文摘

GAGE12I肿瘤metastasis-promoting因子,可诱导胃癌细胞侵袭和迁移。我们调查了miR-28-5p瞄准GAGE12I对扩散的影响,入侵和迁移的人类胃癌细胞株sgc基地- 7901,AGS和mgc - 803。miR-28-5p的表达水平和GAGE12I被实时聚合酶链反应和免疫印迹检测,分别。细胞增殖、迁移和入侵检测通过MTT和Transwell室。miR-28-5p之间的交互和GAGE12I调查生物信息学分析和荧光素酶检测。结果表明,miR-28-5p人类胃癌细胞株的表达低于正常胃上皮细胞( )。miR-28-5p抑制细胞增殖的过度表达,入侵和迁移( )。GAGE12I miR-28-5p确认为目标。入侵细胞增殖,迁移和shGAGE12I而减少细胞转染的炒集团( )。集体,miR-28-5p消极监管GAGE12I和减少了扩散,入侵,胃癌细胞的迁移。

1。介绍

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,具有非常复杂的发病机理。胃癌的转移是一个重要的死亡原因。胃癌细胞的入侵和迁移是由不同的基因。重要的是要研究胃癌细胞的分子发病机制治疗癌症的1]。小分子核糖核酸(microrna)是一类高度保守的单链RNA,可以诱导或抑制信使核糖核酸的翻译被绑定到目标基因的信使RNA分子(2]。miR-28-5p microrna的存在于人体组织,参与肿瘤的发生。人们已经发现,这种microrna的表达在肾和结肠癌是表达下调,表明miR-28-5p可能发挥抑制作用在肿瘤(3,4]。然而,miR-28-5p在胃癌的作用和机制在很大程度上仍未知。GAGE12I肿瘤metastasis-promoting因子,可诱导胃癌细胞侵袭和迁移5]。在这项研究中,我们调查了miR-28-5p在胃癌细胞的表达水平,并学习的效果和机理miR-28-5p扩散,侵略,和胃癌细胞的迁移,以提供一个参考阐明胃癌进展的机制。

2。材料和方法

2.1。材料

人类胃癌细胞系sgc基地- 7901,AGS和mgc - 803 (6)购买从中国科学院上海细胞库;正常的胃上皮细胞GES-1从美国写明ATCC购买;逆转录工具包是购自美国热费希尔;从美国Abcam GAGE12I抗体购买;SYBR绿色实时PCR设备从上海购买Saobao生物技术;miR-28-5p模仿和模仿控制从Balmico购买生物技术;GAGE12I成分和成分控制从北京奥瑞东源生物技术。所有的实验都在一式三份。

2.2。实时PCR试验

试剂盒试剂添加到人类胃癌细胞系sgc基地- 7901,AGS和mgc - 803和正常胃粘膜上皮细胞GES-1 RNA提取。RNA被存储在一个冰箱−80°C。逆转录工具包用于得到互补。rt - pcr反应的引物是:miR-28-5p正向引物:5′gcg猫TGC TGT CTC三大′,反向引物:5′agt GCA GGG太极拳GAG GTA TT-3′。U6被用作控制(正向引物:5′ctc GCT TCG GCA GCA CATA-3′,反向引物:5′cga ATT TGC GTG柠檬酸TCCT-3′)。PCR反应由一个2×SYBR绿色混合10μL, RT 2的产物μL,正向引物和反向引物0.8μ我每个,ddH2O为6.4μl . CFX96的实时定量PCR进行实时PCR仪(美国Bio-Rad)。PCR程序是:20年代95°C, 95°C 10年代,60°C 20年代和72°C 10年代,总发行量的40倍。使用比较的量化做了Ct (2−ΔΔCt)方法。

2.3。细胞转染

国网公司- 7901细胞被播种到6孔板,每个都包含5×105细胞,5% 37°C下孵化有限公司2过夜。当细胞密度为50%,细胞转染。miR-28-5p模仿,模仿控制、GAGE12I成分或成分控制添加Opti-MEM包含245μ在室温下L和孵化20分钟。Opti-MEM孵化在37°C为4个小时。Opti-MEM摘除和细胞与PBS洗两次。RPMI1640中添加了含10%的边后卫和孵化在37°C 48小时。国网公司- 7901细胞转染miR-28-5p模仿,模仿控制,GAGE12I成分,或成分控制记录miR-28-5p, miR-NC, shGAGE12I,分别或炒组。

