文摘
客观的。探索白藜芦醇的影响(RSV)头发细胞凋亡引起的突然的感音神经性听力损失(SSNHL)及其影响lipopolysaccharide-induced HEI-OC1细胞的凋亡。方法。我们使用网络药理学方法筛选分子与RSV治疗SSNHL和分析这些分子通过《京都议定书》及其丰富生物过程和信号通路基因和基因组的百科全书(KEGG)和基因本体论(去)分析。我们选择中心基因与细胞凋亡相关的使用(PPI)分析蛋白质间交互作用在体外和分子对接验证。结果。八十个重叠基因被确定为RSV治疗SSNHL潜在目标。进一步去分析表明,生物过程主要是相关的毒性、细胞增殖和脂多糖反应。KEGG AGE-RAGE信号通路的分析表明,在糖尿病并发症,卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒感染,FoxO信号通路,PI3K-Akt信号通路,和其他炎症信号通路被集中。STAT3 AKT1,小君,TNF, TP53 MAPK3 CASP3,VEGFA筛选基因使用PPI分析为中心。apoptosis-related蛋白质TNF、CASP3 AKT1, TP53的选择在体外实验,表明mRNA RSV干预前后明显不同,确认相应的蛋白质受体可以绑定与RSV。结论。RSV主要影响预后的SSNHL通过抗炎作用,可以改善头发细胞凋亡引起的炎症因子通过多目标干预措施包括TNF、CASP3 AKT1, TP53。
1。介绍
虽然突然感音神经性听力损失(SSNHL)是一种急性感音神经性听力损失的病因不明,我们的最近的研究表明,炎症因素可能代表一个共同的病理基础SSNHL引起的各种元素(1]。细胞凋亡被认为是主要的致病SSNHL[的表现2),以及老年性耳聋(3和自身免疫性内耳病4]。细胞凋亡的耳蜗感觉毛细胞SSNHL动物模型中观察到,在体外模型和脂多糖(LPS)模型的中耳5- - - - - -7]。目前,SSNHL仍然涉及glucocorticoid-based综合治疗(8,9),但某些治疗仍无效,即使剂量的糖皮质激素是及时和充分的10]。传统观念下的“一种疾病,一个基因,一种药物,“被发现任何特定的治疗。因此,多目标涉及范围广泛的药理活性的天然产物最有可能显示潜在的优势(11]。
白藜芦醇(RSV)是一种多酚有机化合物广泛见于多种草本植物和生物活性成分的葡萄酒和葡萄汁12]。它有广泛的抗炎、抗氧化剂、神经和心血管保护作用[13]。它的分子量(MW = 228.25)较低,具有良好的血脑屏障(BBB =−1)渗透率,遵循关颖杉的五法,包括180年和500年之间的MW哒,将辛醇和水的分离系数(羊年 )低于5的数量可能的受体(使用= 3)< 10,氢键捐助者(Hdon = 3) < 514]。我们推测RSV也可能发挥治疗作用,感音神经性听力损失(SHL) blood-labyrinth障碍。许多研究发现,好的结果治疗RSV展品SHL,如老年性耳聋(3),cisplatin-induced听力损失(15),和噪音性听力丧失16]。然而,在SSNHL RSV尚未报道。
在目前的研究中,我们使用网络药理学方法筛选RSV -和SSNHL-related分子和分析这些分子及其丰富生物过程和信号通路使用京都基因和基因组的百科全书(KEGG)和基因本体论(去)分析。此外,我们选择中心与细胞凋亡相关基因通过(PPI)分析蛋白质间交互作用对分子对接进一步验证和验证的结果在体外模型LPS-induced急性听力损失。我们的研究结果表明,RSV耳蜗细胞具有保护作用的调节凋亡通路中的关键因素。当前的研究为未来奠定了基础在活的有机体内验证和临床应用,提高耐火SSNHL患者的预后。这样的分析提出了图的流程图1。
2。材料和方法
2.1。RSV-Related靶基因筛选
中医系统药理学(TCMSP)数据库的框架是基于中医系统药理学(17]。我们使用了TCMSP (http://tcmspw.com/tcmsp.php)数据库搜索RSV-related目标和使用UniProt [18)(https://www.uniprot.org)数据库获得的目标蛋白质转化为相应的基因(被定义为人类物种)。2021年3月所有数据库进行搜索。
2.2。SSNHL收购目标基因相关
我们使用了DisGeNET [19)(http://www.disgenet.org)数据库搜索SSNHL-related目标基因的发病机制。DisGeNET数据库是一个全面的平台集成和指定疾病相关基因和变异提供了从科学文献和多个数据源的数据。
2.3。潜在的药物病目标基因筛查
我们使用在线工具Venny2.1分析交叉基因(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)[20.),识别潜在RSV-SSNHL目标基因,并保存维恩图。
