用新研制的免疫磁珠改善粪便中脱落的结肠镜细胞的恢复

摘要

我们证明了从粪便中分离出结肠镜细胞的新方法的可行性。为了降低成本，提高粪便中结肠镜细胞的回收率，我们尝试研制新型免疫磁珠。制备了几种尺寸的磁珠，并标记了抗EpCAM的单克隆抗体。我们制作了几个新的针对EpCAM的单克隆抗体，每个单克隆抗体都被标记在磁珠上。在模拟过程中，使用最小的珠粒获得了HT-29细胞的最有效回收率。同时，用对EpCAM亲和力较高的单克隆抗体标记的珠子回收率较高。将具有最高亲和力单克隆抗体的最小粒径的珠子应用于临床样本，也得到了类似的结果。新研制的免疫磁珠可能有助于从粪便中分离结直肠癌细胞，使CRC的细胞学或分子生物学诊断成为可能。

1.介绍

结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)是全球最常见的恶性肿瘤之一。CRC是癌症相关死亡的第三大原因，也是癌症相关发病率的第二大原因。但若能早期诊断并手术切除，CRC患者的生存率较高[1]。因此，为了降低与CRC相关的死亡率，开发一种能够发现早期癌症的筛查试验是必要的。

粪便潜血试验已广泛用作CRC的筛查试验[2- - - - - -4]。然而，三最近的大规模研究已经表明，当在所有受试者共有结肠镜检查被用作参考标准粪便潜血检查的敏感度不是很高[5- - - - - -7]。因此，几个新系统已经开发了基于粪便中检测突变的DNA [诊断结肠直肠癌8- - - - - -19]。但是，这些方法很耗时，而且不够敏感。造成这种不准确的主要原因是，粪便中的核酸来自数量巨大、种类繁多的细菌和正常细胞。因此，来自癌细胞的基因在粪便中所占的比例通常至多为1%。9]。这使得基因检测方法的临床应用变得困难。

此前，我们报道了癌细胞在粪便保持存活，并且可以从自然抽空粪便使用免疫磁珠的方法，我们开发了分离[20.,21]。从粪便中分离的细胞中提取DNA，检测与crc相关的基因改变，诊断敏感性为71%(82/116)，特异性为88% (73/83)[21]。

这些数字是相对令人满意的，但是从粪便中分离细胞的数目不很高，此外，可商购的免疫磁珠是相对昂贵的。在此背景下，提高免疫磁珠的功能从自然排出的粪便检索结肠和减少这种方法的性价比，我们试图开发新的免疫磁珠，并评估其有效性。

2.材料和方法

2.1。免疫磁珠

首先，我们准备了三种不同尺寸的磁珠（3.0，4.9和5.9 μm).使用市面上有售的抗人EpCAM单克隆抗体(mAb) VU-1D9 (AbD血清tec, Oxford, UK)标记不同大小的珠子(见表)1)。简单地说，以磁性流体中提取的超磁性氧化铁和聚合物微球为原料制备了用于细胞分离的磁珠。制作不同尺寸的磁珠，均匀的聚合物微球，直径为1.8,3.3,3.9μ用机械剪应力在m表面涂上氧化铁。然后通过甲基丙烯酸缩水甘油酯在复合珠上聚合，在复合珠上覆盖亲水聚合物层。聚甲基丙烯酸缩水甘油酯层水解后，在层中引入tosyl基团作为抗体偶联的活性基团。所得磁珠的大小分别为3.0、4.9和5.9μm基于电子显微镜观察(见图)1(a))。

用两步反应将抗体固定在珠子上。首先，利用抗体的氨基基团将一个抗疟抗体IgG单克隆抗体与该珠结合。100微克山羊antimouse IgG (Fc;(Millipore Corporation, Billerica, Ma, USA)加入1ml 1wt %的珠悬液，置于0.1 M硼酸盐缓冲液(pH 9.5)中，在37下反应24小时^°C。一个fter the elimination of uncoupled antibodies through repeated washing with TBS-T (25 mM Tris-buffered saline, pH 7.2, containing 0.01% Tween 20), anti-EpCAM mAb was immobilized on the bead as a second step. Twenty micrograms of commercially available anti-EpCAM mAb, VU-1D9, were added to 1 mL of 1 wt% bead in TBS-T and mixed for 1 hour at room temperature. After the reaction, uncaptured antibody was washed away with TBS-T and stored at 4^°直到使用C。

