胰高血糖素样肽2受体激动剂对结肠吻合口创面愈合的影响

抽象

背景。胰高血糖素样肽2（GLP-2）是肠营养特定激素，具有治疗潜力;对肠道修复的影响是未知的。我们使用结肠愈合的大鼠模型中，在常氧下，和应力（缺氧）的条件检查GLP-2的对肠道愈合的影响。方法。继结肠横切和再吻合术，动物被随机分配到六组之一（对照组、原生GLP-2、长效GLP-2 (GLP-2- MIMETIBODY, GLP-2- mmb)、常氧或低氧(11%)饲养） 条件。动物研究了吻合强度和伤口的特性后5天操作。结果。吻合破裂压力不变通过GLP-2或GLP-2-MMB在含氧量正常或低氧动物;两种治疗增加隐窝细胞增殖。卷绕IL-1与GLP-2增加;干扰素与GLP-2和GLP-2-MMB。IL-10和TGF-β减少;在缺氧动物中，I型胶原mRNA表达增加，而GLP-2激动剂均降低III型胶原的表达。在缺氧状态下，GLP-2 MMB，而非GLP-2可以提高TIMP -3 mRNA的水平。结论。在常氧和缺氧条件下，GLP-2激动剂对CCP、细胞因子和创面愈合的影响相似;吻合口的强度没有受到影响。这表明GLP-2(或激动剂)可以安全地在围手术期使用;需要直接学习。

1.简介

许多患者需要手术切除小肠或大肠的适用范围广的适应症，包括结肠直肠癌，炎性肠病，和创伤。从这些肠吻合泄漏是发病率和死亡率在胃肠外科的主要来源[1]。吻合口裂开不仅导致腹膜炎和败血症，但也增加癌局部复发率相关[2]。结直肠手术吻合口漏的总发生率为3.4 ~ 6%，低前切术后吻合口漏的死亡率为6.0 ~ 39.3% [3.]。因此，任何潜在的围手术期治疗必须密切评估其对愈合的影响。

吻合口愈合是一系列复杂的过程，其过程与我们更熟悉的皮肤伤口相似，但速度更快[4- - - - - -7];肠道伤口在7-10天后就完全恢复了。细胞因子或生长因子表达的改变，无论在数量上、质量上还是时间上，都可能对随后的伤口愈合产生影响[8,9]。已在实验研究中显示了积极的效果剂包括生长激素[5,10]和胰岛素样生长因子-1 [11,12]。然而，这些药物的全身效应限制了它们对这一适应症的临床用途。

胰高血糖素样肽-2 (GLP-2)是一种由33个氨基酸组成的肽，与胰高血糖素结构相似。它是小肠和结肠粘膜中l细胞分泌的一种肠内分泌激素，主要作为营养吸收的调节因子和肠道特异性营养因子[13- - - - - -15]。有趣的是，GLP-2的在肠中广泛作用是由间接途径介导;受体上没有上皮但肠神经元，散肠内分泌细胞和成肌纤维细胞pericryptal [表达16- - - - - -20]。短期内GLP-2增加肠道血流量[18]，而超过在非炎症组织长期来看它特异地增大隐窝细胞的增殖（CCP），以在隐窝深度和绒毛高度和粘膜养分运输净增[随后增加14,21]。然而，在发炎的粘膜，GLP-2是抗增殖，降低促炎细胞因子的表达而随着发炎黏膜的愈合的全局效果增加IGF-1的表达[19,20]。这些效果不是通过IL-10或TGF-β介导的表达[20]。有趣的是，提出了GLP-2的肠营养效果通过IGF-1表达介导[22，而IGF-1已被证明可以增强吻合创面愈合，改善破裂强度，增加吻合口胶原沉积[11,12,23,24]。由此，我们推测GLP-2可能具有与IGF-1相同的创面愈合作用，但不具有系统性作用。另外，GLP-2可能通过其抗炎作用潜在地损害愈合，这已经在其他抗炎药物如皮质类固醇和非甾体抗炎药物中得到证实[25- - - - - -27]。

胰高血糖素样肽模拟体2-构建体（GLP-2-MMB）是GLP-2的长效形式。人GLP-2（1-33）长效类似物（精氨酸在N末端的第二个氨基酸的甘氨酸取代）耦合到包括抗体的Fc部分的域，在这种情况下，大鼠IgG2bFC同型与人IgG4铰链[28]。在Fc构建体的分子量增加和药物动力学性质显着增加的半衰期相比，工程改造的天然肽，其可能是有用的治疗[28- - - - - -三十]。

