文摘

肝脏再生的关键事件起始(LRI)是开关的肝细胞G0期G1期。本研究旨在利用大规模的定量检测和数据分析(LQDA)揭示了监管的肝细胞G0或G1期竞争LRI期间内源rna(龙头)。大鼠的肝细胞肝右叶分离0,6,部分肝切除术后24小时。使用LQDA龙头、表达水平测量,和他们之间的关系表达式,互动,和角色被龙头、综合分析显示。神经源性的表达位点切口同源蛋白3 (NOTCH3) mRNA调节0 h,但mir - 369 - 3 - p的表达和rno-Rmdn2_0006肝细胞没有明显变化。与此同时,G0 phase-related基因的表达CDKN1c提升了NOTCH3 upregulation, G1 phase-related基因的表达吗PSEN2被抑制。差别NOTCH3对这些相反,NOTCH3 mRNA的表达和rno-Rmdn2_0006调节6 h,但mir - 136 - 3 - p的表达下调。G1 phase-related基因的表达柷,DDX24、HES1 NET1,STAT3提升了NOTCH3 upregulation, G0 phase-related基因的表达吗CDKN1a被抑制。差别NOTCH3对这些这些结果表明,电抗器和NOTCH3-regulated G0期- - - G1 phase-related基因显示表达的相关性,相互作用,和角色。他们一起调节肝细胞G0期(0 h和G1期在6 h。这些发现可能有助于理解的机制,电抗器一起监管的肝细胞G0或G1期。

1。介绍

高等动物的肝脏是一个重要的器官,含有肝细胞、胆管上皮细胞,椭圆形细胞、星形胶质细胞、窦内皮细胞、枯否细胞腔隙细胞,树突状细胞等等。其中,肝细胞约占总数的80%的肝细胞和75%的肝脏的干重1]。肝脏进行各种功能如代谢、解毒、国防等等(1,2]。此外,肝脏有很强的再生能力(3]。当肝脏因手术、创伤、感染、坏死,等等,肝细胞的数量急剧减少,和各种反馈信号刺激肝细胞迅速变化从静态扩散状态,以便丢失或受损肝组织恢复,包括它的结构和功能,称为肝再生(4]。

非编码RNA (ncRNA)是一种RNA etonymeal生物体中具有重要的生理功能(5]。其中,微RNA (microRNA)是一组与长度约22个核苷酸单链RNA,它可以绑定到mRNA和抑制的作用6- - - - - -8]。例如,陈等人发现miR-21绑定到磷脂酰肌醇3、4,5-trisphosphate 3-phosphatase dual-specificity蛋白质磷酸酶(PTEN) mRNA,抑制PTEN的形成,促进肝细胞增殖和LR (8]。道等人报道,mir - 612抑制肝细胞癌的增殖和迁移作用于AKT2 mRNA (9]。陈等人发现miR-1促进细胞增殖的目标组蛋白脱乙酰酶4,但增强mir - 133细胞增殖抑制血清活性因子(10]。

与此同时,另一类ncRNA被任命为环状RNA (circRNA)。他们形成的反向连接5′和3′末端的线性RNA和包含多个microrna的结合位点,这可以作为microrna的海绵(11]。此外,circRNA展品重要生理功能(12]。例如,郭等人发现,circ_03848 circ_08236, circ_13398, circ_15013调控细胞增殖通过与几位microrna绑定13]。李等人报道,circ137和circ2270调节肝细胞增殖与mir - 127作用[14]。商等人发现hsa_circ_0005075和hsa-miR-23b-5p监管增殖,入侵和转移肝癌细胞通过circRNA-miRNA-mRNA轴(15]。

神经源性位点切口同源蛋白3 (NOTCH3),一个转录因子n端细胞外的领域,一个中间跨膜域和c端胞内域(16- - - - - -18),是一个等级的家庭。它的功能之一是调节细胞增殖(19- - - - - -24]。例如,唐等人发现的抑制NOTCH3减少了骨肉瘤细胞的细胞增殖率(19]。京等人发现,增加NOTCH3表达了杯状细胞增殖,而减少NOTCH3表达减少杯状细胞的增殖(20.]。苏等人发现NOTCH3甲基化减少细胞生存和肿瘤细胞增殖21]。哈桑等人发现nonsmall-cell肺癌细胞显示高NOTCH3水平和细胞周期阻滞NOTCH3表达式[减少22,23]。塞拉芬等人发现NOTCH3超表达促进大肠癌细胞的增殖,但细胞增殖时阻塞NOTCH3是抑制24]。