2.4。浓缩和KEGG分析功能
RSV-SSNHL交叉基因的名字被修改为正式的基因符号引入大卫6.8 [21)(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)和KEGG通路(22)(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)数据库。这个物种被定义为“人类”,设置为排除标准值< 0.05和问值< 0.05。
2.5。PPI的分析潜在的靶基因和基因筛查的中心
潜在的药物病目标基因导入到在线数据库字符串(23)(https://string-db.org/)进行PPI分析(0.7选择高信心),结果是输入Cytoscape软件。我们选择了前八名度中心的基因。中心与细胞凋亡相关基因为进一步选择在体外验证。
2.6。细胞培养和治疗
2.6.1。CCK-8分析
HEI-OC1细胞,由教授捐赠柴Renjie的实验室(东南大学医学院、南京,中国),培养在含10%胎牛血清的DMEM(的边后卫)和100 U /毫升青霉素。细胞被播种到96孔酶标5×10的密度3细胞/ 24小时。细胞被分为三组。第一组是培养各种浓度(0,2、5、10、25、50μg / mL)的有限合伙人(L2630σ)high-glucose DMEM培养基24 h。CCK-8工具包(A311-01/02 Vazyme、南京、中国)是用来确定最优浓度。第二组(RSV + LPS组)是使用不同浓度(0、5、10、20和40μ摩尔)RSV (hy - 16561, MCE) 12 h,然后处理有限合伙人24 h的最佳浓度。第三组是一个溶剂控制队列。所有的实验都重复三次。
2.6.2。细胞凋亡分析使用FITC /π
收集细胞,消化EDTA-free胰蛋白酶,洗两次预冷PBS。这些细胞被轻轻吹成单细胞悬液,100μL 1×绑定缓冲。膜联蛋白V-FITC (5μL)和5μL propidium碘(PI)染色解决方案添加到绑定缓冲。细胞培养在黑暗中在室温下10分钟,轻轻拌400μL 1×绑定缓冲,并受流式细胞术在1 h。总凋亡率计算如下:Q2 +第三季。
2.6.3。RT-qPCR分析
检查差异表达mrna在HEI-OC1细胞不同的治疗组,总RNA提取使用试剂盒(R401-01 Vazyme)和cDNA生成使用HiScriptII第一链cDNA合成装备(R211-01/02 Vazyme)。RT-qPCR执行使用ChamQ SYBR qPCR大师混合(Q311-02/03 Vazyme),根据制造商的指示。PCR引物被TSINGKE合成生物技术有限公司有限公司(中国,北京)和被寡核苷酸提纯净化筒(OPC)。结果如表所示1。样品进行了初始变性30年代在95°C,然后在95°C 40周期进行10年代和60°C 30年代。最后,融化曲线得到的95°C条件下15年代,60年代60°C,和95°C 15年代,每个基因重复三次。使用2变化表达式计算−ΔΔCT方法。
2.6.4。分子对接分析
分子对接模型可用于小分子之间的相互作用和蛋白质结构在原子水平。分子对接分析用于预测apoptosis-related蛋白质RSV的绑定。我们获得了RSV PubChem的三维结构数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和三维结构的apoptosis-related中心从RCSB蛋白质受体蛋白质数据库(PDB)数据库(http://www.rcsb.org/)。分子对接模拟靶蛋白受体和RSV进行使用AutoDock工具(v.1.5.6)和AutoDock七弦琴1.1.2(分子图形学实验室,斯克里普斯研究所,2011年)和使用PyMOL分子图形显示系统(v.2.4.0薛定谔,LLC) [24]。
2.7。统计分析
数据意味着±标准差(SD)。所有统计分析使用Microsoft Excel和GraphPad棱镜,7节。双尾未配对的学生的t以及用于分析涉及两组。单向方差分析(方差分析)中使用多个组两组(>),值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。筛选RSV目标基因的结果
总共有151 RSV目标蛋白质从TCMSP获得并使用UniProt back-translated成相应的基因。选择的物种是人类。这项研究的结果发表在表S1。
3.2。目标基因的筛查结果SSNHL有关
2342对应的目标基因被输入从DisGeNET数据库获得突然的疾病名称感音神经性听力损失。这项研究的结果发表在表S2。
3.3。潜在的药物病目标基因筛查结果
