结肠和直肠腺癌细胞周期蛋白表达和基因扩增的差异

抽象

直肠和结肠腺癌可以是关于对癌症发展的细胞生物学基础不同。在1992 - 2000年在阿克斯胡斯大学医院手术切除246个直肠癌的材料进行了研究，并进行比较的219名结肠癌的材料期间1988年，1990年和1997 - 2000年的年在阿克斯胡斯大学医院动手术。有在细胞周期蛋白D1的表达直肠和结肠的癌症之间高度显著差异，细胞周期蛋白D3，细胞周期蛋白E，核连环蛋白和原癌基因和基因扩增的细胞周期蛋白A2,细胞周期蛋白B1,细胞周期蛋白D1,细胞周期素e基因扩增和蛋白表达在直肠癌细胞周期蛋白B1显著相关,D3,和大肠之间的显著关系观察超表达的细胞周期蛋白A2和直肠局部复发癌,高表达的细胞周期蛋白A2是降低局部复发率。

1.简介

虽然直肠和结肠的腺癌在宏观和微观上外观相同，但在肿瘤发生的细胞生物学基础上可能存在差异。在之前的研究中，我们发现细胞核蛋白表达较高-catenin在直肠癌中比在结肠癌中更常见[1]，表示直肠和结肠腺癌之间的生物学差异。以来-catenin参与细胞增殖，评估参与细胞周期和细胞增殖的其他基因是否在这两种癌中表达差异很重要。

细胞周期蛋白通过结合并激活细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)来调节细胞周期。CDKs反过来磷酸化其他蛋白质。细胞周期蛋白的刺激对细胞周期的进展和细胞分裂是必需的。不同的细胞周期蛋白在细胞周期的不同阶段起作用。Cyclin D1, D2和D3与CDK4和CDK6结合。这允许细胞进入G1期[2]。与其他细胞周期蛋白相比，细胞周期蛋白D的表达在整个细胞周期中并不变化[3.]。细胞周期蛋白E与CDK2结合，使细胞从G1期进入S期[4]。细胞周期蛋白A在细胞周期中起两个不同的作用。首先，它与CDK2结合，在S期是必需的[5,6]。其次，结合CDK1等允许细胞进入M期[7]。细胞周期蛋白B与CDK1结合，使细胞周期进入M期[8,9]。

位于异常-catenin在结直肠肿瘤发生中发挥作用[10作为Wnt通路信号级联的一部分[11]。-catenin与腺瘤性息肉病大肠杆菌(APC)在肿瘤发生中的作用[12,13]。在两种突变-catenin或APC可扭曲APC正常的抑瘤作用[13]。在80%的结直肠癌中，APC基因的体细胞突变导致APC功能失常[10]。这个错误APC不能减少的细胞质水平连环[10,14]。从而增加了细胞质的水平β-连环蛋白的细胞周期蛋白D1和c-Myc通过TCF / LEF途径[诱导转录10]。

c-Myc与DNA上特定的结合位点结合，调控其他基因的转录[15]。的c-Myc的蛋白表达在结肠癌升高[16,17]。c-Myc是癌症中最常解除管制的癌蛋白之一[15,18]。

在结直肠癌患者中，细胞周期蛋白过表达与预后不良有关。细胞周期蛋白过表达的机制之一是细胞周期蛋白基因在DNA水平上的基因扩增。然而，过度表达也可能是在翻译后水平上引起的。细胞周期蛋白过表达是由基因扩增引起的，还是由细胞退化受损引起的，其预后价值可能不同。这对于cyclin A尤其重要。

直肠癌患者的临床结果历来从结肠癌患者的不同。最重要的区别一直是局部复发的频率之前照射介绍，作为术前常规治疗相当大的比例直肠腺癌。局部复发是肿瘤细胞，其中细胞周期蛋白可以发挥重要作用的“局部扩张”的结果。

本研究的目的是评估是否存在在细胞周期蛋白直肠相比结肠腺癌的表达和基因扩增的差异。我们也希望有关的直肠癌患者的预后我们的化验结果。

2。材料和方法

2.1。病人资料

对1992-2000年在阿克舒斯大学医院连续手术切除的274个石蜡包埋的直肠腺癌的所有肿瘤样本进行了仔细检查，以纳入调查。这些手术治疗均为原发性手术。我们决定只包括距肛门边缘15厘米(5.9英寸)或以下的肿瘤。(包括肛门外缘)(246例)。这个水平在临床上常用的15到18厘米的范围内，有些随意，用来界定直肠和结肠的边界。我们想要一个限制性的边界，以避免无意中纳入乙状结肠肿瘤。