我们假设GLP-2将会对吻合口愈合有积极的影响，通过增加生产的抗炎细胞因子的IL-10和促愈TGF-B，用在促炎性细胞因子IL-1没有变化和IFN。我们比较了长效受体激动剂GLP-2- mmb与本地GLP-2的作用，利用不同的全身氧合状态模拟临床围手术期应激源[6,31]。一项人体的研究表明，吻合口周围的氧张力20 mmHg was highly predictive of anastomotic leakage; in this study ambient oxygenation levels were set so that tissue PO₂浓度为40-50毫米汞柱[6,31]。在该泄漏出现时间通常为天5至7后操作，这是在伤口最大胶原酶活性的相位;相应地第五天术后被选为研究终点[3.,4,32]。

2.方法

2.1。动物与外科手术

对实验方案的伦理批准由医学卡尔加里大学的学部动物护理委员会批准。Male Sprague-Dawley rats (250–300 g) were acclimatized for a week and fasted for 24 hours prior to surgery with free access to water. Prior to surgery, animals were randomized to the GLP-2, the GLP-2-MMB, or control groups. Animals were injected s.c. one hour prior to surgery with 100 g/kg (1-33) GLP-2 (American Peptide, Sunnyvale California)在1ml生理盐水中，2 mg/kg GLP-2- mmb (Centocor Inc .和D.)。用1ml生理盐水或1ml生理盐水(对照组)稀释。GLP-2- mmb的给药依据前人的研究，建立了GLP-2对增加CCP的剂量反应等效性[28]。动物称重，并用1-2％的异氟烷​​麻醉。A prophylactic dose of 25 mg cefazolin (Novopharm Limited, Toronto, ON, Canada) was given subcutaneously just prior to surgical incision. The transection-anastomosis was done in the midportion of the transverse colon, following our previously described methods [6]。边际容器用6-0丝线（Ethicon的公司，萨默维尔，NJ）连接，被横断的肠，并用10-14创建一个吻合中断6-0单丝聚丙烯缝线（脯氨酸，爱惜康公司萨默维尔，NJ）。腹部用盐水灌溉和使用4-0薇乔运行缝线（Ethicon的）两个层（皮肤和肌肉）关闭。A subcutaneous fluid bolus of 10 ml of normal saline was given, and a single intramuscular dose of 0.015 mg buprenorphine (Temgesic, Schering-Plough Ltd., Hertfordshire UK) was given for analgesia.

2.2。治疗组

手术后,这些动物第二次被随机分配到常氧()或低氧(）的环境中，按照我们前面描述的方法[6]。简而言之，一个密封的盖子被安装在一个标准的聚乙烯鼠笼上，并有适当的连接来控制空气输入。低氧发生器(纽约的Hypoxico Inc)设置为50%，这使得低氧环境约为11%,corresponding to a tissue oxygenation of 40–50 mm Hg [6]。每天使用MiniOx I氧分析仪(MSA Medical Products，匹兹堡，PA)测量腔室的氧含量。常氧动物饲养在标准鼠笼中。所有的老鼠都是成对饲养的，在整个研究过程中记录它们的食物摄入量。动物被成对喂食标准的啮齿动物颗粒饲料，并允许喝水自由采食。总共48只动物用于实验和分成6个治疗组：常氧对照，含氧量正常的GLP-2，GLP常氧-2-MMB，缺氧性控制，缺氧GLP-2和缺氧GLP-2-MMB。将动物保持在它们的含氧量正常或低氧环境中，在实验（5天）的持续时间。所有动物每天注射两次，从0800到9时至再次用生理盐水1800至00年的控制，GLP-2，动物100 g/kg/day (1-33) GLP-2、GLP-2- mmb动物在第0天和第3天给予2 mg/kg GLP-2- mmb，其他时间点给予生理盐水。每次注射持续时间都不超过90秒，实验动物立即被送回合适的氧气环境。