接下来，我们才能获得的抗体与抗EpCAM的亲和力更高制定了新的抗人EpCAM的单克隆抗体。重组人EpCAM / Fc嵌合体（R＆d系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）用作免疫原。The antigen (0.1 mg) was mixed with complete Freund's adjuvant (Difco, Detroit, Mich, USA) and injected intraperitoneally (IP) into BALB/c mice (Charles River Japan, Shizuoka, Japan). Subsequent injections were made using an RIBI adjuvant system, MPL  +  DM emulsion (Corixa, Seattle, Wash, USA) every three weeks for a total of 7 times. Three weeks later, the mice were given an intravenous (i.v.) booster injection of 0.1 mg of the antigen in phosphate buffered saline. Three days later, spleen cells from the immunized mice were fused with myeloma cells (P3X63Ag8.653) at a ratio of 7:1 in 50% polyethylene glycol 4000 (Sigma, St. Louis, Mo, USA) in RPMI 1640 at room temperature for 1 minute. After centrifugation, the cells were pelleted, washed, resuspended in RPMI 1640 containing 10% NCTC 109, 20% FCS, and 50 ng/L of mouse IL-6 (R&D Systems), and plated in flat-bottomed 96-well tissue culture palates (Costar Corning, Corning, NY, USA). Following overnight incubation in a humidified 5% CO₂气氛在37^°加入C, hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)培养基开始选择HAT。将杂交瘤克隆培养8天后，在涂有抗原的Maxisorp微效板(Nunc, Roskilde, Denmark)上用ELISA方法检测培养基特异性抗体的产生。简单地说，一种未稀释的杂交瘤培养上清被添加到抗原包衣孔。经过1小时的孵育和随后的洗涤循环，添加适当稀释过氧化物酶标记的兔IgG (Bethyl Laboratories，蒙哥马利，美国，阿拉巴马)到小鼠IgG试剂。用H检测酶联IgG的结合₂Ø₂和邻苯二胺底物溶液。使用SpectraMax Plus微板分光光度计(Molecular Devices, Sunnyvale, Calif, USA)自动测量颜色强度。用96孔培养板限制稀释法克隆ELISA阳性杂交瘤细胞，建立稳定的杂交瘤细胞。

使用MONO的Ab-ID KIT（Zymed公司，旧金山，加利福尼亚，USA）根据制造商的说明书测定mAb的同种型。腹水从用每种mAb的杂交瘤克隆注射原始引发的CD1-Foxn1nu小鼠（Charles River日本）获得的。免疫球蛋白G是单独使用蛋白G亲和层析（GE医疗集团生命科学，新泽西州皮斯卡塔韦，USA）各腹水样品纯化。的纯化的IgG级分用于进一步的表征和评价它们的反应性。The immunoglobulin concentration was determined by measuring the absorbance at 280 nm using an extinction coefficient of 1.38 for mouse IgG.

使用BD FACSCalibur (BD, Franklin Lakes, NJ)流式细胞术分析新开发的抗人EpCAM单克隆抗体与EpCAM的亲和性。HT-29细胞和UMUC-3细胞分别作为EpCAM阳性对照和阴性对照。使用Zenon小鼠IgG标记试剂盒(Molecular Probes, Eugene, Ore, USA)根据说明书直接对抗人EpCAM单克隆抗体和非特异性小鼠IgG1进行标记。

最后，新的抗人EpCAM的的mAb缀合的在本研究中选择的磁珠的最佳尺寸（见表1)。

2.2。模拟

利用先前建立的方法进行模拟，以确定回收HT-29结直肠癌细胞的最佳bead条件[21]。简单地说，2克粪便样本在Hanks-HEPES-胎牛血清缓冲液(40 mL)中均质，包括Hanks溶液、10%胎牛血清(胎牛血清)和25 mM HEPES缓冲液(pH 7.35)，使用Stomacher每分钟200次，持续1分钟(Seward, Thetford, UK)。共1×10⁵将HT-29细胞加入匀浆溶液中，用尼龙过滤器(孔径512)过滤μm).使用80提取HT-29细胞μL的几个免疫磁珠，和混合物孵育30分钟的温和滚动条件下，在室温。磁铁上的混合物在室温下摇床上孵育15分钟。然后,上层清液被删除和检索使用NucleoCounter细胞数(ChemoMetec a / S, Allerød、丹麦)。

最后，为了确定最佳的免疫磁珠，使用这些免疫磁珠检索HT-29结直肠癌细胞，然后将细胞磁珠复合物固定并使用papanicolaou染色。

2.3。结直肠癌患者

从2007年3月至2008年7月，40例经组织学证实的结直肠癌患者被纳入本研究。从2007年3月到2007年9月，40名患者中有19名参与了一项研究，以分析最佳的珠子大小。然后，从2007年10月到2008年7月，40名患者中的21名参与了一项评估抗体质量的研究。所有患者都在日本东京的国立癌症中心医院接受了原发癌症的手术切除。所有患者都被充分告知了研究的内容，并提供了他们参与研究的书面同意书。该研究得到了日本国家癌症中心机构审查委员会的批准。