我们一共获得了80磕药使用在线工具Venny2.1(图交叉基因2)。
3.4。功能性浓缩和KEGG分析结果
分析表明,不良反应,细胞增殖,对有限合伙人的反应,氧化应激,炎症,和老化主要是参与细胞因子受体,受体配体活动,受体调节器活动,细胞因子的活动,和蛋白质二聚作用的活动。细胞成分主要包括膜筏、膜microdomains膜区域,核染色体,转录因子复合物(图3)。
(一)
(b)
(c)
KEGG分析表明80潜在目标基因丰富涉及92信号通路,其中10个最重要的途径包括AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症,卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒感染,FoxO信号通路,PI3K-Akt信号通路,蛋白多糖在癌症、小分子核糖核酸酸在癌症、人类巨细胞病毒感染,乙肝、MAPK信号通路,流体剪切应力和动脉粥样硬化(图4)。
3.5。PPI分析潜在的目标基因与细胞凋亡相关的排名前十的基因
我们使用在线数据库字符串分析微分基因PPI和软件分析结果导入到Cytoscape 2416相关的节点(图5(一个))。根据节点的数量≥70,STAT3 AKT1,小君,TNF, TP53 MAPK3 CASP3,VEGFA筛选(表S3)。在这些中心的基因,肿瘤坏死因子、CASP3 AKT1,TP53参与细胞凋亡通路在细胞内外。我们推测这可能发挥保护作用的头发细胞通过调节细胞凋亡通路包括TNF、CASP3 AKT1, TP53(图5 (b))。我们使用字符串数据库进一步分析肿瘤坏死因子之间的关系,CASP3 AKT1, TP53(图5 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.5.1。CCK-8分析结果
CCK-8筛选表明,有限合伙人(2μ在HEI-OC1 g / mL)可以诱导细胞凋亡细胞治疗24小时后(图6(一))。因此,我们选择2的浓度µg / mL为后续实验。我们发现,10μ摩尔RSV施加一个重要保护作用对LPS-induced HEI-OC1细胞凋亡在剂量依赖性的方式(图6 (b))。
(一)
(b)
3.5.2。FITC /π分析结果
FITC /π分析表明,有一个显著差异在HEI-OC1细胞凋亡率在不同的群体中。与对照组相比,有限合伙人干预组的细胞凋亡率显著增加,而没有显著差异RSV + LPS干预组的细胞凋亡率(图7)。
(一)
(b)
3.5.3。RT-qPCR分析结果
RT-qPCR结果表明apoptosis-related基因的信使rna表达水平在不同的组在统计学上不同:AKT1, TNF, caspase3, LPS组和TP53水平高于对照组,差异具有统计学意义,虽然RSV + LPS组无显著差异(图8)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5.4。分子对接结果
我们获得了三维结构的RSV PubChem数据库和apoptosis-related蛋白质的三维结构的目标受体RCSB PDB数据库。分子对接的潜在模拟目标蛋白质和RSV是使用AutoDock工具和七弦琴AutoDock软件生成的。最后,目标和等价组件的组合验证通过分子对接和目标之间的组合关系和等价组件使用PyMOL分子图形系统成立。我们指定TNF-RSV caspase-3-RSV AKT1-RSV, P53-RSV验证。在四个对接模拟,最低亲和力−7.8千卡/摩尔,−7.4千卡/摩尔,−6.2千卡/摩尔,−5.5千卡/摩尔(表2)。网格中心如表所示2,距离的最佳方式是0.000 rmsd第2和0.000 rmsd u.b。(图9)。
4所示。讨论
SSNHL的病因尚不清楚,可能与毛细胞凋亡和炎症反应造成的损害,病毒感染,微循环障碍,和其他因素,因为炎症会导致微血管损伤(25),动脉粥样硬化(26),和耳蜗免疫反应27];在活的有机体内实验表明,LPS-stimulated豚鼠耳蜗微循环障碍严重(28]。因此,炎症SSNHL的被认为是一个重要的原因。我们确认151潜在RSV目标从DisGeNET TCMSP和2342 SSNHL-related基因数据库。Venny分析确定了80重叠基因作为RSV治疗SSNHL潜在目标。此外,去分析显示,不良反应,所涉及的潜在目标主要是细胞增殖,有限合伙人的反应。所涉及的分子功能主要是细胞因子受体和细胞组件,包括膜筏。