换到另一个嘌呤碱基或一个嘧啶碱基替换到另一个嘧啶碱基，而转位是指嘌呤碱基替换到嘧啶碱基，反之亦然。转位和转位的发生在这三种不同的肿瘤组织中分布不均匀。在NSCLC中更常见的是转位，在胰腺癌中更常见的是转移。这两种突变类型在结直肠癌中平均发生。突变类型发生频率的不均等表明这三种肿瘤的情况不同。对于跃迁，只需要添加或除去一个氨基。对于转位，碱基必须被移除，新的碱基必须被添加。Riely等研究表明喀斯特不吸烟的人比以前或现在吸烟的人更容易患肺癌。这可能意味着转位突变与吸烟有关[18]。

就《喀斯特仅通过快照检测，是否可行缩短PCR的纯化步骤，并使用SAP/EXO降解干扰核酸。根据PCR产物的大小，只需在反应中加入适当的引物和PCR产物，快照就可以扩展到新鉴定的snp。通过为PCR和快照反应添加引物，这是一种在其他基因组区域分析snp的更便宜的方法。但是，不能对未考虑的序列重新分析数据。必须用其他引物重复这个快照。

极小比例的突变喀斯特用上述方法可以很容易地筛选出等位基因。在事件的喀斯特突变，单克隆抗体西妥昔单抗和帕尼单抗应停止治疗[5,11]。微小的等位基因数量突变喀斯特建议大多数野生型细胞有关喀斯特基因在肿瘤中。缺乏量化喀斯特突变等位基因可能使患者无法获得治疗，而这种治疗可以针对完整的肿瘤细胞喀斯特基因。因此，喀斯特快照突变检测在治疗反应预测中有更强的作用，这取决于根据突变的数量可以预期哪些反应喀斯特肿瘤中的等位基因。

利益冲突

作者表示，没有潜在的利益冲突。

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