文摘
许多研究发现,肠道微生物群的功能障碍和代谢功能障碍可以促进非酒精性脂肪肝病(NAFLD)发展。Er-Chen汤(EC)可以用于治疗非酒精性脂肪肝。然而,这个hepatoprotection的机制还不清楚。在这项研究中,我们构建了一个鼠模型与非酒精性脂肪肝吃高脂肪的食物和管理电子商务的治疗。EC对非酒精性脂肪肝的疗效评估通过测量转氨酶,血脂水平,并在肝脏病理变化。此外,我们测量了EC对肝脏炎症反应和氧化应激的影响。EC治疗后肠道微生物群的变化进行了研究使用16 s rRNA测序。血清的诸多代谢组学分析也用于研究的代谢调节机制EC在非酒精性脂肪肝。结果表明,电子商务降低了血清转氨酶和血脂水平和改善非酒精性脂肪肝大鼠的病理变化。此外,EC增强SOD和氧化酶的活动和减少肝脏MDA水平。 EC treatment also decreased the gene and protein levels of IL-6, IL-1β和肿瘤坏死因子-α在肝脏和血清。16 s rRNA测序和没有针对性代谢组学表明,EC治疗肠道微生物群和监管的血清代谢的影响。相关分析表明,EC牛磺酸和hypotaurine代谢的影响,半胱氨酸和蛋氨酸代谢,维生素B6代谢通路与丰度的影响有关乳酸菌,Dubosiella,Lachnospiraceae、Desulfovibri Romboutsia、Akkermansia Intestinimonas,Candidatus_saccharimonas在肠道。总之,我们的研究证实了保护EC对非酒精性脂肪肝的影响。EC可以治疗非酒精性脂肪肝通过抑制氧化应激,减少炎症反应,改善肠道微生物群的失调和调制的牛磺酸和hypotaurine新陈代谢,半胱氨酸和蛋氨酸代谢和血清中维生素B6代谢通路。
1。介绍
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一种肝脏病综合征,其特征是在肝细胞脂肪变性和脂肪积累(1]。最近,非酒精性脂肪肝的发病率增加,它已经取代了病毒性肝炎是全球最常见的慢性肝病,成人患病率为25% (2]。非酒精性脂肪肝也可能发展成2型糖尿病、肝硬化,肝癌在严重的情况下,因此,对人类生活和健康构成巨大威胁,并主要对病人经济负担,家庭和社会3]。目前,主要治疗非酒精性脂肪肝是运动疗法和药物疗法;然而,运动疗法的接受和可持续性仍然缺乏(4]。药物治疗,降脂药物(例如,辛伐他汀),如胰岛素抑制剂(例如,吡格列酮)和抗氧化剂(如维生素E)通常使用(5- - - - - -7]。然而,一些降脂药物具有潜在的肝毒性,其中一些未能减少肝脏脂肪沉积,甚至可能加剧肝损伤(8,9]。因此,与降脂中药的发展和王亚南效果会更适合治疗非酒精性脂肪肝有广阔的应用前景和现实意义。
最近,肠道微生物群已被广泛研究,影响因素与非酒精性脂肪肝密切相关。肠道微生物群主要影响非酒精性脂肪肝发展通过改变肠道的微生态成分,抑制炎性因子的表达,调节代谢产物,如短链脂肪酸,胆汁酸,内生乙醇(10]。一些益生菌,如双歧杆菌,乳酸菌,拟杆菌门有重要的角色在维持肠道微生物群的平衡和治疗非酒精性脂肪肝。肠双歧杆菌减少肠内胆固醇的吸收,降低胆汁盐和促进粪便胆汁酸排泄,从而影响抑制胆汁郁积和增强肝肠循环(11]。代谢组学可以让系统识别和量化代谢物水平,可以阐明疾病的发病机理和代谢水平的药物作用机制12]。代谢物水平影响肠道微生物群,可以直接显示当前代谢器官或细胞的状态13]。研究发现中药(TCM)有突出优势提高血脂异常在非酒精性脂肪肝等方面,具有广泛的应用价值14,15]。7 Baizhu粉减轻非酒精性脂肪肝通过其抗氧化,抗炎,降脂,监管影响肠道微生物群(16- - - - - -18]。Dachaihu汤增强肠道微生物群的改变和调节花生四烯酸(AA), glycerophospholipid、甘氨酸、丝氨酸/苏氨酸代谢途径增加代谢紊乱在非酒精性脂肪肝模型大鼠19]。使用16 s rRNA测序结合代谢组学可以阐明中药的作用机制公式通过肠道微生物群与宿主相互作用的新陈代谢。