2.4。MTT试验

miR-28-5p和miR-NC组织细胞接种到96孔板6×10的浓度4100年/毫升μ每口井的L细胞培养基和孵化24 h, 48 h,或72 h。溴化Methylthiazolyl diphenyl-tetrazolium 10 (MTT)解决方案μL添加到每个洞,在37°C细胞孵化一个额外的4 h。浮在表面的溶液在吸收,150μL二甲亚砜(DMSO)解决方案是补充道。浮在表面的震动在低速瓶10分钟。OD值在570纳米测量酶联免疫吸附试验(ELISA)。细胞生存能力计算根据制造商的手册(7]。

2.5。Transwell室试验

入侵实验:基底膜基质溶解在4°C,和RPMI1640介质预热与基底膜基质在4°C和稀释。然后剩余液体收集的。miR-28-5p和miR-NC组织细胞接种入舱和5×104细胞被添加到每个。细胞培养24小时后,没有渗透膜消失,入侵细胞的数量是200倍显微镜下计数。

2.6。预测和目标基因的识别

根据TargetScan和Pitar生物信息学分析软件,可以GAGE12I miR-28-5p的目标基因。野生型(WT)和变异(傻瓜)荧光素酶记者向量构造根据GAGE12I 3-UTR结合位点,并与miR-28-5p模仿cotransfected为国网公司- 7901细胞,或模拟控制,分别检测荧光素酶活动的测量。

2.7。免疫印迹

miR-28-5p和miR-NC组织细胞收集的缓冲区里帕(美国热费希尔)。细胞细胞溶解在冰1 h和离心机在4°C 15分钟。浮在表面的细胞溶解产物的浓度测定采用BCA试剂盒(美国热费希尔)。每个样品溶解产物包含30μg蛋白与SDS混合加载缓冲区,煮10分钟,其次是加载到5%集中+ 12%的分离胶。最初的电压是80 V的集中凝胶,然后调整到120 V时,样品进入分离胶。电泳是持续了约1 h,和蛋白质转移到PVDF在100 V电压1 h。PVDF膜在5%牛血清白蛋白孵化1 h,然后用TBST清洗三次,加上GAGE12I抗体(1:100),或GAPDH抗体(1:100)加载控制,在4°C一夜之间,用TBST三次,然后二次抗体孵育1 h。与TBST洗后,ECL化学发光底物试剂盒(美国热费希尔)是用于发光和图像被凝胶成像仪。每个波段的灰度值进行了分析,并使用ImageJ蛋白质表达水平是半定量的分析。

2.8。统计分析

所有的实验数据进行了分析SPSS21.0软件(IBM公司,位于纽约州阿蒙克市美国)。测量数据所表达的(意味着±SD)。的统计意义的两组之间的差异进行了分析t以及。一个双向 被认为是明显不同的。

3所示。结果

3.1。在胃癌细胞低表达miR-28-5p

miR-28-5p的表达在人类胃癌细胞系sgc基地- 7901,AGS和mgc - 803均明显低于正常胃上皮细胞GES-1(图1)。国网公司的最低水平- 7901细胞体外miR-28-5p被用于以下分析。


图1
在胃癌细胞低表达miR-28-5p。注意:与GES-1相比, 。
3.2。miR-28-5p超表达的抑制增殖、迁移和入侵胃癌细胞

国网公司- 7901细胞转染miR-28-5p模仿或模拟控制,分别命名为miR-28-5p或miR-NC组。实时PCR试验的结果表明,miR-28-5p的表达显著增加在miR-28-5p组相比,在miR-NC组(图2(一个))。此外,MTT测定显示,国网公司- 7901细胞的存活率overexpressing miR-28-5p在24 h, 48 h, 72 h miR-NC显著低于细胞组(图2 (b))。此外,迁移和入侵显著降低胃癌细胞overexpressing miR-28-5p比细胞转染与模拟控制(数字3(一个)和3 (b))。

(一)
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图2
过度的miR-28-5p抑制胃癌细胞的增殖。(一)过度miR-28-5p国网公司- 7901细胞;与miR-NC相比, 。(b)的超表达miR-28-5p抑制国网公司- 7901细胞的增殖。与miR-NC相比, 。
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(b)
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图3
过度的miR-28-5p抑制胃癌细胞的入侵和迁移。(一)细胞迁移测试, 相比之下,miR-NC。(b)细胞入侵测试;与miR-NC相比, 。
3.3。GAGE12I miR-28-5p的目标

