文摘

背景。饮食行为对人体通过胃的消化和肠道吸收。因此,胃的排空时间应该重点研究机制的联合治疗糖尿病的药品和食物。胃的排空功能和相关激素的分泌可能是中药的关键点。在诊所,Yunvjian是一个著名的中国传统公式对预防和治疗糖尿病。然而,Yunvjian的药理作用和机制还需要调查。客观的。评估的影响Yunvjian葡萄糖,胰岛素水平和胃排空功能和相关激素高脂肪饮食结合STZ-induced糖尿病大鼠。方法。高脂肪饮食结合STZ被用来构造2型糖尿病(T2DM)病人体内大鼠模型和收到了四周Yunvjian管理。动物被分为6组,分别为对照组,DM组,DM +阿卡波糖组,DM + YNH集团和DM + YNL组。放射性核素单光子发射计算机断层扫描(SPECT)技术被用来观察胃排空率和半空的时间;血液测试空腹胰岛素,然后计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);他进行染色检测胰岛和胃腔,进行免疫组织化学染色法检测胰腺癌的数量和形态β细胞和胃窦卡哈尔细胞,平均光密度计算;在胃窦胃饥饿素激素的表达和血清ELISA和免疫荧光检测;在胃窦GHRS mRNA的表达是通过rt - pcr方法检测到。结果。Yunvjian可以显著提高大鼠的血糖水平和胰岛素功能。与DM组相比,Yunvjian有利于低空腹血糖(FBG) ( ),葡萄糖耐量,增加和改善胰岛功能在同一时间( )。同时,相比之下,DM组(44±25.02±0.05,12.33),DM + YNH集团的排空率明显快(64.98±0.12),和半排时间缩短(26±8.29, )。每组的胃胃促生长素水平Yunvjian增加不同程度与DM组(616.2±26.23),特别是在DM + YNH组(863.51±23.76, )。相应地,胃GHSR mRNA的表达在DM + YNH和DM + YNL组显著增加而DM组( )。结论。Yunvjian可以有效地控制血糖,改善胰岛功能,这可能是其影响胃排空功能密切相关和相关激素分泌调节。

1。介绍

2型糖尿病(T2DM)病人的发病率在全球范围内和病人的数量逐年增加,而全球死亡和残疾的主要原因(1]。2019年的研究报告显示,有4.63亿年和3.74亿年糖尿病和糖耐量受损患者20到79岁,和城乡分布和DM患者的年龄分布不乐观2]。在中国,近10%的城市人口20岁以上的糖尿病患者,和70%的人不满意血糖控制(3]。因此,它是一个重要的措施来改善2型糖尿病预防和治疗糖尿病通过多个渠道而不是单纯依赖传统的降糖药物。

传统中药(TCM)有很多优势在降低血糖和调节脂质代谢紊乱的治疗DM (4,5]。草药可以提供一种更简单和更自然的方式来控制糖尿病没有任何副作用。一些草药显示有用的抗糖尿病的作用及相关机制的行动6),如西洋参和踝骨基数,被广泛应用于治疗DM,机制是深入研究[7,8]。

目前,各种研究进行了确定糖尿病的发病机理(9,10]。胃肠运动障碍是一种常见的糖尿病并发症,占大约40%的糖尿病患者(11]。肠胃不适,不仅影响病人的遵守和加重糖尿病的病情(口服降糖药物12]。文献报道糖尿病胃肠功能主要是在糖尿病胃轻瘫的后期13),和研究报告如何通过胃排空调节血糖功能限制。

Yunvjian是一个典型的中药处方,它包含五个药材:地黄Libosch(黄蜀Di),牛膝bidentata提单(妞妞Xi)、石膏地施(Gao),考察知母(μ)、知母和用麦冬百合(Mai盾)。虽然有越来越多的证据从临床和流行病学研究14,15]表明Yunvjian能有效改善糖尿病患者的血糖,机制仍需要探索。先前的研究已经证明的主要药用成分Yunvjian有降低血糖的影响16)和改善胃肠道功能(17]。动机进行本研究评估的影响Yunvjian high-die引起的糖尿病大鼠脂肪(HDF)结合链脲霉素(STZ),并进一步探索Yunvjian的改善胃排空功能。