本研究发现竞争内源性rna的表达变化(龙头)高通量生物技术,分析他们的表达相关生物信息学和系统生物学方法,构建交互网络使用Cytoscape 3.2软件,显示他们的角色后,上述的检测和分析调查LR监管作用。发现rno-Rmdn2_0006和mir - 369 - 3的表达影响G0期- - - G1 phase-related基因,由NOTCH3监管和G0肝细胞的状态和G1阶段。

2。材料和方法

2.1。制备大鼠肝再生模型由三分之二肝切除术

2/3肝切除术(部分肝切除术,PH值)进行描述的希金斯(25]。男性Sprague-Dawley老鼠(年龄在10周,体重250±10 g)被用于实验。六大鼠的肝右叶被0,6,PH值和混合后24 h在相应的时间点。与此同时,虚假的操作控制(所以)成立。所有实验程序显示在这项研究中进行了“实验动物的保护和使用指南”科技部发布的中华人民共和国。

2.2。大鼠肝细胞的分离和鉴定

据徐、张(26PH值等后,老鼠在早上9:00-11:00灌注在无菌条件下。肝细胞与胶原酶消化,收集,放置在60%盐水,离心机使用Percoll (200 ,5分钟)。使用锥虫蓝染色细胞生存能力评估。细胞的荧光免疫化学纯度是评估Cy3-labeled白蛋白(铝青铜)和G6P。G0-phase肝细胞中被确认的荧光免疫化学荧光素(FITC)标记细胞增殖核抗原(PCNA)和Cy3-labeled G6P。g1期肝细胞中被确认的荧光免疫化学FITC-labeled细胞周期素D (CCND1)和Cy3-labeled G6P。s阶段肝细胞被确定荧光免疫化学和CCNA2 Cy3-labeled G6P。

2.3。大规模的信使rna定量检测

提取总RNA,核糖体RNA, RNA的完整性评估,信使RNA被检测到。2302.0大鼠基因组芯片用于检测,检测是重复三次。基因表达的比例在0和6 h与信使rna信号值计算再生肝细胞复苏后24 h PH值的控制27]。信使rna表达的差异之间的PH值,所以组计算使用F测试( 值)。的基因 值≤0.05被认为是肝regeneration-related基因。的t测试是用来计算的差异mRNA表达0和6 h后PH值( 值)(28]。当 值≤0.05,差异显著;当 值≤0.01,差异非常显著。

2.4。大规模的microrna的定量检测

提取总RNA,核糖体RNA, RNA的完整性评估,样品进行琼脂糖电泳,25个基点RNA被找回,图书馆建成,单头测序进行根据TruSeq困总RNA Ribo-Zero黄金(美国CA Illumina公司)。Q20的质量控制,消除拼接序列和序列不到15 bp和超过41 bp在长度、过滤的读取包含N基础,数据库分析,序列注释和microrna的进行定量检测。microrna的比率,相关性肝再生( 值),和表达差异( 值)计算根据“材料与方法3。”

2.5。大规模的circRNA定量检测

总RNA提取;核糖体和线性rna被移除;RNA的完整性评估;图书馆建成;circRNA测序;150/125的英国石油公司终端对(读取)获得;序列读取、匹配、量化和注释;序列可靠性验证;染色体定位;circRNA是量化。 Then, the ratio value, correlation of liver regeneration ( 值),和表达差异( 值)决定根据“材料与方法3。”

2.6。预测G0期- - - G1 Phase-Related肝再生的基因

国家生物技术信息中心(NCBI)网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和创新路径分析(IPA)软件被用来预测G0期- - - G1 phase-related基因。然后,两套预测基因整合的类型和数量列表G0 - G1-related基因。随后,他们与有意义的表达相比,微分表达式,和肝脏regeneration-related基因(表)的“材料与方法3”和基因在两个表。他们被视为G0 / G1 phase-related肝再生的基因。

2.7。肝脏再生的转录因子筛选,调节细胞G0和G1阶段

转录因子是通过筛选的列表NCBI的网站。然后,他们的信使rna与mRNA列表的“材料和方法”6这个手稿,获得显著的表达;一个重要区别是观察在LRI 0和6 h。本研究选择性地分析了NOTCH3 microrna的监管和circRNA mRNA水平。

