成熟期对婴幼儿结肠微生物区系的影响

抽象

结肠微生物群落的组成及其成熟过程的变化很少在大样本中进行研究。方法。我们使用传统的微生物测试，以分析粪便样品的结肠菌群（Kyberstatus，研究所forMicroecology，本草堂，德国）从12名484儿童不同的肠和nonintestinal诊断。粪便样品分析总菌落形成单位（CFU）（每克粪便）和的丰度双歧杆菌、拟杆菌、大肠杆菌、肠球菌和乳酸菌sp。关于年龄，性别。对1089名婴儿的子集进行了分析，以了解他们在出生后第一年的月变化情况。结果。总CFU和个体微生物种类在出生后的第一年最高，在头两年下降，然后在剩余的儿童期稳定下来。在婴儿中，CFU总量在5个月前上升，随着断奶而下降，在9-10个月时达到峰值。年龄的显著影响，而不是性别的显著影响拟杆菌属种和乳酸杆菌。然而Bacterioids sp。和乳酸杆菌随年龄增长，而Enterococci和大肠杆菌减少，双歧杆菌保持稳定。结论。结肠微生物群落表现出细菌特异性和一般的成熟模式，其中最深刻的是在第一年。

1.简介

在大量非致病细菌的年龄相关的变化发现，在人类结肠很少被大样本调查中，无论是患者的肠和nonintestinal障碍，也没有在健康受试者。与此相反，在婴儿和儿童结肠菌群成熟的影响偶尔进行了研究，但主要是在孩子小的同伙。

结肠菌群的偏差已被证明是呼吸道疾病的原因[1、肠道疾病[2，特别是皮肤病[3.- - - - - -6在儿科人群中。例如，有人认为，生命早期接触共生菌和致病菌的数量，如剖腹产后，[7可能导致日后发生特应性皮炎[8]。“卫生假说”的基础是一个类似的论点。9]，它认为童年期间更大的暴露于环境中的病原体，例如，在成长在农场或具有与动物接触，将保护用于免疫介导的疾病以后的生活中[10,11]，但是这仍然是一个有争议的问题[12]。然而，共生菌群对发展正常先天免疫的重要性已得到充分证实[13]。

对于相对缺少大规模调查的一个原因是细菌菌落粪便样品中发现不会保持运输和储存过程中稳定的怀疑;因此。供细菌计数的不准确的估计，当使用传统的微生物的工具。因此，对于粪便微生物商品化试剂尚未在常规临床评估一个被广泛接受的诊断工具。一个例外是在炎症性肠疾病，特别是节段性回肠炎和溃疡性结肠炎的诊断中使用的粪便微生物群的，因为这些是强关联diff梭状芽胞杆菌。两个孩子的殖民[14]和成人[15]。

最近对益生菌和益生菌治疗功能性肠道的兴趣[16,17，其他肠道[18- - - - - -21]，和nonintestinal病症[12- - - - - -26]，以及新的分子生物学工具的可用性，这些工具能够计数不同的物种，确定每个菌株中的基因不同的亚种，并描述正常的人类结肠微生物群及其多样性，已经创造了一个新的研究热潮。有关成熟期对儿童时期微生物群的影响的调查[27]及其与老化改变[28]最近已经完成了。然而，与大多数基于传统微生物学的研究一样，样本量迄今仍相当小，因为PCR技术尚不容易获得，微阵列芯片技术允许评估所有已知栖息在人类结肠的细菌物种(范围在仍然很贵。然而，这种情况在不久的将来可能会改变。

已经评估了人类粪便菌群成熟的作用的少数研究表明，有些细菌种类在他们的丰度下降与年龄，而其他的则没有。本文展示了大量的数据（儿童各种肠道和非肠道症状及诊断的常规微生物学数据库。有关成年人口的数据已于近期发表[29]。这一分析的基本假设是，平均细菌丰度在各种疾病患者和医疗条件可以发现代表可以称之为“正常”的人的粪便菌群的近似值。我们的评估是根据上一年度的过程中与GLP认证的商业实验室进行常规的微生物分析。

