文摘

的根源蓼属植物bistorta(PB)是中国的传统药用植物材料在中国广泛使用。已经普遍用于治疗止血,消肿,腹泻,蛇咬,急性胃肠炎。然而,研究抗氧化性能和生物活性的化合物从PB是不够的。在当前的研究中,一个在线微萃取(OLME)加上一个高性能液相色谱加上2,2-nitrogen-di (3-ethyl-benzothiazole-6-sulfonic酸)联胺盐抗氧化测定HPLC-ABTS)快速分析系统提出了PB的抗氧化剂。PB样本(0.17毫克)在线提取流动相(乙腈和0.2%乙酸);120年Poroshell SB-Aq柱用于分离;然后,在线abt试验系统用于筛选抗氧化剂。最后,十个组件被发现在PB,其中,八个组件具有抗氧化活性。此外,五个组件(没食子酸,新绿酸、咖啡酸、绿原酸,和一个未知的化合物)被证明是主要的抗氧化剂相比,芦丁作为抗氧化剂标记。结果表明,发达OLME-HPLC-ABTS系统是一个简单、快速、绿色、高效的抗氧化剂的筛选仪PB,它提供了一个强大的工具,发现中药的天然抗氧化剂。

1。介绍

的根源蓼属植物bistorta(PB)是一种中国传统药用植物材料,这是在中国广泛使用。止血肿胀的影响降低,治疗急性胃肠炎、腹泻、和毒蛇咬伤1]。化学研究表明有机酸、黄酮类化合物和常用药用是其主要成分(2,3]。药理研究证明,PB有抗氧化,抗炎,抗菌,抗癌活动(3]。抗氧化活性是PB的最重要的功能之一,因为抗氧化剂的扫气过程中扮演一个重要的角色在防止自由基的有害影响。众所周知,氧化应激与老化有关,炎症和癌症,可能导致各种慢性疾病包括高血压、糖尿病、老化,和阿尔茨海默病(4,5]。PB原油萃取报道具有较高的抗氧化能力(6]。然而,PB的抗氧化成分仍不清楚。因此,筛选抗氧化剂的铅对健康产品的进一步发展很重要。

传统的筛选方法对天然抗氧化剂包括样本提取、分离、净化、生物活性测试;然而,这些过程往往费时又费力7]。最近,高效液相色谱法结合生物活性筛选方法如HPLC-ABTS / DPPH收紧已广泛应用于筛选和确认从天然产物的抗氧化剂,如Coptidis根茎,普洱茶,老鹰茶(8- - - - - -10),更快速和有效的组件筛选技术。然而,这些方法只能减少一些不必要的分离步骤,和整个过程仍然需要大量的劳动力,时间,和有机试剂。幸运的是,在线微萃取结合高效液相色谱法(OLME-HPLC)分析技术是最近开发的,申请从中药抗氧化剂的筛选11,12]。样本提取利用OLME-HPLC分析技术,由流动相,然后,原油提取由高效液相色谱分离,避免了复杂的样品提取、净化、和生物活性测试。此外,它可以方便地应用到天然材料或其他固体材料的检查,特别是对那些难以接近的药材或有价值。与离线系统相比,OLME还具有其他优势,比如最小样本污染,自动化程度更高,和更高的灵敏度13]。

在目前的研究中,OLME-HPLC-ABTS方法建立了筛选和识别PB的抗氧化剂。结果表明,十个化合物被发现在PB,和八个化合物具有抗氧化活性。其中,五大抗氧化剂进一步估计使用芦丁作为抗氧化剂标记,包括没食子酸、新绿酸、咖啡酸、绿原酸和未知化合物。

2。材料和方法

2.1。材料和试剂

PB购买安徽亳州中药城市(批号:qs - 2019 - 02年,来源:亳州,中国)和验证干根PB的作者之一(均钱博士)。凭证标本(HEC - pb - 005)沉积在东莞HEC冬虫夏草研发有限公司有限公司(东莞,中国)。