生物信息学分析使用TargetScan和Pitar软件提供的结合位点miR-28-5p GAGE12I,表明GAGE12I可能的目标miR-28-5p(图4(一))。荧光素酶进行分析来验证这个预测,显示荧光素酶的活性下降后cotransfection miR-28-5p模仿和GAGE12I-WT(图4 (b))。GAGE12I蛋白质的表达水平明显降低在国网公司- 7901细胞过度miR-28-5p(数字4 (c)和4 (d))。

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图4
GAGE12I miR-28-5p目标。(一)3′UTR miR-28-5p GAGE12I包含一个核苷酸序列互补。(b)荧光素酶报告基因测试;与miR-NC相比, 。(c)免疫印迹是用来确定GAGE12I蛋白的表达在胃癌细胞过度miR-28-5p。(d) GAGE12I蛋白表达。与miR-NC相比, 。
3.4。GAGE12I击倒对扩散的影响、迁移和入侵胃癌细胞

转染后GAGE12I成分或成分控制在国网公司- 7901细胞,GAGE12I蛋白质的表达是有效地减少shGAGE12I组的价格相比炒集团(数字5(一个)和5 (b))。的差别,对这些GAGE12I显著减少细胞增殖(图5 (c))。GAGE12I击倒后,除了入侵和迁移的胃癌细胞的数量明显减少(数字6(一)和6 (b))。

(一)
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图5
可拆卸的GAGE12I抑制胃癌细胞的增殖。(一)免疫印迹是用来确定击倒效果。(b) GAGE12I蛋白表达;与炒相比, 。(c)击倒GAGE12I胃癌细胞的存活率。与炒相比, 。
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图6
击倒GAGE12I抑制胃癌细胞的入侵和迁移。(一)击倒GAGE12I胃癌细胞迁移;与炒相比, 。(b)击倒GAGE12I对胃癌细胞的入侵。与炒相比, 。

4所示。讨论

microrna调节各种生物体的生命活动,是重要的细胞分化,代谢和增殖。目前,人们已经发现,microrna在肿瘤发生中发挥监管作用。这些microrna抑制或奖励的角色在肿瘤的生长和转移8- - - - - -10]。microrna没有编码蛋白质功能,但会影响生命活动调节目标基因mRNA的表达和转录11]。在这项研究中,我们发现miR-28-5p可以绑定GAGE12I-3′utr,和负调控GAGE12I的表达,表明GAGE12I miR-28-5p的目标基因。

miR-28-5p目前发现与肿瘤进展和密切相关的是表达下调在肝癌和b细胞淋巴瘤的研究中,这表明miR-28-5p可能是一个肿瘤抑制(12,13]。在胃癌的研究表明miR-28-5p的表达在胃癌组织减少,和miR-28-5p的表达水平与肿瘤转移密切相关,入侵14]。这项研究的结果表明,miR-28-5p在胃癌细胞的表达明显低于在正常胃上皮细胞,表明miR-28-5p的表达在胃癌下调,这是与上面的结果一致14]。本研究还证实,超表达miR-28-5p可能抑制增殖,迁移,和胃癌细胞的入侵,表明miR-28-5p在癌症的潜在治疗价值。我们假设可能与细胞周期相关的过程,细胞凋亡,epithelial-mesenchymal过渡,应该探索在未来。microrna的功能是通过调节其目标表达式。本研究首先提出GAGE12I miR-28-5p作为目标的胃癌细胞,证实了荧光素酶活性测定。

GAGE12I是计家族的一员。与胃癌的转移潜力的增加,GAGE12I的表达水平逐渐升高(5,15- - - - - -17]。目前,很少有研究GAGE12I。计家庭基因与卵巢癌的预后有关,也参与了卵巢癌的化疗耐受性。在宫颈癌GAGE7扮演antiapoptosis作用。GAGE12B可促进胃癌细胞的转移和增长(18- - - - - -22]。GAGE12I可能差别我们发现对这些抑制胃癌细胞的入侵和迁移,减少胃癌细胞的增殖,表明GAGE12I是促进胃癌进展。我们还表明,miR-28-5p监管目标GAGE12I胃癌进展。为了更好地理解,miR-28-5p在胃癌的作用和机制,体内实验应该在未来执行更复杂的条件(23- - - - - -27]。

总之,miR-28-5p的表达在胃癌细胞表达下调。miR-28-5p可以抑制扩散的过度表达,入侵,胃癌细胞的迁移。胃癌细胞发展的监管miR-28-5p GAGE12I基因的定位有关,这是很重要的机理研究胃癌创世纪和转移。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

本研究支持的社会发展指导计划在中国苏州市(没有。SYSD2019110)和国家重点实验室的项目放射医学和保护,东吴大学(没有。GZK1202009)。