2.8。预测G0期,受NOTCH3 G1 Phase-Related基因

Cistrome数据浏览器网站和国际音标软件被用来预测G0期- - - G1 phase-related NOTCH3监管基因。然后,从上述两个工具获得的基因整合获取列表的类型和数量的基因与G0和G1阶段由NOTCH3规定。随后,他们与有意义的表达相比,微分表达式,和肝脏regeneration-related基因(表)的“材料与方法3”在这个手稿,和两个表的基因。这些基因被认为是G0 / G1 phase-related相关基因受NOTCH3和肝脏再生。

2.9。预测NOTCH3 mRNA的microrna的绑定

国际软件和miRwalk网站(https://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)被用来预测与NOTCH3 mRNA microrna的绑定。microrna总数,命名为“理论microrna”是通过整合上述两个预测列表列出。最后,“理论microrna”与“材料和方法4”的检测结果在这个手稿。显著或极显著的microrna的表达差异0和/或6 h被发现,这被称为“检测microrna。”的分布检测microrna的切口家族获得了通过比较它与microrna的绑定切口家族的每个成员的信使rna。microrna的,只有绑定到NOTCH3信使rna被选为“目标microrna”进行分析。

2.10。交互网络建设的龙头

在这项研究中,miRNA-bound circRNA使用米兰达预测软件。目的地microrna的序列输入到microrna的米兰达(s)盒软件,紧随其后的是点击物种,老鼠,去得到匹配程度和目的地microrna和circRNA之间的结合能。microrna / circRNA对匹配度(Max分数)≥150和结合能(Max能源)≤-30人视为microrna / circRNA对。然后,相比之下,结果“材料与方法5”circRNA显著或非常显著差异表达0和/或6 h后发现,这被称为“检测circRNA。检测circRNA“比较的分布在“目的地microrna的,“我们选择circRNA,只有与后者相结合,称为“目的地circRNA,为后续分析。

2.11。交互网络建设的龙头

龙头、交互网络由Cytoscape 3.2软件。总而言之,NOTCH3 mRNA的匹配和microrna分子circRNAs绑定和海绵上市,并挽救了这些文件。然后,我们点击File-Import-Network-File和上述文件加载到分析酒吧。同时,column1被设置为源节点的分析条件和column2作为目标节点,我们点击后箱适用于获得它们的交互网络图。然后,我们点击Style-Shape调整网络图的形状,点击填充颜色调整网络图的颜色,和点击文件和导入交互的网络图。

2.12。统计分析

在这项研究中,电抗器的比率值计算的控制基因表达的信号值除以,实验组。肝再生的相对龙头、测定,电抗器和使用比例值FSPSS 17.0软件的测试。的表达差异,电抗器0 h和6 h后使用比率,电抗器和PH值进行了分析t测试在SPSS 17.0软件(28]。

3所示。结果

3.1。大鼠肝再生和肝细胞

在这项研究中,一个模型鼠的2/3肝切除术(PH)是由希金斯等人提出的方法。25]。鼠肝脏右叶是0,PH值(图。6,24小时后1(一))。肝细胞分离,和他们的信使rna, microrna, circRNAs定量检测的高通量生物技术(图1 (b))。结果表明,再生肝的增长指数与报告的结果是相一致的。同时,孤立的肝细胞的活性和纯度≥95%,G0 -的细胞化学的特点,肝细胞G1和s阶段报告(图是一致的1)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
(一)制备大鼠2/3肝切除术(部分肝切除术,PH值)模型。(b)肝细胞的识别。问,正常成年老鼠的肝脏;L,肝脏;人力资源、肝右叶;RL,再生肝;HC,肝细胞;TC,台盼蓝染色;G6P glucose-6-phosphatase;铝青铜,白蛋白; PCNA, proliferating cell nuclear antigen; CCND1, cyclin D1; CCNA2, cyclin A2; RF, red fluorescence; DAPI, blue fluorescence; GF, green fluorescence.
3.2。交互NOTCH3 mRNA的microrna、circRNAs和其他mRNA的肝细胞

分析了电抗器的结合使用miRwalk米兰达网站和软件。结果表明,131 microrna,注定与NOTCH3 mRNA,明显表示0和6 h后博士,55个microrna抑制对方后0 h和59个microrna后6 h;33个microrna提升彼此后0 h和57个microrna后6 h。相反,527年circRNAs, microrna的束缚,明显表示0和6 h后博士,189年0 h和195 circRNAs抑制对方circRNAs后6 h;200年circRNAs提升彼此在0 h和288 circRNAs 6 h。然而,21个基因与G0或G1期,被NOTCH3监管。尽管所有这些基因都包含在结果之前,并不是所有的都在本文中详细讨论。其中,8基因被抑制NOTCH3 10 0 h和基因在6 h,但4基因得到NOTCH3 0 h和6 h(表7基因1)。