将该直肠癌材料与Bondi等人1988年、1990年和1997-2000年在Akershus大学医院手术的219例结肠癌进行比较[19]。

只有在诊断出有转移的情况下，才登记癌症特异性死亡，并在死亡证明书中将癌症疾病列为死亡原因。

出的246例25有他们直肠癌的局部复发。直到发生局部复发进行从初次手术的平均时间，为2.3年。最小化时间为5个月内，最大时间6.0年。平均观察时间为患者未见复发，为6.2年。最小观察时间为0岁（2例），而最大观测时间为14.5年。

2.2。免疫组织化学

将福尔马林固定、石蜡包埋的存档肿瘤组织连续切片(3-4微米)涂于包覆切片上，免疫组化染色。在微波提取抗原(100℃20分钟)后，用细胞周期蛋白A2、B1、D1、D3和E的抗体以及C - myc和免疫染色-catenin，是根据操作规程进行的。使用Dako Autostainer (Dako Corporation, Carpinteria, CA)检测细胞周期蛋白B1, D1, E, c-Myc和β联蛋白，而染色细胞周期蛋白A和D3在本塔纳ES自动化载玻片染色（Ventana公司医疗系统，图森，亚利桑那州）进行。使用每种抗体的细节示于表1。抗体分别用Envision plus系统、二氨基联苯胺(DAB)和Ventana iView DAB检测试剂盒进行光镜观察。用Hagen的苏木精进行反染色，以显示组织结构。阳性对照为正常结肠黏膜和多种分化的结肠腺癌试验区。

阳性细胞核的百分比是通过应用四个等级免疫阳性，3，2，1的半定量计数，0。我们旨在将我们的调查结果直肠癌比较以前由邦迪等人记录在结肠癌的发现。[19,20.]。因此，我们对免疫组织化学标记选择了与他们之前使用的相同的切断。60%及以上的肿瘤细胞核染色，肿瘤分级为3级。30%到60%的核染色为2级。核染色小于30%时，为1级。无核免疫染色为0级。只有核染色清楚的被记录为阳性，除了cyclin B1，细胞质染色也符合阳性[21]。免疫染色的例子如图所示1,2,3.,4。几乎所有的幻灯片包含除了正常癌旁黏膜。充当内部对照的正常粘膜，和截止的电平设定为正常黏膜的染色水平。将载玻片由三个调查员（RAA，IRKB，和JB）独立地判断。至少100个，在各滑动检查通常超过1000个细胞。

2.3。基因扩增分析

基因组DNA从30提取 按照制造商的描述，在GenoMTM-48机器人工作站(挪威奥斯陆的GenoVision)中对福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肿瘤组织进行m切片(GenoMTM-48, Qiagen协议:使用MagAttract DNA Mini M48试剂盒从石蜡包埋的切片中分离基因组DNA, 2003年12月，GenoVision)。使用NanoDrop ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies Wilmington, Delaware, USA)测定DNA浓度。所有样本由由邻近石蜡块组织制成的苏木精和伊红染色片经光镜检查证实为75%的肿瘤组织。

为了确定基因的扩增或缺失，我们在ABI Prism 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)上使用实时PCR，软件程序为SDS2.3。Bondi等人曾描述过cyclin B1、D1、D3和E的引物和探针[20.]。应用生物系统公司商业设计了管家基因人血清白蛋白(HSA)的引物和探针(Hs99999922_s1)。Aagaard Sørby等人设计引物和探针对细胞周期蛋白A2(个人沟通)。cyclin A2的引物和探针检测均购自Applied Biosystems公司。订单号为2400949在定制TaqMan基因表达检测服务。不同细胞周期蛋白使用的引物和探针的详细信息见表2。