2.材料和方法

2.1。收集粪便样本进行微生物分析

在一年中(2006年)，所有由全科医生提交的用于结肠非致病菌菌群常规工业微生物学分析的粪便样本(Kyberstatus，微生态研究所，德国Herborn)均纳入研究。一般来说，样品在一天内到达实验室并立即处理。

为了确保运输没有对养殖品种有任何影响，存储研究与20个新鲜样品进行。In short, 0.2 g of faeces was serially diluted in 1 mL of phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2). The solution was vortexed for 5 seconds and serially diluted (to)， PBS, pH 7.2。每一种稀释液取一毫升，分别铺在富集培养基或选择性琼脂培养基上。

剩余粪便在25℃的温度下保存3天，25℃为运输期间的平均温度。在潜伏期之后，样品按照所述进行处理，并对结果进行比较。在两天内，被调查菌群的细胞计数没有显著差异。因此，得出的结论是，不到两天的装运对可培养菌群的组成没有影响。只有在发货后一两天内到达的样本才被纳入研究。

2.2。微生物的鉴定和计数

用哥伦比亚血琼脂(总细胞数;U3G琼脂(肠杆菌，肠球菌;海法，海德堡，德国)，罗戈萨琼脂(乳酸菌;、DIC琼脂(双歧杆菌;、沙得勒琼脂(拟杆菌属;和SPM琼脂(梭状体;Heipha)。粪便样品用1ml磷酸盐缓冲生理盐水(PBS, pH 7.2)进行连续稀释，然后用能够同时电镀12个琼脂板的全自动螺旋板进行选择性的琼脂板电镀。随后，在37℃的好氧或缺氧条件下培养至少两天。细菌首先通过革兰氏染色和菌落形态鉴定。 Additionally, identifications were performed by the API and VITEK systems (bioMérieux). All counts were recorded as the numbers of log₁₀每毫升样品的CFU。

常规分析的细菌有:梭状芽胞杆菌sp。,双歧杆菌,拟杆菌属种下属音(大肠杆菌,肠球菌sp。,乳酸菌sp。），以及其他细菌（假单胞菌sp。,克雷伯氏菌。,变形杆菌sp。,枸橼酸杆菌属sp。需氧细菌)。只有在至少50%的相应亚样本中鉴定出的细菌才被纳入进一步的分析。

2.3。其他数据

因为样本来自不同临床疾病的患者(表)1），我们收集到的报告由咨询医生附加数据。这包括年龄，性别，假定的临床诊断，和大便稠度和频率。大便pH值在实验室确定。

2.4。数据分析

该数据已经取得了匿名后，为进一步的统计分析提供了依据。到在分析之前，将样品筛选相同的患者ID，和被排除的任何第二或随后的分析。不完整的数据集也被排除在外，除了那些只有性别信息缺失。

儿童样本的年龄分布()(图1）和成人样品（)。这项成人研究最近已发表[29]。1089名婴儿((1年)，分析出生后1年内的月变化。

总CFU分析以及细菌丰度以下的微生物;双歧杆菌,拟杆菌属种,乳酸杆菌,大肠杆菌和肠球菌sp。在其中的科目所占的百分比sp梭状芽胞杆菌。经鉴定评价为好。

在进行统计分析之前，对数据进行归一化处理。将单个细胞群体的CFU与通过计算每种细菌的相对“丰度”确定的总CFU进行比较((特异性CFU/总CFU)*100)。

通过ANOVAs对各亚群(婴儿、儿童)的细菌计数(丰度)分别进行分析，并在“年龄”(婴儿按月间隔，儿童按年间隔)和“性别”因素之间进行分析。“因果用Bonferroni校正以考虑多重比较试验每个数据集内用于测试单个差异（几个月或几年，RESP之间）。皮尔逊计算，以检验单一措施之间的相互关系。所有数据均以平均值表示扫描电镜。设置0.05的临界值表示所有检验均有统计学意义。所有数据采用SPSS Version 13统计软件包进行分析。