2.3。端点

术后第5天上午9时至11时继续正常喂养模式，配合治疗注射(生理盐水/GLP-2配体)，腹腔注射100mg /kg 5-Bromo--deoxyuridue核苷（BrdU）（Sigma-Aldrich公司公司，圣路易斯MO，USA）。一米小时后的盐水/ GLP-2 / MMB和BrdU注射，将它们用1-2％异氟烷麻醉，称重，并进行剖腹手术。Approximately 5 ml of blood was taken by cardiac puncture drawn into iced EDTA vacutainers containing 10% volume of 5000 KU trasylol and 0.1 mM diprotinin A, centrifuged within one half hour, and the serum was frozen. GLP-2 (1-33) quantification was performed using a RIA specific for the active N-terminus of 1-33 GLP-2 (J. J. Holst, Panum Institute, Copenhagen, Denmark, antibody no. 92160) [33]。这不能捕获MMB结构的GLP-2活性，因为抗体在样品制备过程中沉淀[33]。

动物然后通过放血安乐死。除去肠的从幽门到远端结肠的整个长度。The length and width of small and large intestine were measured, under standardized tension (2 g). The colon was then divided 3 cm proximally and distally to the anastomotic sites. Any adhesions to the anastomosis were removed整块与结肠段保持吻合的完整性。

2.4。爆破压力测量

使用耦合到直列血压计（伟伦Tycos，Skaneateles的瀑布，NY）输液泵测定爆破压力，如先前所描述[6]。The bowel was submerged in a saline bath and infused with air at a rate of 5 ml/minute. Bursting pressure was recorded as the pressure where visualization of bubbles was first observed。

2.5。组织准备

切除连接，并纵向切开含有吻合口的肠段。切除了包括吻合口和两侧5mm结肠组织的一段。纵向分为三个部分:一个用于组织学研究，一个用于细胞因子分析，一个用于RNA分离，用于RT-PCR，处理方法如下。我们之前已经证明，测定破裂压力的过程不会改变组织的组织学评分、细胞因子或mRNA含量[6]。

2.6。胶原蛋白，组织抑制金属蛋白酶，和胶原酶分析

肠创面的主要强度来自I和III胶原;4-8天内胶原酶13活性的增加被认为有助于渗漏的发展，特别是同时存在炎症的情况[34,35]。金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)抑制这种活性[36]。为了检查这些因素GLP-2治疗的效果，在mRNA水平对每个分子中的perianastomotic组织进行了评估。As described, a longitudinal segment of bowel tissue containing the anastomosis and 5 mm of bowel on either side was flash frozen in liquid nitrogen and then stored at直到处理。采用TRIspin法提取总RNA [37使用SYBR绿试剂（分子探针，Eugene，OR）的方法]和定量。使用RNA的1UG从各组中的所有样品的同时反转录（RT）反应与OmniScipt试剂盒（Qiagen，德国希尔登）进行。聚合酶链反应（PCR）是用来评估mRNA水平。对于I型胶原的引物，III型，TIMP 1，2，和3中，和基质金属蛋白酶13（MMP-13）在现场合成;序列如先前报道[36,38]。对每个分子的PCR条件进行了优化和严格控制(温度、循环次数)，以确保检测处于扩增的线性阶段。采用琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色分离检测pcr生成的cDNA扩增子(gel Doc XR System;BioRad大力神,CA)。将每个基因的值除以的表达值进行归一化肌动蛋白在同一样品中;的表达-肌动蛋白是一种管家基因，在吻合处不发生改变[6]。再分析一个子集的RNA的基因与第二个整除评估显示几乎相同的结果报道的此外,在其他系统中,使用指定的mRNA分析之间的直接比较方法和实时qPCR显示高拷贝数的基因几乎相同的结果评估(哈特DA和雷诺CR,未发表)。

2.7。细胞因子分析

组织储存于直到处理。将上述吻合口周围标本解冻，盐水冲洗，5体积均质液均质。均质溶液由50 ml 100 mM磷酸盐缓冲盐(PBS)， pH 7.0，和一个完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒片(罗氏诊断法，曼海姆，德国)组成。组织在多管匀浆器中匀浆(运动学模型2100，瑞士)。匀浆2000 rpm离心20分钟，去除较大组织颗粒，13200 rpm离心60分钟，得到清晰的上清。上清液混引并储存于直到进一步使用。从匀浆每个样本蛋白质含量根据Lowry法来测定39]。

用大鼠肿瘤坏死因子-的酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒定量测定上清（TNF-α）（检测设计，密歇根州安阿伯，USA）白细胞介素1（IL-1），白介素-10（IL-10），白介素-13（IL-13）转化生长因子（TGF-β)、干扰素(干扰素）（矿泉，加利福尼亚州卡马里奥，USA），每个按照制造商的方向。所有标本一式两份进行分析，然后归一化至样品的总蛋白质含量，并表示为pg / mg蛋白质。

