文摘
背景。胎儿生长受限(FGR)是生物的损害胎儿的增长潜力,往往导致不良妊娠结局。的分子机制FGR的发展,然而,仍不清楚。本研究的目的是确定关键基因与FGR通过一个集成的生物信息学方法,探索FGR的潜在的发病机制。方法。我们下载FGR-related基因微阵列数据,使用加权基因co-expression网络分析(WGCNA),(度)的差异表达基因和蛋白质交互(PPI)网络屏幕中心的基因。GSE24129基因集是用于验证关键基因的表达水平和诊断功能。结果。加权co-expression基因网络构建和5000个基因被分成12个模块。这些模块的,蓝色的模块显示与FGR的亲密关系。度和基因的交叉在蓝色的模块关键基因,鉴定了277个基因,20 PPI网络关键基因筛选。GSE24129基因设置验证20个基因的表达,和CXCL9 CXCR3, ITGAX基因被确定为实际的关键基因。的表达水平CXCL9、CXCR3和ITGAX增加培训和验证集,和ROC曲线验证显示,这三个关键基因FGR的重要诊断能力。单基因GSEA结果表明,所有三个核心基因激活“造血细胞谱系”和“细胞粘附分子”和抑制“cGMP-PKG信号通路”FGR的发展。因此CXCL9、CXCR3和ITGAX可能与FGR的发展密切相关,可以作为FGR的潜在生物标志物的诊断和治疗。
1。介绍
胎儿生长受限(FGR),也知道太子宫内生长受限(IUGR),意味着胎儿不能达到生物增长潜力和怀孕是一种常见的并发症1]。通常是用来描述胎儿的估计胎儿体重或腹部周长小于胎龄的第十百分位(2]。众所周知,FGR胎的主要原因,围产期、新生儿发病率和死亡率。婴儿与FGR容易长期的健康问题,例如贫穷的体格生长,代谢综合征、心血管疾病、神经发育障碍,内分泌异常(3]。
FGR的发病机制与孕产妇、胎儿、胎盘、和遗传因素,其中胎盘机能不全的主要原因[4]。胎盘是一个至关重要的组织连接胎儿的母亲。如果胎盘血液灌注不足,胎儿患有慢性缺氧和降低增长率(5]。与正常对照组相比,怀孕与FGR(有或没有子痫前期)小胎盘卷和更优秀的抗子宫血流量(6]。许多类型的研究表明,绒毛膜滋养层渗透不足,缺陷产妇子宫动脉重塑,胎盘炎症与胎盘灌注不足(7- - - - - -10]。
尽管有许多FGR的发病机理,研究其具体的病理机制还没有完全阐明。目前,与快速发展的微阵列技术和高通量测序技术,生物信息学研究FGR的发病机理。在这项研究中,我们使用WGCNA探讨胎盘基因网络的特点与FGR和识别FGR发病机理的新型生物标记。
2。材料和方法
2.1。地理数据集下载和过程
工作流分析如下(见图1)。从基因表达数据收集综合(GEO)数据库(https://www.NCBI.nlm.gov/GEO)。我们使用关键字“胎儿生长受限”或“宫内生长受限”搜索FGR或IUGR基因表达谱数据库的地理。本研究筛选标准如下。(1)基因表达谱必须包括一个案例与FGR或IUGR组患者和正常对照组孕妇。(2)用于测序的组织应该是胎盘。(3)WGCNA是准确的,应该有至少15样品。(4)数据集应该包含原始数据或处理过的数据,而这些数据应该微阵列数据。最后,我们选择GSE147776 GSE24129进行进一步的研究分析,GSE147776作为发现队列和GSE24129队列进行验证。规范化数据下载后,我们过滤数据删除调查没有相应的注释和取最大值重复调查。
2.2。WGCNA
我们使用RStudio 4.1.3软件来处理所有数据,使用WGCNA co-expression网络构建的包(11]。我们选择5000个基因与平均绝对偏差值基于GSE147776 WGCNA。排除异常值样本,样本集中的分层聚类分析。确保无标度拓扑,使用相关系数阈值为0.85时,对振动的力量被选为12和最小模块大小被选为50。我们定义0.25作为阈值的降低高度合并可能类似的模块。每个模块的表达式计算模块eigengenes (MEs),以及我和临床特征之间的关系进行了分析。最后,我们选择了模块具有高相关系数与临床特征和选择这个模块的基因进行进一步分析。
2.3。度分析
度与FGR和控制组织筛选“limma”包(12]。差异基因的关键值作为| log2(褶皱变化)| > 1.5值< 0.05。用维恩图程序,重叠基因WGCNA蓝色模块的基因和度是筛选和可视化。这些重叠的基因被确定为核心基因。
2.4。基因功能富集分析中心
基因本体论(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)通路富集分析使用“clusterProfiler”R包重叠基因(13]。调整值< 0.05被认为是显著的。
2.5。PPI网络建设和中心基因识别