2。材料和方法

2.1。动物

前不久雄性SD大鼠,重约100 - 150克,购自北京HFK生物科学有限公司,有限公司,提高了光的SPF实验室天安门医院、中国中医科学院(许可证号码:SYXK (Jing) 2014 - 0041年,动物伦理委员会的许可:中医药大学- 4 - 2017101201 - 4014)。适应性喂养3天前正式实验。环境温度控制在20 - 25°C,湿度55%±5%,正常光线(照明时间:7:00-19:00),免费的食物和饮用水。所有实验操作过程和喂养条件符合“实验动物管理和使用指南,”和每个实验链接最好试图减少实验动物的痛苦。

2.2。药物

Yunvjian包含五个药材:地黄Libosch(黄蜀Di),牛膝bidentata提单(妞妞Xi)、石膏地施(Gao),考察知母(μ)和知母用麦冬百合(Mai盾)。部门提供的药店,光在医院,中国中医科学院。用冷水浸泡半小时后,“煮,集中到2 g / mL药水,0.22过滤和消毒μm过滤器。我们计算老鼠的等效剂量转换因子的基础上human-rat体表面积6。成人剂量的Yunvjian 60 g,相当于6克/公斤的老鼠药材。因此,老鼠需要24 g / kg的老鼠每天药材。

2.3。实验材料

链脲霉素(STZ)从σ,购买德国。伊红染色购买从武汉Saiweier生物科技有限公司有限公司苏木精染色购买从北京Solarbio科技有限公司有限公司胰岛素受体β(E9L5V) XP®兔子马伯购买从春秋国旅,美国。从ZSGB-BIO HRP-labeled山羊antirabbit免疫球蛋白购买,北京。胰岛素检测设备(等)是购自北京北部生物学研究所有限公司有限公司99毫米TC-DTPA购买从北京Atom高科技公司,放射化学纯度≥95%。胃促生长素工具包是购自上海酶连接生物技术有限公司有限公司Anti-c-kit抗体[epr22566 - 344]从Abcam购买,UA.2×SYBR绿色qPCR大师混合(低火箭)从服务购买生物科技有限公司,有限公司,武汉。

2.4。实验分组和设计

排除有葡萄糖≥11.1更易/ L的老鼠。随机分配10大鼠对照组常规喂养,其他与高脂肪饮食喂养千卡(脂肪摄入量是60%),和高脂肪饮食是由北京HFK生物科学有限公司有限公司为4周。4周后,大鼠禁食过夜(无水)12 h,并且每个动物有3腹腔内注射1%的剂量链脲霉素20毫克/公斤,15毫克/公斤,15毫克/公斤,间隔4 h之间注入。3天后,所有老鼠都检测光纤光栅,光纤光栅≥11.2更易/ L确定2型糖尿病模型,和他们作为实验动物实验。老鼠,不符合标准的补充与STZ 10毫克/公斤1%或消除。我们继续与高脂肪饲料喂养一周稳定血糖。我们选择40个2型糖尿病大鼠,随机将他们分为以下四组,每10大鼠:DM组,DM + YNH集团(Yunv 24 g / kg), DM + YUNVL集团(Yunv 12克/公斤),和DM + Acabose (Acabose 10毫克/公斤)。每组大鼠4周每天都被强饲法。对照组和DM组有相同数量的蒸馏水。在实验过程中,光纤光栅测量同时管理之前,第一,第二,第三,四星期后药物。 Acupuncture points is selected from the tip of the tail, and the average blood glucose value of each rat is tested twice. After the blood collection, erythromycin ointment was applied to the wound site to prevent infection. We change the litter before each test to prevent the rat from hiding food in the litter from affecting the blood sugar level. The rat cannot help water for 12 h without food. After the last administration, rats in each group are fasted for 12 h, and the oral glucose tolerance test (OGTT) is performed. 1% pentobarbital sodium 3 mL/kg was injected intraperitoneally for anesthesia, the whole abdomen was opened after fixation, blood was taken from the abdominal aorta, and 2 mL was collected from the coagulation tube, left standing at room temperature for 30 min, and centrifuged atr / min 15分钟,然后把上面的血清。提取大鼠胰岛和胃窦组织。洗后用PBS、小岛和胃窦组织的一部分浸在福尔马林和储存在室温下;的另一部分胃窦组织分为低温贮藏管和存储在冰箱−80°C,供以后使用。血清胰岛素,用于进一步的生化分析和稳态模型assessment-insulin阻力(HOMA-IR): HOMA-IR =空腹血清胰岛素(μ/毫升)×空腹血糖(更易/ L) / 22.5。本研究根据国家进行动物实验中心实验动物保健和使用委员会。实验动物伦理委员会批准的方案是光在中国医院中国医学科学院。