2.4。临床评价

在手术切除之前，我们从结直肠癌患者那里获得自然排泄的粪便样本。每个粪便样本被分成2克样本，用于评价几个不同大小和EpCAM抗体亲和力不同的免疫磁珠。粪便样本按照模拟部分所述制备。从粪便中分离的结肠镜细胞储存在−80^°C，直到基因组DNA提取。

使用Allprep迷你试剂盒(QIAGEN, Valencia, california, USA)根据说明书从粪便中分离出的结肠菌细胞中提取基因组DNA。

为了进行基因组DNA分析，我们锁定了人类Alu重复序列的一致序列。本实验使用的Alu引物和探针序列为:正向引物，5^′-TAGTAGAGACGGGGTTTCACCTTG-3^′;反向引物5^′-AGCTTGCAGTGAGCCGAGAT-3^′;探头，5^′-GAGAATGGCGTGAA-3^′。记者在五点染了色^′-探针末端为FAM，骤冷染料在3处^′端是MGB。

用于基因组DNA分析的反应混合物为4μ模板DNA的L次方，10μL of TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster, Calif, USA), 500 nM of forward and reverse primers, and 250 nM of probe in a total reaction volume of 20 μL. Real-time PCR扩增采用95℃预循环热活化^°温度保持20秒，然后在95℃变性25次^°下3秒，并在62退火/延伸^°在应用生物系统7500 Fast Real-Time PCR系统(应用生物系统)中检测30秒。使用连续稀释TaqMan对照基因组DNA(应用生物系统)的标准曲线(10 ng至100 fg)测定每个样品基因组DNA的绝对定量。阴性对照(无模板)运行在每个反应板。

2.5。统计分析

使用Tukey-Kramer多重比较测试分析各组细胞检索率。采用双侧Mann-Whitney U检验确定新免疫磁珠的细胞检索能力的统计学差异。使用StatView Ver. 5对Windows (Abacus概念，伯克利，加州，美国)进行统计分析。的值P<。有统计学意义。

3.结果

3.1。模拟研究中使用不同大小磁珠的结肠镜细胞的回收率

我们成功制备了三种不同大小的磁珠。珠子A、珠子B和珠子C的大小分别为3.0、4.9和5.9μ米，分别为（见表1和图1(a))。要确定的磁珠细胞回收，磁珠被标记用市售的单克隆抗体各种大小的最佳尺寸，VU-1D9（见表1)。在模拟中，A珠、B珠和C珠的细胞回收率为(%, mean ± SD),,,分别。使用珠子A(最小尺寸)的回收率明显高于使用珠子B (P  =  .0001) and beads C (P<。0001) (see Figure1(b))。显微镜观察还表明，HT-29细胞用新开发的免疫磁珠捕获，并且更多的HT-29细胞结合至珠子的比较大的珠B和珠C（见图1（C））。

3.2。新型抗epcam单克隆抗体

我们开发了三种新的抗EpCAM单克隆抗体，命名为克隆1-2，克隆B8-4和B8-7克隆。使用表明，克隆1-2的亲和力比非特异性小鼠IgG1的高3倍HT-29细胞（阳性对EpCAM的抗原）流式细胞术分析，而克隆B8-4和B8-7的亲和力分别为500倍比非特异性小鼠IgG1的更高（见图2(a))。克隆1-2、B8-4、B8-7对UMUC-3细胞的亲和力(EpCAM抗原阴性)与非特异性小鼠IgG1对UMUC-3细胞的亲和力几乎一致。这些结果表明克隆1-2是低亲和性单克隆，克隆B8-4和B8-7是高亲和性单克隆(见图)2(a))。然后每个抗体偶联到最佳尺寸(3.0)μm)的磁珠(见表)1)。

3.3。结肠细胞的回收率取决于单克隆抗体的EpCAM的仿真研究中的亲和

在模拟中，采用珠细胞回收率D，E和F(%, mean ± SD),,,分别。使用珠的回收率d比使用珠E被显著降低（P<。0001) and beads F (P<。0001) (see Figure2(b))。

3.4。新研制的免疫磁珠在临床标本中的细胞检索能力

在根据珠子大小检测细胞检索能力的临床研究中，使用珠子A、B和C从2克粪便中提取的DNA中位数分别为1.50 ng(范围为0.09-8.12)、0.58 ng(范围为0-4.23)和0.25 ng(范围为0-4.62)(见图)3.(a))。使用珠子A(最小的珠子)提取的DNA量与使用珠子B提取的DNA量并无显著差异(P  =  .09). However, the amount of extracted DNA using beads A was significantly higher than that using beads C (P  =  .02). Meanwhile, in the clinical study examining cell retrieval ability according to antibody affinity, the median amount of DNA from 2-gram stool using beads D, E, and F was 0.75 ng (range 0.03–3.65), 1.66 ng (range 0.12–5.74), and 0.99 ng (range 0.08–5.67), respectively (see Figure3.(b))。使用珠D提取的DNA数量明显少于使用珠E (P  =  .01).