我们使用带有20-的96孔托盘进行细胞周期蛋白的PCR扩增含有10μL的最终反应混合物 L TaqMan通用PCR Master Mix, NoAmpErase UNG (2x)， 1L 20x试验混合物，4卫生署大号₂啊,和5L DNA (5 ng/L).对于其他细胞周期蛋白，PCR组合为2L DNA (2-7.5 ng/L), 2x TaqMan Universal PCR Master Mix from Applied Biosystems, 600 nM of forward and reverse primer and 80 nM probes for the genes cyclin B1, D1, D3, and E according to Applied Biosystems manufacturer’s instructions. The TaqMan gene expression assays for cyclin A2 and HSA contained 900 nM of forward and reverse primer and 250 nM FAM dye-labeled TaqMan probe. We added water to the total reaction volume of 20 L.所有样品作三次试验。在PCR(应用生物系统)中使用了默认的热循环条件。

为了确定细胞周期蛋白基因的DNA相对拷贝数，我们将结果归一化到每个样本的HSA水平。这一测定是用方法(22]。实时定量的阈值周期数Ct被定义为PCR扩增的指数阶段。实时PCR实验中使用的校准器为7例直肠癌患者正常直肠粘膜组织ct值的平均值。

2.4。统计

使用Windows XP上运行的spss14.0进行统计分析。采用Fisher’s精确检验、Kaplan-Meier log秩次检验、相关分析、二元logistic回归分析、Cox回归分析。我们做了考克斯分析的比例危险试验图，结果令人满意。在比较蛋白表达和基因扩增时采用皮尔逊相关。我们选择的alpha水平的统计显著性。

3.结果

患者的临床组织病理学特征见表3.。

有在细胞周期蛋白D1的表达直肠和结肠的癌症之间高度显著差异，细胞周期蛋白D3，细胞周期蛋白E，核联蛋白，和c-Myc（表4)，即使根据公爵的分期、分化程度、性别和手术时病人的年龄进行调整。

除cyclin D3外，直肠癌和结肠癌在所有细胞周期蛋白的基因扩增方面也存在显著差异(表)5)，即使根据性别、肿瘤分化程度、Dukes的肿瘤分期和手术年龄进行调整。

当评估直肠腺癌细胞周期蛋白的基因扩增水平时，我们观察到细胞周期蛋白E基因的扩增水平最高，扩增比例最大，为18%。Cyclin A2和Cyclin D1扩增率分别为9%和8%。cyclin D3和cyclin B1的扩增比例分别为2%和1%(表)6)。截止点设置为2。

在分析蛋白表达与基因扩增的相关性时，我们发现cyclin B1、cyclin D3和cyclin E的蛋白表达与基因扩增有显著的相关性，尽管相关系数很低(表)7)。cyclin A2和cyclin D1不存在显著相关性(表)7)。

我们检测了不同细胞周期蛋白、c-Myc和细胞周期蛋白表达之间的关系-catenin与直肠癌患者预后的关系在单变量分析与费雪确切检验(表8局部复发的发生与细胞周期蛋白a表达(Bonferroni调整后)。在单因素分析中，我们采用Kaplan-Meier Log等级检验(表)检查从手术到临床表现的时间9)，局部复发与细胞周期蛋白a表达显著相关(Bonferroni调整后)。我们进行多元回归分析，其中包括除患者性别，肿瘤分化程度，Dukes’肿瘤分期，手术患者的年龄，时间从手术直至临床事件的所有七个检查蛋白质。有细胞周期蛋白A2表达并减少局部复发之间的显著关联（， HR = 0.410, HR的95% CI)。的c-Myc的表达与直肠癌降低癌症特异性存活（相关， HR = 3.714, HR的95% CI，而未经辅助化疗治疗的结肠腺癌中c-Myc过表达与较高的癌症特异性生存相关(，HR =对于HR 0.353，95％CI)。

有没有在直肠癌基因扩增水平和癌症，远处转移，肿瘤特异性死亡，或淋巴结转移的局部复发之间没有显著的关系。

4。讨论

在目前的研究中,我们首次证明了蛋白表达和基因扩增的几个蛋白质对细胞周期重要进展,在结肠直肠腺癌与腺癌是不同的,即使调整为公爵的阶段,肿瘤分化等级,和年龄的病人在手术的时候。这些结果说明了结肠和直肠腺癌的不同基因表达模式和生物学机制。本研究中观察到的两种疾病之间的差异可能与两种疾病在临床实践中的临床差异有关。

cyclin A2过表达与直肠癌局部复发有统计学意义。cyclin A2表达越高，局部复发率越低。有趣的是，cyclin A2过表达在直肠腺癌中的作用与其在大多数其他癌症中的作用不同。cyclin A2的高表达可能导致乳腺癌等其他肿瘤患者预后不良[23- - - - - -49]。到目前为止，只适用于肛门癌[50可能在结肠癌中细胞周期蛋白A过表达表明了更好的临床结果。