2.5。口服葡萄糖耐量试验

4周后管理,老鼠被禁食一天晚上,和测试口服葡萄糖负荷在2克/公斤体重。血糖水平测量之前和15、30、60、90和120分钟后通过尾静脉血糖管理。曲线下的面积(auc)计算和用于评估葡萄糖耐量。

2.6。放射性核素SPECT技术检测胃排空残留率和排空率

在4周,老鼠被剥夺食物12 h和水6 h。动物没有麻醉固定在鼠板躺在他们回来。固定后,我们把4毫升的纯牛奶用核素标记锝(99 Tc-DTPA 0.5 Ci)。强饲法后,黄金标准测量胃emptying-radionuclide SPECT测量使用。我们使用4毫米针孔准直器前面单光子发射计算机断层扫描执行静态平面显像腹部的每一分钟。针孔是垂直的中心与腹部的老鼠和距离是5厘米。矩阵是128×128,采集放大倍数为3.2,每分钟收集一帧总共60帧。图像采集完成后,放射性曲线绘制的胃排空曲线,和胃排空特别软件用于数据处理得到总胃半空的时间(GET1/2)。胃排空率(%)=总放射性元素含量−最低60分钟内放射性元素内容/总放射性元素含量。

2.7。组织病理学变化的小岛和胃腔

用自来水洗组织后,我们将组织嵌入框架,从低浓度酒精高浓度酒精脱水,并把它放在二甲苯透明。我们注入熔化的石蜡包埋框,用镊子把加热组织块。我们切8μm和烤片60°C,持续15分钟。二甲苯deparaffinization(10分钟/次,2次),洗净后与PBS和梯度酒精水化。50μL (1X他染色的苏木精和伊红染色解决方案,并与中性胶密封。我们把小岛和胃窦组织形态在光学显微镜下观察,并收集图像进行分析。

2.8。免疫组织化学观察卡哈尔细胞和胰岛素的表达和形态β细胞

我们把尾巴小岛和胃窦0.5×0.5厘米,按照上述方法石蜡切片脱水,微波炉抗原热修复,把片在3%双氧水,孵化在黑暗中在室温25分钟。我们添加3% BSA一滴一滴地覆盖的组织均匀组织化学循环,并为30分钟在室温下密封。我们添加anti-c-kit和胰岛素受体β(E9L5V) XP®兔子马伯的比率1:100与PBS一滴一滴地,躺在一片平加湿盒,培养他们在一夜之间在4°C。第二天,1:2500稀释免疫球蛋白是一滴一滴地添加到覆盖组织和孵化它在室温下50分钟。我们刚做好的民建联显色溶液添加到圆,脱水,并挂载幻灯片,然后我们在显微镜下检查它,然后图像采集和分析。与苏木精是蓝色的细胞核染色,民建联的积极表达是褐黄色。