表1
结合NOTCH3 mRNA的microrna、circRNAs和其他mRNA的肝细胞。
3.3。交互NOTCH3 mRNA的microrna、circRNAs和其他mRNA的鼠肝细胞

上述分析了电抗器的交互使用Cytoscape 3.2软件。结果表明:59 microrna与NOTCH3 mRNA在0 h(图2(一个)),在6小时(图382 (d))。此外,microrna 59和144年circRNAs互动形成819互动对0 h(图2 (b)),38个microrna和99 circRNAs形成互动303互动对6 h(图2 (e))。不断,NOTCH3 mRNA, 59 microrna, 819年和144年circRNAs形成互动交互对0 h(图2 (c));然而,NOTCH3 mRNA, 38 microrna, 303年和99年circRNAs形成互动交互双6 h(图2 (f))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
图2
交互的mrna, microrna circRNAs LR的肝细胞在G0和G1阶段。PH值后(a - c) 0 h;(d-f)后6 h PH值;蓝色/红色:mRNA-miRNA互动;红/绿:miRNA-circRNA互动;蓝/红/绿:mRNA-miRNA-circRNA交互。
3.4。表达的相关性NOTCH3 mrna, microrna circRNAs G0和G1阶段的肝细胞

microrna的表达相关性,circRNAs NOTCH3 mRNA的肝细胞G0和G1阶段分析了系统生物学的方法。NOTCH3 mRNA (mir - 369 - 3 - p,加上NOTCH3 mRNA)和rno-Rmdn2_0006(结合mir - 369 - 3 - p)表达变化不显著(0 h,但rno-Rmdn2_0006调节,mir - 369 - 3 - p在6小时(表表达下调2)。

表2
表达的相关性NOTCH3和NOTCH3-regulated G0期,G1 phase-related肝细胞的基因。

的碱基序列mir - 369 - 3 - p使用miRbase软件进行了分析;其序列aauaauacaugguugaucuuu(表3。同时,母源基因的分析了rno-Rmdn2_0006染色体上其网站和发现RMDN2。

表3
表达的相关性,电抗器的肝细胞0和6 h后的PH值。
3.5。表达的相关性NOTCH3和NOTCH3-Regulated G0期,G1 Phase-Related肝细胞的基因

表达的相关性NOTCH3和NOTCH3-regulated G0期,G1 phase-related系统分析了肝细胞基因的生物学方法。NOTCH3肝细胞表达变化不显著;G0 phase-inhibited基因的表达CDKN1c,由NOTCH3调节,调节0 h然而博士之后,的表达吗NOTCH3肝细胞的调节;同时,G1 phase-promoted基因的表达柷,DDX24、HES1 NET1,STAT3,受NOTCH3,调节PH值后6 h(表吗2)。

3.6。相关性与电抗器的作用和NOTCH3-Regulated G0期- - - G1 Phase-Related肝细胞的基因

这个研究表明NOTCH3 mRNA的表达,mir - 369 - 3 - p,和rno-Rmdn2_0006 PH值后并没有改变0 h,但G0 phase-related基因的表达CDKN1a表达下调,由NOTCH3抑制。同时,G1 phase-related基因的表达柷,DDX24,HES1,NET1,STAT3NOTCH3提拔的调节,这表明它们与G0期肝细胞的生理状态(0 h,图所示3)。相反,mir - 369 - 3 - p的表达,抑制NOTCH3信使rna,是表达下调后6 h博士然而,NOTCH3 mRNA的表达和rno-Rmdn2_0006调节。此外,G0 phase-related基因的表达CDKN1c是调节,由NOTCH3提拔,而G1 phase-related基因的表达吗PSEN2抑制由NOTCH3表达下调,表明它们与肝细胞的生理状态在G1期(6 h,图所示3)。


图3
龙头、相关性和G0期- - - G1 phase-related基因受NOTCH3在大鼠肝再生。0 h: 0 h后PH值;PH值后6 h: 6 h;◇:circRNA;□:microrna的;○:NOTCH3信使rna;☆:NOTCH3;△:基因由NOTCH3监管;↑:基因表达调节;↓:基因表达下调; ∣: gene expression change not significant; ⊥:inhibition; red edge: promoting G0 stage; green edge: inhibiting G0 stage; purple edge: promoting G1 phase; blue edge: inhibiting G1 phase.