KEGG分析还集中在AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症,卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒感染,FoxO信号通路,PI3K-AKT信号通路和其他炎症和apoptosis-related信号通路。为了进一步了解潜在目标之间的关系,我们筛选STAT3 AKT1,小君,TNF, TP53 MAPK3 CASP3,VEGFA使用PPI中心基因分析。在这些中心的基因,肿瘤坏死因子、CASP3 AKT1,TP53参与细胞内或细胞外凋亡通路。我们确认,RSV可以改善LPS-induced HEI-OC1 TNF细胞凋亡,CASP3, AKT1, TP53多目标干预在体外。分子对接研究还发现,这些核心目标为RSV表现出良好的亲和力。
糖皮质激素是目前公认的主要治疗各种类型的SSNHL。研究表明,肿瘤坏死因子-地塞米松可以发挥保护作用α全身的细胞凋亡通过激活信号通路如PI3K / AKT和NF-kB [29日),揭示了HEI-OC1细胞保护作用的衣霉素通过抑制内质网应激(30.]。然而,某些患者仍对激素治疗,这可以通过多目标发挥有益作用涉及中药的干预。
RSV是一种天然多酚的对称二苯代乙烯骨架有许多有益的性能如抗炎、抗氧化和神经活动(13]。研究表明,RSV可以用于治疗神经退行性疾病(ND)通过多目标治疗(31日]。在这项研究中,我们选择肿瘤坏死因子、CASP3 AKT1,和TP53PPI中心基因与细胞凋亡相关的分析。肿瘤坏死因子-α是神经疾病的发生和发展密切相关。以前的研究已经表明TNF -α抑制糖皮质激素受体的功能,TNF-α突变小鼠容易高频听力损失在早期发展阶段(32),和有针对性的沉默的TNF -α有利于防止NIHL [33]。外源性和内源性通路的激活执行人caspase-3和最终的物理执行等凋亡细胞死亡(34]。研究表明,抑制还可以防止或延缓头发噪声引起的细胞死亡或氨基糖甙类35]。在低氧诱导SSNHL在体外模型中,水平cleaved-caspase-3显著增加(2]。AKT1促进细胞增殖,细胞周期蛋白和抑制细胞凋亡的调节p53 [36]。研究也表明,与年龄相关的耳蜗毛细胞凋亡相关miR-34a / SIRT1 / p53信号转导,这可能代表一个潜在的目标治疗老年性听力损失(3]。我们的研究结果表明,RSV调节肿瘤坏死因子、CASP3 AKT1,TP53mRNA水平和可能发挥保护性作用LPS-induced凋亡毛细胞的多目标规则。分子对接进一步证实了良好的对接与RSV目标蛋白质结构的性能。
我们可以选择一个相对单一数据库网络药理分析的早期阶段,但TCMSP和DisGeNET数据库中选择本研究是最具代表性的数据库。其中,TCMSP包含29384种499中国草药,3311目标,和837相关疾病与中国药典[注册17]。DisGeNET发布2019年覆盖超过24000疾病和功能,17000个基因,和117000基因组变异,覆盖了各种人类疾病和正常和异常特征(19]。的过程中在体外验证,我们发现HEI-OC1细胞的凋亡增加有限合伙人治疗后,和流动仪分析表明,细胞凋亡率明显高于对照组。RSV + LPS组的凋亡率下降,相比没有显著性差异,对照组人群。我们验证绑定涉及目标蛋白对应关键基因,通过分子对接研究RSV。此外,我们发现TNF最低结合能最低(-7.8千卡每摩尔)中四个关键apoptosis-related蛋白质,这进一步验证了SSNHL和炎症的发病机制之间的紧密联系。与先前的研究一致(1,37- - - - - -39),我们推测,RSV可能发挥保护作用的头发细胞凋亡主要通过抗炎作用。
5。结论
总之,RSV预计将是一个安全有效的多目标药物治疗SSNHL治疗。我们的网络药理分析涉及RSV预言RSV的治疗效果是由apoptosis-related通路包括TNF的规定,CASP3 AKT1, TP53。有必要通过进一步探讨RSV行动的主要机制在活的有机体内验证实验。
数据可用性
数据可以从作者在获得合理的请求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
设计方案是由WS和SY。执行实验和分析结果由SY和杰。网络药理学分析和映射由SY, QD、XXW。论文的写作和修改由SY和WS。
确认
作者感谢研究人员创建和共享数据库和在线分析平台。这项工作是由医学科学技术发展基金会支持南京卫生部(ZKX21012)。
补充材料
表S1。白藜芦醇的目标从TCMSP数据库(151年目标蛋白质得到白藜芦醇和转换成相应的微分基因)。表S2。目标的SSNHL DisGeNET数据库(2342年获得相应的靶基因)。表S3。RSV-SSNHL潜在目标和Cytoscape分析结果(共计2416 PPI分析,得到节点的节点被选为大于或等于70)。(补充材料)