2.9。胃促生长素含量检测胃窦组织免疫荧光方法

组织是嵌入在低温恒温器的速冻表,部分的厚度是8 - 10μm, anti-Ghrelin抗体准备与PBS的比例1:100下降在片,一夜之间在4°C的环境。与PBS洗3次后,我们加入DAPI染色解决圆,与PBS洗3次,山antifluorescence淬火安装板,在黑暗中在室温下孵化了10分钟。我们在荧光显微镜下观察和收集图像。

2.10。生化试验

根据指示,我们使用胰岛素(Ins)等装备和胃饥饿素酶联免疫试剂盒检测血清胰岛素和胃促生长素水平,分别。

2.11。rt - pcr测定胃GHSR mRNA水平

RNA提取及其吸光度测定,分光光度计(NanoDrop2000)。核糖核酸的浓度是由吸光度测量的方法。利用反转录DNA合成和量化。引物见表1。PCR方法如下:3分钟酶激活步骤在95°C, 20个周期,15秒98°C, 30年代在50°C, 40年代在72°C, 10分钟在72°C。

2.12。统计方法

软件SPSS 21.0被用于处理数据。结果表示为“意味着±SE。“成对或两组连续测量数据进行了分析t以及,单向方差分析是用于比较组间,和4以证据为基础的互补, 意味着不同的是统计学意义, 代表的显著差异。

3所示。结果

3.1。Yunvjian对光纤光栅的影响、OGTT和胰岛素

光纤光栅测量每星期。建模成功后,DM组的血糖水平,DM +阿卡波糖组,DM + YNH, DM + YNL组显著高于对照组( )(数据1(一)和1 (b))。在胃内的政府的第一个星期,而DM组,每个管理组开始显示降低葡萄糖的趋势。4周,与DM组相比,光纤光栅的DM + YNH组显著低于DM组( ),而DM + YNL组的血糖水平并没有统计上的不同,DM组( )。

结果呈现在图1 (c)与对照组相比,DM组的血糖水平明显高于之前和之后填喂法( )。在30分钟,每组的血糖上升,而DM组餐后峰值,并没有持续下降。在60 - 90分钟,DM + YNH组明显不同于DM组。伴随着AUC水平显著下降( ,图1 (d))。同样,在30、60、90和120分钟,显著降低血糖水平在DM + YNH观察组( )。

数据1 (e)和1 (f)显示,与DM组相比,治疗组都显著降低( )。相比之下,HOMA-IR DM + YNH集团的价值与DM组相比显著降低( );DM + YNL Yunvjian组但无统计学差异(呈下降趋势 )。建议Yunvjian可以减少葡萄糖耐量,降低胰岛素抵抗,妨碍高血糖的发生。

3.2。Yunvjian对小岛和胰岛素的影响β细胞

他表明,DM组的小岛,小岛的数量减少,面积萎缩,排列不规则,边界与小岛尚不清楚,结构无序,小岛的细胞质较少,外分泌腺体内入侵,细胞核萎缩、分裂的一部分。DM + YNH组类似于DM +阿卡波糖,胰岛细胞略有萎缩,大约是常规的形状和边界外分泌相对明显(图2(一个))。

免疫组织化学显示胰岛的数量βDM组的细胞明显补偿增加,胰岛β肽是稀疏排列和分布不均,平均光密度的表达明显低于对照组( )。的数量β细胞DM + YNH组高于DM +阿卡波糖组,但无统计学差异的平均光密度值( ,数据2 (b)和2 (c))。没有显著改变DM + YNL组相比,DM组( )。

3.3。Yunvjian对胃窦和卡哈尔细胞的影响

图3(一个)显示了胃黏膜、黏膜下层、肌层和浆膜胃窦的老鼠有明确的结构在对照组,定期和粘膜细胞排列紧密,无病理变化。DM组,细胞的排列在胃窦粘膜层的松散和混乱,细胞间隙增大,肌肉和肌肉环明显变薄。DM + YNH组类似于DM +阿卡波糖,减少细胞间隙,没有液泡的形成,没有毛细管扩张。

c - kit受体是目前国际上使用的靶蛋白免疫组织化学染色法标记卡哈尔细胞。形态学是纺锤状褐黄色标记。的c - kit DM组比对照组显著降低(图3 (c), ),细胞萎缩,染色淡黄色。在DM +阿卡波糖组和DM + YNH集团,对细胞的数量有所下降,但形态是正常的。DM + YNL集团逐渐变得苍白,数量少,异常细胞形态(图3 (b))。