Er-Chen汤(EC)组成的半夏ternata(研究)。牧野,柑橘类×橙l菝葜glabraRoxb。,乌拉尔甘草费斯。前女友。,has been using in the treatment of NAFLD [20.]。实验研究表明,电子商务可以显著降低血脂水平,改善胰岛素抵抗,降低体重在高脂饮食大鼠(21]。临床观察也发现,EC修改公式显著提高脂肪沉积,降低血脂,改善病人的非酒精性脂肪肝患者的生活质量(22]。然而,它的具体作用机理尚未阐明。
为了更好地理解这些机制,非酒精性脂肪肝大鼠模型生成和EC对非酒精性脂肪肝大鼠的治疗效果进行评估,然后是EC对炎症和氧化应激的影响在非酒精性脂肪肝大鼠被检查。肠道微生物群的变化研究了EC治疗后使用16 s rRNA测序。此外,EC对非酒精性脂肪肝的代谢调控机制也使用非目标化代谢组学方法分析。
2。材料和方法
2.1。试剂
辛伐他汀(C25H38O5分子量:418.57 Da, CAS No。:79902-63-9)是来自Sigma-Aldrich有限公司有限公司(美国)。高脂肪食物(猪油为10%,加糖量为5%,4%胆固醇、丙硫氧嘧啶0.2%,胆盐,钠0.5%和80.3%基底chow)购买从北京Sibeifu生物科学有限公司有限公司(中国,北京)。天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、超氧化物歧化酶(SOD),甲烷二元羧酸醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)检测包购自南京建成生物工程研究所(中国南京)。油红O染色设备是来自Solarbio生物技术有限公司有限公司(中国,北京)。总RNA隔离、互补脱氧核糖核酸逆转录定量聚合酶链反应(qPCR)包,和引物qPCR试验从TianGen购买生物技术有限公司有限公司(中国,北京)。酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒鼠白介素(IL) 1β、白介素和肿瘤坏死因子-α(TNF -α)是购自上海BlueGene生物技术有限公司(上海,中国)。
2.2。制备Er-Chen煎煮
15克半夏ternata(研究)。牧野,15克柑橘类×橙l9 g of菝葜glabraRoxb。,4。5 g of乌拉尔甘草费斯。前任直流的体重,并增加了八倍水的体积为30分钟的煎煮和浓缩原油草2 g / mL。
2.3。动物
Specific-pathogen-free (SPF)级男雄性SD (SD)大鼠中年龄在6 - 8周,体重(200±20 g)是由北京Huafukang生物技术有限公司有限公司住房环境维持在25±2°C的相对湿度50±15%和12 h光暗周期提供水和食物随意。这个实验是南开大学的伦理委员会批准。
2.4。动物分组
经过一个星期的适应饲养,非酒精性脂肪肝大鼠模型复制按照文献[23]。五十大鼠随机分为控制、模型、辛伐他汀、EC低剂量,和EC高剂量组(n每组)= 10。对照组与正常喂养的老鼠,老鼠在剩余的四组被给予高脂肪食物(4%胆固醇,10%猪油、5%糖、胆盐钠0.5%,0.2%丙硫氧嘧啶,和80.3%的基底chow),所有12周。在12周的模型建立,同时药物干预管理,控制和模型组2毫升/生理盐水的老鼠通过胃内的日常管理。辛伐他汀组服用1.8毫克/公斤/天(辛伐他汀在胃内的行政24],欧共体低和EC高剂量组有4.5 g / kg / d和9克/公斤/ d (EC 2毫升/鼠)通过胃内的政府基于临床等效剂量在人类中,所有12周。大鼠的体重记录每两周期间的实验。