3.结果

在47,775个样本中，是儿童和青少年不到18岁，其中，婴儿和不到一岁的婴儿对他们的粪便样本进行了各种临床情况分析(见表)1)，但没有任何诊断准确性的文档。

3.1。婴幼儿

婴儿组(1年）包括604名男性和女性459，月龄。方差分析显示的年龄显著的影响（,），但不总CFU性别的（图2)。如可以看到的，CFU的前几个月内增大，在断奶时下降到第一低，并且在10个月显示出的第二峰和11.稳步下降之后在5岁或6至达到稳定水平（描述在下面）。

方差分析显示年龄对个体细菌丰度有显著影响，而性别对个体细菌丰度无显著影响。所有细菌除了乳酸杆菌在出生后的第一个月内就出现了然而,Enterococci和大肠杆菌下降（,和,、职责)拟杆菌属种增加(,),双歧杆菌保持稳定(,)第一年。乳酸杆菌在高浓度存在于第2个月，但此后稳步下降（,)(图3.)。百分比sp梭状芽胞杆菌。拒绝从3到2％。

3.2。孩子们

为所有12,483名儿童(年,男:女，剩余=缺失)，CFU总量显著下降(,)，其后维持稳定。整体而言，女性的细菌数目明显少于男性(,)(图4)。

单个细菌表现出丰富的最初几年内为同年龄相关的下降Enterococci(,),乳酸杆菌(,),而大肠杆菌适度降低(,)。鉴于其具体CFU的比例高，时间曲线双歧杆菌和拟杆菌属种。几乎是互补的。双歧杆菌降低整体(,),而拟杆菌属种。增加了他们的比例(,)(图5)。此外，还注意到性别的独立影响双歧杆菌(,),大肠杆菌(,）与较高值双歧杆菌，但更低的价值大肠杆菌在雄性中（未示出数据）。百分比sp梭状芽胞杆菌。在2％左右仍然较低（数据未显示）。

粪便稠度(1 =固体和5 =液体)下降(,)，而女性则明显较低(,)。大便pH值的最初几年内增加（,)，而女性的整体得分较高(,） （数据6(一)和6 (b))。

发现中度负相关的pH值和之间双歧杆菌(,），以及pH值和之间的正相关大肠杆菌(,)。

4。讨论

新生儿是在出生时无菌，并从第一小时的寿命内的周围环境获取的细菌：从母亲的阴道和粪便菌群，从医院或家庭环境中，根据不同的模式和交付的位置。可能影响新生儿的肠道菌群的组成的其他因素是出生，成熟，卫生措施过程中对环境和婴儿喂养的类型[30.]。

特别，大肠杆菌,肠杆菌属sp。和Enterococci由于在出生时肠道环境更有利于有氧菌和兼性厌氧菌，因此在新生儿中通常发现其浓度高于成人。当这些物种扩张时，它们消耗氧气并允许无氧菌株跟随，包括拟杆菌,双歧杆菌和梭状芽胞杆菌。乳酸杆菌是耐氧的，很可能来自母鼠的粪便菌群[31]。通过剖腹产分娩的婴儿进不来交付过程中与母体植物接触。他们的殖民拟杆菌属种。是延迟。这已被证明是导致日后发生特应性皮炎的原因[32]。

然而，在婴儿中，肠道菌群组成和分布的可变性仍然很高[33]。亦会因应营养状况的不同而有所更改[34]和其他文化的影响[35，以及宿主遗传学，它们对粪便微生物区系的组成有很大影响[36]。

因此，探索发育成熟过程中肠道菌群组成的“正常”范围仍是一个方法论上的挑战。在先前的一份文件中[29]，我们报道从一个大的数据（35.000样本）假设所有患者的平均细菌丰度表示可被称为“正常”的人的粪便菌群近似在成人群体。从相同的源使用当前数据，我们采用这种说法，以婴幼儿和儿童。