3.4。Yunvjian对胃排空功能的影响

从图4(一)可以看到,每个管理组的排空率明显高于后,DM组的管理。与对照组相比,DM + YNH集团的排空率基本接近,甚至更快。half-draining时间排空率相似。与对照组相比,DM组的half-draining时间明显较慢( )。与DM组相比,DM的half-draining时间+阿卡波糖组和DM + YNH组明显快( ),DM + YNL集团也有一个更明显的倾向于加速排空,但与DM组相比无显著差异( ,图4 (c))。

六组的胃emptying-time曲线显示在图4 (d)。图中的横轴是时间,和垂直套筒是放射性元素计数在胃里。在图中,在对照组大鼠的胃半空的时间是36分钟,和放射性核素的胃排空率是55.73%;DM组大鼠的排空曲线是无序的,和half-exhaustion没有达到,和放射性核素的胃排空率是25.81%;在DM大鼠的胃半空的时间+阿卡波糖组为13.5分钟,和核素的胃排空率为75%。DM + YNH组,胃半空的时间是23分钟,和核素胃排空率为79.09%;DM + YNL组为42.5分钟,而核素胃排空率为51.79%。

3.5。Yunvjian Ghrelin激素和GHSR信使rna

与对照组相比,糖尿病大鼠的胃胃促生长素水平显著降低(949.3±36.27和616.2±26.23, ,图5 (b)),但是血清减少的差异(873.47±60.85和722.5±4.75, ,图5 (c))。与DM组相比,胃和血清胃促生长素水平DM + Acabose组显著增加(616.2±26.23和926.9±69.85;722.5±4.75和784.01±21.74, ,数据5 (b)和5 (c))。Yunvjian管理后,胃胃促生长素水平增加,其中DM + YNH集团增加最 )。为了进一步检查Yunvjian对脑肠肽激素分泌的影响,荧光的荧光测试进行胃腔。DM组的红色荧光减弱,和红色荧光的DM + Acabose和DM + YNH比对照组增加,这表明高浓度的Yunvjian能促进胃促生长素的分泌激素,而低浓度没有明显的改变(图5(一个))。

图5 (d)显示胃饥饿素mRNA的表达在胃里的DM大鼠与对照组相比显著降低( )。与DM组相比,胃饥饿素mRNA的表达在胃里的DM +阿卡波糖组显著增加( );胃饥饿素mRNA的表达在胃里的DM + YNH和DM + YNL组也显著增加( ),和比DM +阿卡波糖组,但差异不显著( )。的影响Yunvjian调控GRSH mRNA更明显。

4所示。讨论

糖尿病是一种全身性代谢性疾病,其特征是增加葡萄糖引起的遗传、环境和其他因素(18]。随着病程继续进步,很容易导致各种并发症(19]。

二型糖尿病的主要病机是由于故障的肾,胃,脾脏器官系统根据中医理论。Yunvjian由地黄Libosch。(黄蜀Di),牛膝bidentata提单。(妞妞Xi)、石膏地施(Gao),考察知母知母。(μ)和用麦冬百合科。(梅董),这是一个经典的中医滋补肾阴的作用和清除胃热。药理研究显示,Rehjnannia需Libosch。(黄蜀Di)包含catalpol acteoside,具备生物活性如糖尿病和antiosteoporosis [20.]。研究表明,提取的牛膝bidentata提单。(妞妞Xi)台塑,显著提高INS,氮氧化物,ROS, SOD和其他指标的2型糖尿病大鼠21]。考察知母知母。(μ)及其主要部件显示抗糖尿病作用[22]。的主要活性成分用麦冬百合科。(梅董)是麦冬多糖,它已被证明对糖尿病有保护作用,心血管疾病和慢性炎性疾病(23]。因此,我们推测,Yunvjian功能控制葡萄糖代谢和缓解糖尿病的症状。