2.8。隐窝细胞增殖

由于每个GLP-2受体配体的生物学效应的度量，隐窝细胞的增殖进行测定。At the time of euthanasia, a segment of distal ileum, approximately 10 cm from the ileocecal valve, was harvested and preserved in 10% formalin for at least 48 hours. The tissue was then dehydrated and embedded in paraffin blocks. Sections 6 切片机切m厚，对BrdU-(抗体1:100 rabbit anti-BrdU;Serotec,英国伦敦)。然后计算每只动物5个隐窝中BrdU染色的细胞数和每半隐窝的总细胞数，以BrdU的比值表示细胞/每半隐窝的总细胞数，并取平均值表示每只动物的数值[19]。

2.9。组织学

立即将一条带吻合口的组织置于10%福尔马林中保存至少48小时，脱水后包埋于石蜡块中。第六部分使用切片机微米厚切并用苏木精和伊红（Sigma公司，圣路易斯，MO，USA）染色，并使用标准的光学显微镜检查。所有的观察是由一个考官（H.A.红石）谁是失明的治疗组作出。利用我们以前报告修改的半定量计分法切片评价[6,40]。简而言之，愈合、炎症反应、粘膜下/肌层桥接和粘膜上皮愈合的每一个参数都被分为0 - 3分，0分为正常，最高分为9分，得分越低，说明愈合改善。

2.10。统计分析

结果以平均值表示该平均值的标准误差。意义差异，采用单因素方差分析使用Tukey事后检验分析评估。P值0.05为有统计学显著。该计算机软件程序的GraphPad Prism 4.01版（棱镜公司，拉霍亚，CA）用于这些计算。

3.结果

3.1。临床结果和大体形态

所有动物耐受手术，有两个围手术期死亡，一个在天一个常氧对照组，一个在第四术后第一天缺氧GLP-2-MMB小组。这两种动物的吻合是在尸检时完好，并没有具体原因可能是查明;这些结果被排除在进一步分析。相比，无论是在含氧量正常组或低氧组对照有在体重变化，食物消耗，以及小肠或大肠的长度和宽度与GLP-2和GLP-2-MMB治疗没有差异（数据未显示）。

3.2。隐窝细胞增殖

隐窝细胞的增殖（CCP）在GLP-2和GLP-2-MMB治疗组都被显著增加（图1)在常氧条件下。在低氧条件下，对照组动物的CCP有预期的增加;在这些条件下，mmb处理的动物的增殖率没有增加(图)1）6]。天然GLP-2保留在低氧条件下增殖的效果。

3.3。爆破压力评估

如所预期的，吻合口破裂压力分别在缺氧动物显著较低，但存在与低氧或含氧量正常的组内任一GLP-2或GLP-2-MMB治疗没有差异（图2)。

3.4。组织学分析

各组的平均吻合口的愈合得分不与任一GLP-2或GLP-2模拟体治疗显著不同的，因为与对照相比，无论是在含氧量正常的条件或低氧条件（图下3.)。有由于爆破压力研究组织平面的破坏相当神器的领域;然而，表面上皮，肌肉层和炎症在浆膜下的状态可以是在所有动物中确定的（图3.)。

3.5。GLP-2血清

GLP-2的平均血清水平在对照动物（在常氧和低氧类似），在glp -2处理的动物中，和 pmol/l in GLP-2-MMB-treated animals. There were no differences between the levels in hypoxic and normoxic animals. The serum levels of GLP-2 were significantly higher in animals receiving GLP-2 (1-33) (）;然而，在GLP-2-MMB处理的动物的水平没有显著高架与对照相比。重要的是，在GLP-2 MMB动物水平只反映内源GLP-2，因为该测定没有检测到抗体结合活性[33]。

3.6。细胞因子分析

促炎性细胞因子的水平的IL-1肿瘤坏死因子-和干扰素-glp -2处理和对照组的动物如图所示4。水平的il - 1和IFN在常氧和缺氧条件下，GLP-2均升高。GLP-2-MMB治疗导致IL-1下降两个氧的条件下，并导致对IFN的差动作用水平;这些物在常氧和降低低氧条件下增加。TNF-α水平不是由GLP-2的任一种形式显著影响。抗炎细胞因子IL-10的水平，以及TGFIL-13如图所示5;GLP-2和GLP-2- mmb处理后，粘膜IL-10水平显著下降，但IL-13水平无变化。TGF -水平通过两个GLP-2疗法降低，在这两个低氧和含氧量正常的动物。