与以前的报告（由Adlerberths等人总结的协议。[31]），我们提出一个高总细菌在第一个月内新生儿肠道出生后第一年的生活之内下降到那些童年，之后在保持水平的负载[29]。总CFU也可以反映与断奶相关的变化，因为本地槽可以发现（见图2）在大约7月龄，这可能反映了在营养这一变化。这似乎有点违反直觉的，正如人们所期望再次类型的食物在饮食中引入以找到CFU的增加。然而，断奶可诱导主要乳酸代谢细菌的初始下降，而其它物质可以遵循以较慢的速率定殖结肠。

在第一年里，微生物群的组成发生了变化。大肠杆菌和Enterococci下滑,而拟杆菌属种。增加三倍。双歧杆菌婴儿粪便样本在头一年保持稳定。有别于以往许多报告[31]乳酸杆菌不是第一个月期间存在，但表示的所识别CFU一个月后的多达10％（图3.)。在文献中争论是否乳酸杆菌在早期肠道殖民者的一部分已经注意到[31]，并已表示，乳酸杆菌婴儿肠道的殖民很可能不是来自他们母亲的阴道菌群[37，而是来自母体肠道菌群。殖民与乳酸杆菌剖腹产后延迟，但据报道一个月后正常[38]。因为我们不知道出生在我们的样本航线，我们不能排除这可能是LB在我们的研究中后期发生的原因。其他原因推测[31]这种差异是在用于识别方法的不同乳酸杆菌或过去几十年殖民模式的差异，因为许多研究源自1990年以前的工作。

在余下的童年高达10岁，总CFU不断下降的水平约E11（见图4)，而个别菌株在3岁时达到稳定水平(见图)5)。这些研究结果亦支持先前的报告[4,31]。类似我们的成人样本[29]，女性有显著下大便稠度（朝向多种固体粪便）和更高粪便pH值。虽然没有被链接两项措施，他们可能表达了相同的功能。我们不能排除，不过，这可能是由于在体重和/或体重的差异。不幸的是，数据库不允许调整这一点。

我们的分析还有其他一些局限性需要解决。一是基于细菌培养的方法可能无法检测到人类微生物群的所有物种。此外，专性厌氧菌可能处于不利地位，因此，厌氧菌与好氧菌的比例可能不能反映体内的比例。然而，对传统培养分析和分子技术的直接比较产生了类似的结果，至少对最丰富的细菌是这样的[39]。其他限制包括药物摄入的临床数据缺失，比如抗生素。营养习惯和对益生菌前和益生菌产品的定期消费也可能证实了这一结果。例如，母乳喂养显著影响婴儿体内的微生物菌群，食用的配方奶粉类型和添加补充食品的时间也是如此。因此，我们只能给出这个时期所谓的“正常”人类粪便微生物群的一个近似值。此外，抗生素的使用严重影响肠道菌群。由于上呼吸道和下呼吸道的细菌感染相当常见，许多儿童在出生后第一年接受抗生素治疗。由于我们的数据集中缺少这些数据，我们不能概括我们的假设。然而，如先前的一份文件所述[29，我们报告了大量婴儿和儿童队列(假设所有患者的平均细菌丰度可能代表了婴儿和儿童时期所谓的“正常”人类粪便微生物群的近似值。

致谢

P. Enck从赞助公司获得了不受限制的研究经费来进行这项研究，他是赞助公司(德国赫伯恩的SymbioPharm公司)的顾问。K. Zimmermann, K. Rusch和A. Schwiertz是赞助公司的员工。p . Enck和j·s·弗里克设计的分析和写论文,美国Klosterhalfen进行了统计分析,k·齐默尔曼和a . Schwiertz提供微生物上的数据和细节分析,k . Rusch构思研究,并参与其设计和协调,帮助起草的手稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

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