咖啡酸(批号:5334)是经上海标准生物技术有限公司(上海,中国)。芦丁(批号:100080 - 201811)是购自美国国立食品和药物控制(中国,北京)。绿原酸(批号:A22GB158496),新绿酸(批号:M07GB140938),和没食子酸(批号:Y19M8C36143)上海原液生物技术有限公司提供的有限公司(上海,中国)。

abt(批号:39828),过硫酸钾(批号:C2017065)和醋酸(高效液相色谱级;批号:B2223309)从阿拉丁(美国洛杉矶)。乙腈(高效液相色谱级;批号:880501)和甲醇(AR级;批号:2021050802)由成都Kelong化工有限公司有限公司(四川,中国)。纯化水制备Milli-Q净化系统(美国微孔,Billerica的)。所有其他化学物质和溶剂是ACS试剂级,除非另有规定。

2.2。通过离线提取制备PB解决方案

准确重量0.25克样品粉末为萃取瓶,然后加入5毫升50%甲醇。随后,粗粉中提取了20分钟30°C的超声波提取。样品溶液过滤是0.22μm HPLC-MS之前过滤(安捷伦科技)。

2.3。制备PB OLME池

PB的干粉末样本和酸洗硅藻土的比1:30。PB和酸洗硅藻土粉的混合物是称重准确(5.0毫克样品含有0.17毫克),挤进中空卫队列(3.0×4.0毫米,Phenomenex托兰斯,CA,美国),然后填满空心卫队与酸洗硅藻土柱。两端的密封过滤膜,分别。卫兵列包含样本挤进一个匹配列持有人(Phenomenex)。在线系统验证的混合标准溶液,混合样品和酸洗的角色硅藻土取代酸洗硅藻土地球。在警卫precolumn袖,一个在线萃取池形成和连接到高效液相色谱系统(六方阀(图)1)。

2.4。Mixed-Standard解决方案的准备

标准(没食子酸,新绿酸、咖啡酸、绿原酸和芦丁)分别溶解在甲醇。Mixed-standard混合解决方案由个人参考股票的解决方案。然后,我们获得了混合标准溶液与没食子酸109.26的最终浓度μ263.08 g / mL,新绿酸μ98.58 g / mL,绿原酸μ10.50 g / mL,咖啡酸μ169.98 g / mL,芦丁μ克/毫升。

2.5。abt的准备^•+解决方案

abt激进的阳离子(abt^•+)是由混合过硫酸钾溶液(水5毫米)和abt的解决方案在水)(7毫米等于体积(v / v = 1: 1)和储存在4°C在黑暗中12 h。我们用乙醇稀释溶液的吸光度在使用前750海里(约1.09,14,15]。

2.6。OLME-HPLC-ABTS自由基清除系统

OLME-HPLC-ABTS系统(图1)由两个泵(泵1,安捷伦G1311B泵;泵2聚M1912W050泵),一个注射器(安捷伦G1329B autosampler),两个探测器(探测器1:安捷伦G7117C爸爸;探测器2:安捷伦G1315C爸爸),一个安捷伦Poroshell 120 SB-Aq(50毫米×4.6毫米,2.7μm)和反应线圈(PEEK油管,1.5米×0.25毫米证件)。OLME-HPLC-ABTS系统的条件如下:(部分)OLME:样本中提取使用在线样品萃取池。萃取溶剂的流动相流速0.8毫升/分钟35°C。在线空白萃取池是用来平衡高效液相色谱系统的初始流动相的比例,而在线样品萃取池由六方连接价值的流动路径OLME-HPLC分析。提取过程是由注射3μ我的解决方案。(乙方)高效液相色谱法分离:安捷伦Poroshell 120 SB-Aq(50毫米×4.6毫米,2.7μ米)被用于样品分离。溶剂是0.2%的醋酸和溶剂B是乙腈。梯度的变化:0分钟,97%和3% B;5分钟,97%和3% B;11分钟,87%和13% B;22分钟,b . 80%和20%的流量是0.8毫升/分钟列温度维持在25°C。检测波长被设定为270 nm(0 - 4分钟)和330海里(4-22 min)。注射量是3μl(C)部分在线抗氧化分析:样品是由高效液相色谱分离后,他们与abt混合解决方案(0.4分钟/毫升),泵由泵2,反应在反应线圈(PEEK油管,1.5米×0.25毫米证件),然后,我们发现了抗氧化活性高峰在750海里。