构建基因行动网络,277年中心基因字符串映射到数据库(https://string-db.org/)。然后,我们CytoHubba插件用于基础Cytoscape软件(https://www.cytoscape.org/3.9.1版)构建蛋白质相互作用和想象,我们选择的最高的基因连接度为中心的基因。
2.6。基因表达的验证和有效性评估中心
验证中心基因数据集GSE24129从GEO数据库下载。FGR的核心基因的表达和正常控制胎盘组织使用“ggplot2”方案进行了分析。统计上显著的差异基因被用于进一步ROC曲线分析。绘制ROC曲线,曲线下的面积(auc)计算使用pROC”软件包评估选择基因的能力区分FGR和对照组(14]。
2.7。基因集富集分析
基因集富集分析(GSEA)进行个人中心基因分别为了进一步探索FGR的潜在的这些基因的分子功能。在数据集GSE147776,我们样品分为两组按照平均FGR的关键基因的表达并执行GSEA使用R包“clusterProfiler”值< 0.05截止准则。
3所示。结果
3.1。信息数据集
按照既定的搜索条件,我们发现两个数据集,GSE147776 GSE24129。这两个数据集的具体信息如表所示1、孕产妇和新生儿的临床信息特征(15,16)提出了表2。
3.2。加权Co-Expression网络建设和关键模块识别
找到最相关的基因与FGR特征集,我们使用了WGCNA co-expression包构建基因网络。我们首先检查基因和样本,然后对样本进行聚类分析,排除异常值,最后收集所有15 GSE147776临床样本数据集进行分析(见图2(一个))。在这个数据集,R2的频谱结构的无标度网络是在0.85,使用软阈值功率等于12,确保网络接近无标度拓扑(见图2 (b))。12 co-expression模块由WGCNA(见图2 (c))。这些模块被分成2集群(见图2 (d))。我们画了一个热图module-trait关系与FGR评估所有模块的相关性,发现蓝色模块最高与FGR正相关,所以我们选择此模块进行进一步分析(见图3)。
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3.3。度和中心基因识别
总共有437度GSE147776已确定,其中包括325调节基因和112个表达下调基因。火山的情节度如图4(一)。我们确定了277个候选基因的交叉度和WGCNA蓝色模块基因在维恩图(见图4 (b))。提取中心基因的热图显示在图中4 (c)。
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3.4。去和KEGG分析
“clusterProfiler”包是用于功能富集分析调查277年中心基因的生物学特性。在生物过程中,中心基因主要富集在T细胞活化的规定,T细胞分化淋巴细胞分化,和积极的监管和信息附着力(见图5(一个))。在细胞组件(CC),他们主要富集在质膜外的一面,collagen-containing细胞外基质,免疫突触,特定颗粒腔(见图5 (c))。分子功能,中心基因在受体配体活动主要是丰富,信号受体激活活动,细胞因子的活动,和G protein-coupled受体结合(见图5 (e))。此外,KEGG富集分析发现以下途径:cytokine-cytokine受体相互作用,造血细胞谱系,移植物抗宿主病,病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体(见图5 (b))。
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3.5。PPI网络建设和核心基因分析
在进一步的研究中,我们构建了一个PPI网络中277个候选基因数据库和可视化PPI网络使用字符串Cytoscape软件。潜在的关键基因被确定CytoHubba插件(参见图5 (d))。前20名的基因在Hubba节点收集关键基因。20国的热图中心基因如图5 (f)。
3.6。核心基因验证和有效性评估
提取的核心基因在GSE24129数据库验证,表明CXCL9, CXCR3和ITGAX在胎盘组织的表达显著增加FGR患者(见图6)。这些基因的表达水平一致匹配GSE147776的表达式。此外,ROC曲线绘制和AUC测量区分FGR的对照组;在数据集GSE147776 CXCL9的AUC是大于0.78,和CXCR3的AUC ITGAX都大于0.85,在GSE24129,所有真正的关键基因的AUC高于0.8(见图7)。
(一)
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3.7。基因集富集分析