4所示。讨论

大量的基因、rna和蛋白质存在于细胞中。同时,大多数的生理活动,包括肝脏再生,由上述元素的内容更改控制和复杂的相互作用和监管。尽管使用生物高通量技术获得的数据帮助理解生物过程的机制,相关技术和方法仍有局限性。在这项研究中,上述数据被用来揭示机制调节肝细胞G0或在老鼠LRI G1期,提供了令人振奋的结果。

肝细胞是肝结构和功能的主要细胞,约占总数的80%的肝细胞和肝的总重量的75%;他们最能体现和代表功能的肝组织1]。一般而言,大多数成年大鼠肝脏的肝细胞,命名为G0期。PH值在老鼠后,残余肝脏的肝细胞被迅速激活和转向G1期同步后6 h PH值;PH值24 h后,继续同步在肝细胞DNA合成,而被任命为S期(29日]。在这项研究中,2/3肝切除术(PH),肝细胞隔离,和生物高通量检测,电抗器进行无菌室,以确保实验的可靠性和避免污染干扰。肝组织的血液被灌注了PBS缓冲消除血液干涉实验结果。龙头、表达肝细胞的S期(PH值后24 h)是用作控制G0期(0 h)和G1期(6小时)分析龙头是否表达变化在大鼠肝再生有意义。所以被用作控制PH值排除操作影响肝脏再生(26,30.]。

Alquda等人发现,高度表达NOTCH3促进细胞增殖通过细胞周期蛋白31日]。的差别Kurakazu等人发现,对这些基因CDKN1a导致细胞周期阻滞(32,33]。Mademtzoglou等人发现CDKN1c可以作为一个细胞周期抑制因子。细胞增殖时停止CDKN1c高度表达,但增强的什么时候CDKN1c表达很低(34,35]。刘等人发现柷可以促进细胞G1期(36]。施等人发现DDX24细胞在增殖细胞中过表达和underexpressed逮捕[37]。王妃等人发现HES1诱导细胞增殖。NOTCH信号通路的重要成员,其表达下降可能导致减少肝脏再生水平(38- - - - - -40]。艾哈迈德等人发现的超表达净导致细胞增殖,但underexpression抑制细胞增殖41,42]。白等人发现的超表达STAT3促进细胞增殖,但扩散时被捕STAT3是抑制43,44]。Janicki等人发现的超表达PSEN2导致细胞被逮捕,但underexpression促进细胞增殖45- - - - - -47]。上述结果表明,NOTCH3表达和NOTCH3内容影响细胞阶段。

李等人发现mir - 369 - 3 - p的低表达减少软骨细胞的增殖,但高mir - 369 - 3 - p的表达促进软骨细胞的增殖(48]。必应等人发现mir - 369 - 3 - p的行动趋化因子受体CXCR4数量的增加,其表达下调表达迁徙骨髓间充质干细胞(49]。与此同时,预测使用音标软件,米兰达软件,miRwalk网站显示,mir - 369 - 3 - p与rno-Rmdn2_0006绑定。然而,rno-Rmdn2_0006不是报道的作用。我们注意到,RMDN2rno-Rmdn2_0006的父母基因,可以调节微管动力学蛋白质,研究表明RMDN2与肺癌的发病机理有关50]。在此基础上,可以推断,rno-Rmdn2_0006可能与细胞增殖密切相关。

上述结果表明,NOTCH3 mRNA PH值6 h后被释放,抑制的mir - 369 - 3 - p。此外,mir - 369 - 3 - p海绵可以作为信使rna抑制NOTCH3信使核糖核酸的翻译。因此,mir - 369 - 3 - p的表达下降导致更多NOTCH3蛋白质。后者为G1 phase-related基因的表达和抑制G0 phase-related基因的表达;因此,肝细胞仍然在G1期。相反,NOTCH3 mRNA结合mir - 369 - 3 - p 0 h后博士因此,NOTCH3没有形成,促进G1 phase-related基因的表达和G0 phase-related基因的表达的抑制NOTCH3变得困难。因此,肝细胞仍在G0阶段。结果可能有助于理解circRNA机制,microrna,信使rna调节G0或肝细胞G1期。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

信息披露

作者宣称这个手稿被贮藏在研究广场(51]。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

ZXY和xc构思。ZXY和WZH设计的研究。LYF、GH GJL JW, CCF, LJT, ZKC,我进行了研究。ZXY和WZH分析数据。ZXY、WZH LYF写的手稿。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(31572270和31572270)和中国国家青年自然科学基金(U1804186 U1404312, 31601038, 31601038, 81200317)。