2.7。HPLC-MS条件

离线提取解决方案是根据准备”一节2。2“对于HPLC-MS分析。相同的色谱条件OMLE-HPLC系统。HPLC-MS条件:它是由使用一个监控安捷伦6530 Q-TOF LC / MS(美国帕洛阿尔托,CA)配备了一个电喷雾电离(ESI)源操作在正负离子和安捷伦爸爸检测器(美国圣克拉拉,CA);干气(N₂8 L)流;干气350°C的温度;38 psi的喷雾器;鞘11分钟/ L的气体流速;毛细管3.5千伏的电压;喷嘴1千伏的电压。碰撞能量被设定为10 V, 20 V,分别和40 V。

2.8。抗氧化活性评价

抗氧化活性评价组件从PB -峰值(紫外探测器在750海里)是由发达OLME-HPLC-ABTS方法。我们准备一个适当的质量(mg)芦丁的梯度校正曲线的建设。校准曲线是由策划负峰地区和芦丁的质量。5使用大量的芦丁,其回归方程计算的形式y=斧头+b,在那里y和x代表的值负峰面积在750 nm和芦丁的质量,分别。

2.9。方法验证

定性分析方法的特异性验证进行了根据我(Q2)指南16]。在最近的研究中,空白的解决方案,标准溶液和样品溶液进行特异性测试(12]。同时,验证可重复性,PB样本一式三份OLEM-HPLC准备和分析的方法。相对标准偏差(RSD %)的峰面积作为重复性测量标准(10]。

3所示。结果与讨论

3.1。OLME-HPLC系统优化

离线提取效率比较,样品制备和在线样本提取进行了根据以下方法分别为“2.2.1”、“2.2.2”。获得的结果表明,山峰OLME符合离线提取峰值(数据2(一)和2(B))。此外,其中,PB样本提取两次在网上在相同条件下萃取池。由于这样的事实,第二萃取色谱稳定,没有发现残余峰(图2(C)),结果表明,样品可以完全提取第一个在线提取。提取效率高可以归因于OLME的高压系统,它允许更好的访问矩阵内的流动相,确保更好的提取(17,18]。是绿色的和有效的方法,以最少的样本消费,并可以很容易地应用到天然产物或其他固体材料的分析,尤其是对那些很难获得的样本或更有价值。

有机酸和类黄酮主要是酚类成分的铅、不同的紫外吸收,他们通常发现在不同波长(19]。测试进行了在不同检测波长(254、270、330和360 nm)选择最佳检测波长样本中包含的化合物。它表明,PB主要由没食子酸前4分钟,最好在270 nm形状。4分钟后,主要成分是黄酮类化合物,发现330海里,峰值分布很好。所以,最后的经验在目前的实验条件是可变波长(0 - 4分钟,270海里;4-22 min, 330 nm)。

3.2。方法验证

特异性试验结果表明,没有干扰峰在网络空白色谱图和参考物质的色谱峰出现在相应的位置PB色谱(数字2(D),3(一个),3 (b))。该方法是基于可重复性的峰面积的相对标准偏差值。他们不到10%。结果表明,当前的方法适用于铅的分析样本。

3.3。组件PB的识别

HPLC-MS技术被用来确定PB的组件。十峰被发现和九峰被确定通过比较与标准文献数据或MS数据。组件的识别结果在PB表中列出1。

识别的有机酸铅:有机酸是一种多酚化合物分子结构与羧基团体。一些常见的破碎损失发生的有限公司,H₂啊,和₂。的准分子离子峰2是169.0090 m / z (mh)⁻分子式,C₇H₆O₅和特征碎片离子包括125.0204 [M-H-CO₂]⁻和97.0264 [M-H-CO-CO₂]⁻。因此,峰2被推断是没食子酸(图4)。女士通过比较数据和色谱峰的保留时间与标准,是确定峰3 - 5是新绿酸(3)峰值,咖啡酸(4)峰值,分别和绿原酸(5)峰值。新绿酸和绿原酸的异构体,很难区分只有女士准分子离子。为了区分它们在未来的研究中,保留时间和女士片段进行了比较。新绿酸的保留时间短于绿原酸,和碎片离子(m / z 179)新绿酸强度高于绿原酸。这些结果符合文献[20.,21]。