2.5。血清生化指标测试
建模和药物管理局后,每组大鼠禁食24 h和麻醉的腹腔内注射1%的苯巴比妥(10毫升/公斤)。血液收集从腹主动脉和离心机在4°C和3000 r / min十分钟分离血清。血清ALT水平,天冬氨酸转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)使用试剂盒测定。
2.6。肝脏病理染色
后立即模型建立和药物管理局,相同的肝组织肝左叶的一部分被消除,清洗,10%福尔马林固定,脱水,石蜡包埋。组织切成5μ米部分使用切片机(模型RM2125 RTS,从徕卡购买),常规染色使用他,清理,安装,然后光显微镜下观察(ECLIPSE高达模型,从买尼康)在肝脏病理改变。脂肪变性的病理严重程度、小叶炎症和肝细胞膨胀确定使用我们以前公布的非酒精性脂肪肝活动得分(NAS) [25]。
此外,10μ米冻肝组织被削减使用cryotome(模型CM3050年代,从徕卡购买)和固定在幻灯片为5分钟。在室温下干燥的组织是利用油红O染色染色设备制造商的指示,然后立即光学显微镜下观察。油红O染色面积的百分比确定使用Image-Pro + 6.0。
2.7。肝脏组织的抗氧化指标测试
100毫克的肝脏组织称重和沉浸在900μL盐水、均质由声波降解法和离心机在2000 r / min 10分钟;上层。氧化酶SOD水平,发现肝组织匀浆MDA是根据制造商的指示。
2.8。ELISA对血清炎性因子表达
细胞因子TNF的表达水平α,il - 1β,每组的血清il - 6用ELISA测定。具体方法是按照设备制造商的指示。
2.9。检测使用qPCR mRNA肝脏炎症因子的表达
总RNA从冷冻分离肝组织的基础上,建立了协议的包。RNA纯度和浓度测试后,反向转录成RNA cDNA, qPCR mRNA的表达进行了检测TNF-α(引物序列向前:GAGCACGGAAAGCATGATCC;反向:TAGACAGAAGAGCGTGGTGG),IL-1β(引物序列向前:GGGATGATGACGACCTGCTA;反向:TGTCGTTGCTTGTCTCTCCT),il - 6(引物序列向前:CTCATTCTGTCTCGAGCCCA;反向:TGAAGTAGGGAAGGCAGTGG)在肝脏组织。相对mRNA的表达是计算后的相对使用量化方法β肌动蛋白(引物序列向前:TCTTCCAGCCTTCCTTCCTG;反向:CACACAGAGTACTTGCGCTC)作为内部控制。基于2进行了量化−△△CT方法。
2.10。16 s rRNA测序
2.10.1。粪便基因组DNA提取
大鼠盲肠内容得到的总基因组DNA使用CTAB / SDS法、浓度和纯度的DNA样本测量用1%的琼脂糖凝胶。
2.10.2。16 s rRNA基因的PCR扩增和测序
16 s rRNA基因(V3和V4地区)使用通用引物扩增338 f - 806 r。338 f的引物序列和806 r 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′, 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′,分别。10 ng模板的PCR系统是由DNA, 0.2 -µ分别为引物(正向和反向),和15μL Phusion®高保真PCR主混合(美国马萨诸塞州新英格兰生物学实验室,伊普斯维奇)。反应条件在98°C predenaturation 1分钟,变性在95°C 10年代,退火在30年代50°C,在72°C扩展30年代,随着15周期。最后,反应5分钟举行72°C,然后反应是储存在4°C。然后,试剂盒凝胶萃取工具包(试剂盒、德国)是用于净化混合PCR产品。TruSeq®DNA PCR-Free样品制备设备(美国Illumina公司)是用于生成序列库,和Qubit@ 2.0荧光计(热科学)和安捷伦生物分析仪2100系统被用来访问图书馆质量。最后,250个基点paired-end序列得到基于Illumina公司NovaSeq平台。