在这项研究中,DM大鼠葡萄糖耐量和空腹血糖稳定,由阿卡波糖和改善Yunvjian 4周。一样一些当前研究[24),在我们的实验中,我们发现,糖尿病大鼠的空腹胰岛素水平增加,暗示Yunvjian HOMA-IR DM大鼠。Yunvjian的活性成分,如豆甾醇、高血糖(上有一定的治疗效果25]。在这项研究中,在DM大鼠,Yunvjian治疗可以减轻胰腺细胞的损伤。我们认为这可能是其中一个原因为什么Yunvjian糖尿病的效果。

胃肠运动障碍是一种常见的糖尿病并发症,占大约40%的糖尿病患者(11]。基于证据表明Yunvjian可以调节血糖,保护胰岛β细胞,进一步澄清了干预的胃排空功能是否能有积极的效果在改善胰岛素抵抗,这可能带来新的灵感糖尿病及并发症的预防和治疗。胃蠕动的起搏细胞(26),国际刑事法庭能保持胃平滑肌的收缩和蠕动,和调节胃的自愿的有节奏的运动27]。它扮演了一个角色在传输信号的胃的排空过程中平滑肌(28]。受体酪氨酸激酶(c - kit)是维护刑事法庭的表型的关键,它可以专门观察ICC的分布和表达在胃肠道29日]。c - kit被抗体时,会发现刑事法庭不能正常发育(30.]。在这个实验中,我们用SPECT检测胃排空。这项研究表明,半排空时间在DM大鼠与对照组相比显著增加,而1 h在研究结束时,胃排空率和卡哈尔的数量明显减少。与DM大鼠相比,Yunvjian治疗可以恢复ICC的下降水平加速胃排空率。

胃促生长素主要产生于胃肠多肽(31日),也分布在器官如下丘脑、脑垂体和小岛(32]。它能促进生长激素的分泌,促进胃排空和小肠的蠕动33]。胃饥饿素也可以促进小鼠胰岛胰岛素分泌β细胞,证据表明,Ghrelin激素可以增加胰岛素分泌(34]。GHSR是G protein-coupled胃促生长素在细胞表面的受体结合。胃饥饿素激素和GHSR仅能证明其影响后结合GHSR (35]。我们的研究发现,糖尿病大鼠的胃促生长素和GHSR mRNA水平显著降低,而4周后政府Yunvjian促进胃促生长素和GHSR mRNA水平。在这项研究中,我们确认Yunvjian对糖尿病的发展,保护作用包括胃排空功能的变化。

5。结论

Yunvjian治疗可以显著改善2型糖尿病大鼠的葡萄糖代谢和胰岛功能,并能显著提高胰腺癌的形态和功能β肽。对胰腺的保护作用β肽可能在于促进胃排空功能,修复胃窦平滑肌损伤,改善细胞的数量和形态卡哈尔,和促进胃饥饿激素的释放激素和GHRS mRNA的表达水平。这项研究的结果将为进一步的研究提供基础的降糖机制和Yunvjian的药用价值。

数据可用性

研究中给出的原始数据将在本文/补充材料,进一步调查可以针对相应的作者。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有任何商业或经济关系,可能涉嫌潜在的利益冲突。

作者的贡献

Guangtong盾,耿军平魏实验设计。Guangtong盾、Wanyu罗和波高执行实验。鑫气和丹丹赵分析数据。Guangtong盾,Wanyu罗写道。丹丹赵和林高极度修订后的手稿。的最终版本的手稿被所有作者阅读和同意。

确认

本研究支持由中国国家卫生和计划生育委员会卫生局中央卫生研究项目(W2017BJ43)。