3.7。胶原蛋白，金属蛋白酶的组织抑制剂，胶原酶和表达

RT-PCR检测I型(cI)、III型(cIII)和MMP-13型胶原mRNA水平的结果如图所示6。增加了两个GLP-2受体激动剂CI mRNA在低氧条件表达式。CIII mRNA的水平通过两个GLP-2激动剂含氧量正常条件下降低，而在低氧条件下的变化并不显著。没有关于MMP-13 mRNA水平没有大的影响由GLP-2激动剂，下任一环境氧状态;然而，存在与GLP-2-MMB治疗的缺氧动物有趣在mRNA水平统计学显著增加为TIMP 1，2，和3，而不是天然GLP-2（数据未示出）。

4。讨论

本研究首次探讨GLP-2对小肠吻合口愈合的影响。本实验采用GLP-2和GLP-2- mmb两种激素的长效形式，在一个创伤愈合正常和受损(缺氧)的动物模型中评价GLP-2对结肠吻合的影响。我们最初的假设是，添加GLP-2可以促进愈合，尤其是在缺氧动物中;但这并没有发生。然而，这项研究确实揭示了一些重要的发现。首先，结果表明外源性GLP-2对吻合口完整性没有负面影响。其次，外源性GLP-2影响愈合吻合内的促炎通路和抗炎通路，并影响胶原基因表达，改变创面内沉积的胶原类型。最后证实长效GLP-2微体确实具有与天然GLP-2相似的生物活性;然而，剂量可能不会产生生物等效的效果。

吻合破裂压力早已用作吻合强度的验证措施[6,24,25,41]。本研究显示与GLP-2处理，正常或紧张（缺氧）的条件下在爆破压力没有差别。因此GLP-2似乎不改变吻合口愈合的强度;这一发现确实有临床意义。GLP-2目前正在研究用于炎性肠病和短肠综合征的治疗应用。患有这些疾病往往需要手术切除胃肠道的;因此，在此基础上进行测试的吻合完整性以最大敏感性（5天手术后在该模型中），并发GLP-2治疗的相应不会影响手术或吻合完整性的任一个定时这些数据。

这些结果并提供额外的见解GLP-2在吻合口愈合的动态环境的影响。在胃肠道中的主要促炎性细胞因子包括IL-1肿瘤坏死因子-和干扰素-抗炎细胞因子IL-10、TGF-是治疗的主要调节器。炎症是伤口愈合的一个组成部分，促炎细胞因子在这一过程中很重要。手术创伤会引发急性炎症反应，包括IL-1等细胞因子的释放,肿瘤坏死因子,干扰素。以下后早期伤人响应，存在细胞因子分布于抗炎/促愈细胞因子的移位从促炎，包括IL-10，IL-13，和TGF-(5,34]。的抗炎性细胞因子限制的炎症反应，其允许伤口演变成愈合的增生阶段的持续时间和幅度。从炎性环境到愈合环境这偏移是由巨噬细胞伤口协调，有可能下的细胞因子信号的方向。它已被证明，这两个IFN和TNF是关键介体影响巨噬细胞表达[42]。我们前期的工作也表明，在肠道炎症模型中，GLP-2降低了炎症细胞因子和TGF-的黏膜含量但增加了巨噬细胞生产IGF-1 [19,20]。在本研究中，在不同的炎症刺激下，自发的GLP-2治疗导致促炎细胞因子IL-1水平升高和干扰素并降低了抗炎性细胞因子IL-10和促愈因子的TGF-β的量然而，治疗似乎在正常进行4和5)。GLP-2-MMB显示，在炎性细胞因子不同的轮廓，在IL-1的降低两个常氧和缺氧条件下，并且在IFN-进一步增加下在缺氧。所有这些发现表明，这些细胞因子的作用不足以改变伤口愈合，这可能是因为其相对水平比基线高出许多倍，而且所观察到的所有水平都足以刺激强有力的愈合反应[5]。这项研究的一个限制是，我们无法量化IGF-1在吻合的水平;这可能是在不同的条件下说明的GLP-2的不同的影响之间的一个重要环节[5,12]。