2.10.3。测序数据分析
原始测序数据组装使用FLASH (v1.2.7) [26),质量控制是应用于序列获得的有效标记。标签使用Uparse集群软件(Uparse v7.0.1001) (27]在97%相似性水平。然后,操作分类单位(辣子鸡)。的Mothur算法席尔瓦数据库(28)是用来注释辣子鸡基于分类信息。肌肉软件用于多个序列比较(v3.8.31) [29日]。α多样性指数和β多样性分析随后进行。组织多样性指数之间的差异进行了分析使用Wilcoxon等级和测试,和克鲁斯卡尔-沃利斯排名和测试使用(Games-Howell被选为posthoc测试),结合多个测试方法的错误发现率为微分微生物群,屏幕和差异 被认为是具有统计学意义。最后,系统调查的社区通过未被注意的国家重建数据库(PICRUSt)进行了分析预测相关的基因通路可能受到每一组微分微生物群。
2.11。代谢组学分析
2.11.1。血清样本处理
一个100μL血清样本添加到400年μL 80%的甲醇,涡和动摇,放在冰浴5分钟,离心20分钟在4°C(15000克)。离心后,上清液使用超纯水稀释到53%甲醇,其次是在15000 g离心20分钟4°C,和上层清液收集作为测试样本。等量的每个样本混合和作为质量控制(QC)样本。在整个分析、定期分析进行了监测仪器的稳定性。
2.11.2。色谱和质谱条件
色谱法是进行Hypesil黄金列(C18)和色谱柱(1.9μ米,2.1毫米×100毫米)与流动相组成(a) 0.1%甲酸和甲醇(B),使用梯度洗脱(0分钟,98%,2% B;B 1.5分钟,98%,2%;B 12分钟,0%,100%;B 14分钟,0%,100%;B 14分钟,0%,100%;B 14.1分钟,98%,2%;和17分钟,98%,2% b列温度是40°C,流速为0.2毫升/分钟,注入体积是2μl .质谱条件同时发现在积极和消极离子模式基于电喷雾电离(ESI)来源。应急服务国际公司设置来源如下:喷涂电压:3.2 kV;辅助gasflow率:10-arb;鞘气体流速:40-arb;毛细管温度:320°C。极性:积极;消极的;扫描范围:100 - 1500 m / z。在整个实验过程中,质量控制是添加后每六个样品分析的稳定性实验。
14。数据处理
分子特征峰发现基于质谱检测技术。分子的山峰被确定使用mzCloud的结合,mzVault, MassList数据库。数据预处理的原始文件(.raw)获得质谱进行了基于复合发现者3.1 (CD3.1,热Fisher)软件。分子预测公式然后根据分子离子峰和碎片离子和与MassList相比,mzCloud,和mzVault数据库,从而确定代谢物。代谢物的方差系数小于30% (30.在QC样品被保留作为后续分析最终识别。样本中的山峰综合使用CD3.1软件获得的定量结果代谢物。数据然后进行质量控制,确保数据的可靠性和准确性。接下来,多元统计分析(主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA))的代谢物进行显示代谢模式不同群体之间的差异。代谢物相关分析是用来显示样品和代谢物之间的关系。最后,代谢物相关的生物学意义是通过功能分析解释,如代谢途径。代谢物( 和变量投影(VIP) > 1的重要性,褶皱变化(FC) > 1.25或FC < 0.80)筛选差异代谢物。微分代谢物的代谢通路富集分析是基于KEGG平台进行的。最后,途径 和影响> 0.1被选为丰富通路。