分析潜在的分子机制的核心基因CXCL9 CXCR3, FGR ITGAX,我们使用单基因GSEA分析KEGG通路。我们发现“造血细胞谱系”和“细胞粘附分子”被激活的高表达组每个CXCL9 CXCR3和ITGAX,而“cGMP-PKG信号通路抑制(见图8),这表明这些通路可能与FGR的发展密切相关。
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(c)
4所示。讨论
死胎的FGR是一个重要的原因,新生儿死亡率和发病率(短期和长期1]。到目前为止,还没有很好的治疗方案FGR除了医源性早产(17]。FGR的最常见的因素是胎盘功能障碍;因此,本研究的样本选择都是胎盘组织,排除与合并子痫前期样品。
WGCNA可以用来有效地整合基因表达数据和特征,探索基因网络的特点,并确定监管途径和与复杂疾病相关的潜在生物标记物11]。在目前的研究中,基于WGCNA,蓝色的模块(780个基因)被确认与FGR有关,和一个额外的437个基因被确定微分基因分析。有趣的是,277年这些交叉基因丰富的免疫细胞激活,分化、细胞粘附和监管,这表明胎盘展品炎症和免疫异常。研究发现,胎盘炎症与宫内生长受限(10,18,19),这与我们的结果一致。然后,我们确定了三个关键基因(CXCL9、CXCR3和ITGAX)作为关键FGR由多个生物信息学分析和验证一个额外的独立数据集,所有三个FGR组基因高表达FGR的诊断能力。
CXCL9和CXCR3趋化因子家族的成员。CXCL9定位在人类染色体4,诱导干扰素-γ(20.]。CXCR3 G protein-coupled跨膜受体的基因位于染色体Xq13 [21]。CXCR3的配体CXCL9和CXCL10和CXCL1122]。CXCR3与配体破坏母婴免疫耐受影响互动,引发一系列的慢性炎性病变导致宫内生长受限的胎盘,胎儿死亡、流产、胎膜早破、早产(23- - - - - -25]。孕期疟疾感染导致严重的孕妇贫血和婴儿出生体重低、出生体重和多变量分析已知的预测表明,胎盘CXCL9水平升高被认为是一个重要的原因胎儿生长受限(26]。这类似于我们的研究的结果,我们发现CXCR3的表达和CXCL9在FGR升高组,他们在FGR的发展的重要因素之一。
整合素αX (ITGAX)是整合素家族的成员之一,通常作为受体细胞外基质。ITGAX与肿瘤发展密切相关,ITGAX促进c-Myc-mediated VEGF-A转录通过激活PI3K / Akt通路和绑定VEGFR2细胞膜,促进血管生成在卵巢癌的增长(27]。研究探讨不明原因复发性自然流产的关键基因靶向核糖核酸测序和临床分析确定ITGAX免疫相关的基因参与T细胞的活化和增殖和细胞因子受体相互作用[28]。然而,没有研究ITGAX和FGR的关系。我们的研究结果表明,ITGAX FGR胎盘组织和表达水平升高ITGAX参与FGR的发展,添加一个新的视角来研究FGR的机制。
最后,我们还调查了CXCL9的生物功能,CXCR3和ITGAX。GSEA透露,CXCL9、CXCR3和ITGAX可以激活“造血细胞谱系”和“细胞粘附分子。“研究表明,细胞粘附分子参与了增殖,融合,迁移,和入侵在胎盘滋养层的形成29日],这些分子可以很容易的表达的失调导致病态的胎盘,可导致各种产科并发症如宫内生长受限(30.,31日),但确切的机制需要进一步的研究。CXCL9、CXCR3和ITGAX也抑制“cGMP-PKG信号通路,”负责监管脐带循环,和NO-induced growth-restricted女性新生儿脐静脉放松观察到与NO / cGMP通路中的不平衡(32]。
目前的研究有一定的局限性。我们探索与FGR及其生物功能相关的关键基因在GSE147776 GSE24129数据集和验证关键基因的数据集,但是我们仍然需要验证的胎盘组织中存在的分析方法,以及监管中心基因在胎儿宫内生长受限机制需要进一步研究。
5。结论
在这项研究中,我们使用WGCNA屏幕核心模块和识别关键基因为FGR的发病机制提供新的想法并提供潜在的诊断和治疗靶点。我们将随后验证本研究的发现在活的有机体内和在体外并阐明FGR的核心基因的具体机制。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者没有利益冲突的声明。
确认
作者感谢广陈教授和刘桂新阮博士的建设性的评论在这个手稿的修改。本研究由浙江省医药卫生科技项目支持浙江省卫生委员会(没有。2022 ky1410),台州科技计划项目(没有。21 ywb77)和生殖遗传学重点实验室(浙江大学),教育部,p . r .中国/浙江省妇女生殖健康重点实验室/浙江省子宫肿瘤研究中心(没有。ZDFY2017-RG / rh - 004)。