类黄酮的化学结构是基于C6-C3-C6骨架。黄酮类化合物可以直接修改成羟基化的类黄酮骨架的碳原子,methylhydroxylation, C-glycosylation, O-glycosylation [22]。准分子离子峰9 m / z 463.0858 (mh)⁻C,公式₂₁H_20.O₁₂和特征碎片离子的离子峰301.0328 [M-H-Glc]⁻和151.0018 [M-H-Glc-C₈H₆O₃]⁻。因此,高峰9被推断quercetin-4′-O-glucoside(图5)[23]。比较的色谱峰保留时间和MS数据的引用24- - - - - -26),峰6 - 8和11日被确定为原花青素B2,儿茶素,quercetin-8-C-glucoside和quercetin-3-O-glucuronide分别。峰1仍然是未知的基于当前的数据。

3.4。分析PB的抗氧化剂

抗氧化活性评价组件PB是由发达OLME-HPLC-ABTS方法。abt^•+是稳定的激进的硬币通常用来评估的自由基清除能力的抗氧化剂(包括纯物质和复杂的样品)。样本与abt溶液混合后从邮报的专栏里仪器、组件与抗氧化活性反应产生的自由基阳离子abt的解决方案,形成了一个倒峰的色谱图。比较,这个方法可以区分的贡献一个抗氧化化合物的复杂样品与传统方法。在这项研究中,8 - abt峰进行检测试验,表明这些组件是PB(图的抗氧化成分3),包括未知的化合物(1′)峰值,没食子酸(2′)峰值,新绿酸(3′)峰值,咖啡酸(4′)峰值,绿原酸(5′)峰值,原花青素B2(6′)峰值,quercetin-4′-O-glucoside(最高9′)和quercetin-3-O-glucuronide(峰值11′)。

在上述色谱条件下,校准曲线y= 900.93x+ 191.54表现出良好的线性回归(R²= 0.9994)在一个相对较宽的浓度范围。五大负峰值(1′5′)量化。其他3个负峰值(9′,6′和11′)太低在内容和量化。的抗氧化活动5 -山峰被校准曲线估计。结果总结在表1。没食子酸(2′,峰值10.98±0.13毫克RE / g)和绿原酸(5′,峰值8.71±0.60毫克RE / g)是主要的抗氧化化合物,及其抗氧化活性的总贡献高达55%。另3峰,即峰值1′(未知化合物),峰值3′(新绿酸)和峰值4′(咖啡酸)与最大负值区域,提出了抗氧化活性为2.52±0.34毫克RE / g(总抗氧化活性的9.46%),1.85±0.08毫克RE / g(总抗氧化活性的7.73%)和1.74±0.07毫克RE / g(总抗氧化活性的7.45%),分别为。没食子酸已被列入2020年版中国药典的质量标志PB (16]。在最近的研究中,我们发现,绿原酸和没食子酸很重要,应该选为铅的质量控制指标。

3.5。比较发达和报告方法

与报道的比较样本提取和色谱分离的高效液相色谱方法PB表中列出2。在以前的文献中,PB样本由超声波和加热提取方法。例如,500毫克铅是超声提取和60毫升20%甲醇回流加热90分钟(2]。10000毫克铅被加热提取两次与100毫升甲醇、50%甲醇和100毫升80%(分别27]。报道了超过25毫升溶剂提取方法,花费超过200毫克样品,样品制备,需要30 - 120分钟。在当前的研究中,示例消费只有0.17毫克,和样品制备时间和溶剂消耗结合高效液相色谱分离。

高效液相色谱分析的色谱分离也很重要。常用的C18柱分离的组件从PB和分离时间通常超过40分钟(1,2,27,28]。获得一个快速分离,Poroshell列被选中在当前实验。样品溶液的分离时间还不到25分钟。

4所示。结论

在当前的研究中,抗氧化剂PB的快速筛选和确定的发达OLME-HPLC-ABTS方法。实验结果显示,10个化合物被发现从PB,和8个化合物具有抗氧化活性。其中,五大抗氧化剂被使用芦丁作为抗氧化指标估计,包括没食子酸、新绿酸、咖啡酸、绿原酸和未知化合物。分析方法还提供了确定未知的抗氧化剂的抗氧化活性的可能性来准确评估已知化合物的抗氧化活性,他们的数量,他们贡献的总抗氧化活性植物材料。此外,开发方法更适合活性物质的分析由于低价值的药材样品消耗(毫克级)。最后,作为一个环保的分析化学方法几乎没有污染,它提供了一个可能的发展方向从中药生物活性化合物的发现,进一步的质量控制研究。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(82074137,81703671),广东基础研究和应用基础研究基金会(2020号a1515011515)和广东省科技项目(2017号a020213029)。