2.11.4。统计处理
进行了统计分析,使用SPSS 20.0统计软件,和数据表示为 。单向方差分析被用于比较组。差异与 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。治疗EC对非酒精性脂肪肝大鼠的影响
与对照组相比,模型组大鼠的体重显著增加( ,图1),低和高剂量的EC和辛伐他汀治疗显著降低非酒精性脂肪肝模型大鼠的体重与模型组相比,( ,分别,图1)。根据他染色显示,控制老鼠的肝脏结构完整,和肝细胞排列得整整齐齐径向模式。门户地区的肝细胞和中央静脉周围清晰和完整,细胞核大小和形状都是一样的,位于肝细胞的中心。模型组大鼠肝脏的,许多肝细胞脂肪变性,肝细胞的独特的肿胀,圆形;细胞核被挤到一边;细胞质中充满了许多脂肪空泡;不同大小的脂质滴,甚至融合成巨大的脂质滴;观察和炎性细胞浸润。欧共体高剂量治疗和辛伐他汀治疗显著减轻脂肪变性和炎症细胞浸润引起的高脂食物(图2(一个))。同样,NAS得分明显高于模型组比对照组和积极控制和EC)染色组表现出NAS得分低于模型组( ,图2 (b))。油红O染色的结果提出,肝细胞的细胞核控制老鼠的蓝色,也没有红出现在肝细胞脂滴。大鼠肝组织中脂质水平的模型组相比显著增加,对照组( )。与模型组相比,大鼠的肝细胞的脂质积累的所有剂量组降低( ,)(图2 (c)和2 (d))。此外,血清生化指标的结果表明,血清TC和TG水平以及ALT和AST显著增加在模型组与对照组相比,( ,分别);与模型组相比,辛伐他汀和EC高剂量干预水平显著降低TC的水平( , ,分别),TG水平( ,)、ALT的活动( ,)、AST ( ,血清(表分别)1)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。抗炎和抗氧化EC对非酒精性脂肪肝大鼠的影响
利用ELISA检测促炎因子il - 6的水平,il - 1β和肿瘤坏死因子-α每组大鼠的血清的影响来分析电子商务对非酒精性脂肪肝模型大鼠的炎症反应。与对照组相比,促炎因子的血清il - 6、il - 1β和肿瘤坏死因子-α在模型组显著增加( ,分别);与模型组相比,辛伐他汀的干预,欧共体EC低剂量和高剂量显著降低血清il - 6水平( ,分别)和il - 1β( , , ,分别);与模型组相比,积极控制药物的干预和EC高剂量显著降低血清il - 1的水平β模型组( ,)(图3(一个))。与此同时,促炎因子的mRNA表达il - 6,IL-1β,TNF-α使用qPCR肝组织中检测到。与对照组相比,mRNA的表达IL-1βil - 6,和TNF-α在模型组肝脏明显调节( ,分别,图3 (b));而的mRNA水平il - 6( , , ,分别),IL-1β( , , ,分别)辛伐他汀、EC低剂量和EC高剂量与模型组相比均有显著下调。与模型组相比,辛伐他汀的干预和高剂量EC显著降低mRNA的表达TNF-α在肝脏( ,)(图3 (b))。
(一)
(b)
EC对氧化应激的影响在非酒精性脂肪肝模型组大鼠被进一步评估测量SOD, MDA,氧化酶水平在每组的肝组织匀浆。与对照组相比,肝组织匀浆SOD和氧化酶活动的老鼠模型组显著降低( ,分别),MDA含量明显增加( ,分别)。肝脏匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)的活性在辛伐他汀增加,EC低剂量和EC高剂量组与模型组相比,( ,分别)。与模型组相比,辛伐他汀和氧化酶(EC治疗高剂量增加的活动 , ,分别)和降低MDA的水平( ,分别在肝脏匀浆(表)2)。