IL-10和TGF-β的水平较低本研究中注意到GLP-2治疗(两种配体)的结果与之前的研究相似，这表明GLP-2对炎症组织的任何作用都不太可能是由于这些因素的增加(图)5）19,20]。另外，本研究选取第5天作为肠创面愈合由炎症期过渡到增生期的时间间隔，对愈合吻合进行了研究。先前对吻合伤口愈合中炎症细胞因子的评估研究显示，术后第一天炎症细胞因子较早达到峰值，随后在第5天下降;因此，本研究可能遗漏了伤口愈合信号中一些重要的早期变化;有必要对这些事件的时间序列进行进一步调查[5,34]。

胶原蛋白的合成是在吻合口愈合的最基本的步骤之一。由成纤维细胞和肠平滑肌细胞放下胶原丰富的组织取代了在炎性阶段建立的临时基体。在胶原蛋白合成，沉积，交联，和降解之间的平衡小扰动可能会导致有缺陷的伤口愈合[7]。在本研究中，我们表明，GLP-2处理的动物表现出mRNA水平的I型的适度增加和减少的用于III型胶原，其也受环境氧浓度的mRNA水平（图6)。I型胶原是肠组织中最常见的胶原，III型胶原第二常见[43]。临床研究显示结肠直肠癌术后吻合口漏患者I、III型胶原表达下降[35]。GLP-2和GLP-2 MMB的效应让人放心。有常氧条件下，Ⅰ型胶原蛋白的mRNA没有影响，但在胶原蛋白III的下降;缺氧胶原I mRNA水平分别增加了两种配体的应力（图下6)。的GLP-2的配体显示出对mRNA水平的抑制因子无影响，不同的是用GLP-2 MMB低氧条件下的增加（数据未示出），和MMP-13的表达没有改变，但呈下降趋势（图6)。总之，这些发现表明，在缺氧胁迫下，GLP-2配体中的I型胶原合成略有增加，而有趣的是，长效GLP-2 MMB的TIMP活性明显增加。在用GLP-2激动剂治疗的缺氧动物中，发现破裂压力有适度(但不显著)的增加，这表明药物改善了伤口的整体强度(图)2)。为了充分理解在伤口胶原代谢这些变化的影响将是直接测量胶原1和3的水平有用;但是，由于可用的小批量的，这是不可能在目前的协议，但会在今后的研究中。

从治疗观点来看，GLP-2是由它的半衰期短限制，因此GLP-2-MMB是一个有吸引力的替代方案。吻合GLP-2和GLP-2-MMB处理的显示类似的细胞因子谱，并且如通过隐窝细胞增殖测定GLP-2和GLP-2-MMB的生物学效应是相似的（图1)。在MMB配体的影响较小表明，尽管长半衰期有在活动药效有关减少;这可以用于通过增加剂量来补偿，以及给药直到隐窝增殖的频率等同于GLP-2 [的相关索引剂量44]。对照组中相对较高的GLP-2水平可能是由于测试的条件所致;动物没有禁食，通常在黎明前进食，增加了内源性GLP-2的释放[15]。重要的是，与天然肽相比，在吻合口完整性方面没有差异。因此，GLP-2-MMB似乎是一种可行的替代天然肽，具有方便的长剂量时间表，但保留了生物效应。

总之，我们发现GLP-2通过炎症和抗炎级联和胶原基因表达改变细胞因子在常氧和缺氧吻合中。然而，这并不转化为吻合口强度的改变。从临床来看，GLP-2对吻合口愈合无不良影响。因此，需要手术治疗的接受GLP-2激动剂治疗的患者不应出现吻合口愈合受损，但今后需要进行直接研究。

披露的信息

D. L. Sigalet曾担任了Centocor公司的付费顾问（2007年）。S. Sague和P. J.霍恩比支付Centocor公司的员工。

致谢

这项工作是由Centocor公司制药公司赞助的研究协议的资助。该项目由DLS =大卫大号Sigalet怀了孕。DB =威廉·d布尤案，SJ =萨拉Sague;和PH =帕梅拉Ĵ霍恩比;实验工作是由HR =希瑟一个红石做，有Laurie华莱士从Sigalet实验室和卡罗尔里诺从哈特实验室的技术支持。结果的解释和分析由RH，DLS，所有作者进行与帮助下，HR，编辑所有文本初稿。重印的请求应该去DLS。

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