在细胞周期蛋白A的表达对结肠癌发散的临床结果的影响报告。大多数研究发现患者在肿瘤组织中高细胞周期蛋白A蛋白表达不利的临床效果。在主要是结肠癌和在较小程度上视为一个整体，细胞周期蛋白A蛋白过度直肠癌两种材料用受损总体存活相关联51,52]。然而，很难准确地解释这些材料中有多大的比例[52就是结肠癌。另一个问题可能是总生存率可能不能反映癌症特异性生存率。在另一项结肠直肠癌患者的研究中，结论是相同的[53]。这三份报告均对结患者，也就是说，结肠癌和直肠癌的混合物。如果高细胞周期蛋白A的临床效果结肠癌和直肠癌之间的差异，这三项研究的解释可能有些困难。在仅结肠癌的材料高细胞周期蛋白A表示较好的存活[20.]，特别是在Dukes分期D.

还分析在该研究中的c-Myc的表达，并相比于相同蛋白在结肠腺癌中的表达。c-Myc的刺激细胞生长[54]。如果c-Myc的表达失调的细胞周期的控制，通常丢失[55]。在直肠癌患者中，较高的c-Myc表达与肿瘤特异性生存降低相关，而在未辅助化疗的结肠癌患者中，较高的c-Myc表达与较好的预后相关。

为了评估本研究检测到的细胞周期蛋白过表达是否是DNA水平扩增的结果，我们对所有的细胞周期蛋白进行了基因扩增分析。对直肠癌的基因扩增分析显示，只有cyclin B1、D3和e的基因扩增和蛋白表达之间存在显著但相对较低的相关性，而cyclin A2的基因扩增和蛋白表达之间没有相关性。早期研究表明，细胞周期蛋白的过表达不需要基因扩增[20.,56- - - - - -58]。我们的结果表明，在直肠癌中，基因扩增有助于细胞周期蛋白表达的变化。但这并没有给出一个主要的解释。因此，细胞周期蛋白在直肠癌中的表达主要受其他机制的调控。

这是很重要的，特别是关于细胞周期蛋白A2，探索背后表达的机制。已经显示的是，在细胞周期的S期细胞周期蛋白A的过表达与预后不良相关联，而在细胞周期的M期细胞周期蛋白A的过度表达与更好的预后相关。它是有理由相信引起的蛋白质的减少的降解可能会导致该蛋白质还在M-相位的累积的过表达，而过表达引起的高产量，但完整的降解过程可以在小区的S相大多作用周期。是可能的推测的细胞周期蛋白A2所造成的基因扩增可以主要作用在细胞周期的S期的过表达。因此，直肠癌，我们认为细胞周期蛋白A2蛋白过度表达主要是由蛋白质的降解受损所致。这将导致较高的周期在M期除A2浓度在S期，从而获得更好的临床结果。

大多数结肠癌，特别是那些远离脾弯曲，演变由cromosomal不稳定（CIN）途径。结肠癌的百分之十五由微卫星不稳定性（MSI）途径发展。微星癌症通常位于靠近脾曲。在零星的癌症，MSI主要是由于表观遗传沉默。有很少具有MSI [直肠癌的指示59]并且常常具有CIN [60]。其他调查只部分支持这些结果[61,62]。然而，虽然他们的方法不同于我们，除了连环[62]，在这些调查中个别结果表明直肠和结肠癌之间的差异。这是根据我们的调查结果。

5.结论

综上所述，尽管结肠直肠癌患者可能存在不同的临床预后，但有关结肠直肠癌与直肠腺癌生物学差异的调查较少。本研究是首次分别在结肠和直肠腺癌中检测对细胞周期调节重要的蛋白质的研究之一。结果显示直肠腺癌和结肠腺癌之间的生物学差异。这项研究表明，有必要分别检查这两种疾病实体。这些生物学上的差异可能会对结肠直肠癌患者的治疗计划产生重大影响。

承认

作者欣然承认兰迪Bjørndalen的技术援助和Tove诺尔。

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