这些结果表明，较小的免疫磁珠和与高亲和力Abs结合的磁珠在从粪便中检索结肠腺细胞方面更有效。

4.讨论

CRC从大肠粘膜开发并因此在与粪便连续接触从早期阶段。以前，我们提出了剥离成粪便可能存活在粪便中相当一段结肠直肠癌细胞，因为粪便做对结肠腔内未抑制癌细胞的扩张[20.- - - - - -22]。与此同时，我们预测与粪便接触的正常结肠粘膜细胞将处于凋亡阶段，并可能脱落成粪便。因此，到目前为止，我们试图开发一种方法，将脱落的结直肠癌细胞从自然排出的粪便中分离出来，然后用于细胞学或分子生物学诊断[21]。在目前的研究中,我们开发了新的immunomagnetic珠子和评估他们的效率而言,结直肠癌细胞粪便脱落的复苏,因为我们已认识到迫切需要改善这种隔离的方法的准确性colonocytes从粪便和降低成本的性能。

直观上看，较大的磁珠比较小的磁珠更容易被磁性物体吸引，因为较大的磁珠对应于磁珠内部较多的铁颗粒。因此，我们最初认为更多的细胞珠复合物使用更大的磁珠会附着在磁性体上，使更多的细胞被收集。然而，在一项确定最佳珠粒大小的研究中，较小的珠比较大的珠与HT-29细胞粘附更紧密(见图)1（C））。因此，被吸引到磁性体细胞 - 珠复合物的总数为当使用较小的珠显著更高。使用小珠的细胞检索率比使用较大的珠那些显著更高（见图1(b))。使用临床样品是相似的在模拟中获得的那些实验的结果（参见图3.(a))。因此，与大珠子相比，小珠子似乎更能有效地从粪便中收集结肠细胞。

在我们的流式细胞术前期实验中，我们发现EpCAM抗原在人结直肠癌细胞株DLD-1、HCT116、HCT-15、HT-29、LoVo和SW480中表达强烈。我们还分析了肿瘤组织和正常粘膜组织的阳性使用免疫组织化学。癌组织和正常粘膜组织均呈强阳性(数据未显示)。然后我们制作了几个针对人EpCAM的单克隆抗体，最终获得了与EpCAM抗原高亲和力或低亲和力的单克隆抗体(见图)2(a))。每种抗体缀合到最佳（最小）珠，并且这些免疫磁珠彼此进行了比较。In a simulation using feces seeded with 1  ×  10⁵在HT-29细胞中，高亲和抗体标记的免疫磁珠的细胞检索率优于低亲和抗体标记的免疫磁珠(见图)2(b))。这一结果表明，磁珠标记的高亲和力抗体有助于提取粪便样本中的细胞。另外，一项临床研究的结果与模拟结果相似(见图)3.(b))。

之前，我们论证了一种从自然排出的粪便中分离出结肠镜细胞的新方法的可行性，然后对结肠镜细胞进行细胞学或分子生物学分析以检测结直肠癌[21]。在免疫磁珠的改进是检测用我们的诊断方法结直肠癌最重要的问题。的Dynabeads上皮富集免疫磁珠从血清分离游离的循环癌细胞，在我们最初的方法中使用。然而，对于结直肠癌细胞从粪便的解决方案，其中包含大量的残留物质的收集开发免疫磁珠，是不允许的。因此，我们决定开发专门用于结直肠癌细胞从粪便中分离免疫磁珠。

5.结论

我们成功地开发出适合免疫磁珠的结肠的粪便排出的隔离。新的免疫磁珠，其分别为3.0 μ与一种新的与EpCAM亲和力较高的单克隆抗体偶联，可有效地从粪便中分离出结肠镜细胞。这一结果对CRC诊断的未来是有希望的。

致谢

这项工作是由支持的格兰特在急救的方案基础研究在生物医学创新研究所，教育，文化，体育，科技部探索性研究的健康科学的推广，技术的日本，和三井寿社会福利基金会。Y.古贺是从癌症研究基金会的（日本）促进研究奖学金居民对第3项综合10年战略为癌症控制的获奖者。作者感谢S.三养女士，K.井上先生，J. Izumisawa女士和Y.石原女士的技术援助和K.椎名女士的秘书协助。

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