总之,EC高剂量对非酒精性脂肪肝大鼠有明显的治疗效果,同时大大减少了炎症反应,提高肝组织中氧化应激;因此,欧盟高剂量组被选为后续实验来研究电子商务的影响16 s rRNA测序和非酒精性脂肪肝大鼠的血清代谢物水平。
3.3。电子商务对非酒精性脂肪肝大鼠的肠道微生物群的影响
探讨EC的变化对非酒精性脂肪肝大鼠的肠道微生物群,不同组的老鼠的粪便微生物群使用16 s rRNA高通量测序分析。香农和辛普森指数测量来评估每组肠道微生物群的α多样性。在香农和辛普森指数没有明显差异在每组(图中4(一))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
接下来,分析了微生物群落的组成不同的样本使用ß多样性和评估使用主坐标分析(PCoA)和聚类分析。PCoA结果显示,模型组的采样点可以完全脱离对照组,而欧盟高剂量组的采样点非常接近对照组(图4 (b))。同样,聚类分析表明,距离EC的对照组高剂量组比正常组,模型组的距离(图4 (c))。
进一步探索α多样性和ß多样性在肠道微生物群的构成,共同和独特的辣子鸡的分析了各种人群使用维恩图来可视化之间的相似和重叠在OTU数字组成样本。结果显示在图,发现辣子鸡常见的数量正常组,模型组,和EC高剂量组455个物种,而辣子鸡独有的这三个组3486种,2645种,分别为2892种(图4 (d))。
肠道微生物群的构成在每个样本在门级图所示4 (e)。厚壁菌门和拟杆菌门门级别的优势类群。与对照组相比,厚壁菌门/拟杆菌门(F / B)比增加模型组( )。与模型组相比,F / B比率EC高剂量组降低( ,图4 (f))。在属级,与正常组相比,模型组相对丰富的高脱磷孤菌属,Romboutsia,乳酸菌,Dubosiella,Lachnospiraceae,Akkermansia丰度相对较低;与模型组相比,乳酸菌,Dubosiella,Lachnospiraceae,Akkermansia,IntestinimonasEC高剂量组的丰度较高,和大量的吗脱磷孤菌属和C._saccharimonas是相对较低(图4 (g))。
3.4。功能的预测基于PICRUSt 16 s rRNA测序分析
PICRUSt分析进一步用于调查的功能变化在非酒精性脂肪肝大鼠的肠道微生物群EC高剂量治疗。数据4 (e)和4 (f)表示最高的十大代谢途径和比例 。通路中改变正常模型和EC组和模型组也被认为是微分代谢途径。与对照组相比,大量的柠檬酸循环(柠檬酸循环),半胱氨酸和蛋氨酸代谢和脂肪酸代谢增加模型组。相比之下,大量的维生素B6新陈代谢降低;与模型组相比,大量的脂肪酸代谢,柠檬酸循环,glycerophospholipid新陈代谢,半胱氨酸,EC高剂量组和蛋氨酸代谢降低,但相比之下,大量的牛磺酸和hypotaurine新陈代谢,和维生素B6代谢改善(数字4 (h)和4(我))。
3.5。在非酒精性脂肪肝大鼠血清代谢物水平变化EC治疗
主成分分析表明,对照组可以分化良好的模型组,模型组是分化良好的EC高剂量组(图5(一个))。此外,OPLS-DA模型被用来确定微分代谢物(数字5 (b)和5 (c))。与对照组相比,模型组解释率(R2)= 0.94和预测能力(问2)= -0.60;与模型组相比,EC高剂量组R2= 0.94,问2= -0.49(图5 (d)和5 (e))。这些结果表明,该模型稳定,有良好的预测能力。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
以下两个标准被用来屏幕微分代谢物: 和VIP > 1.0, 21微分代谢物被确认(表3)。与对照组相比,血清乙酰乙酸盐、胆固醇、AA, 4-pyridoxic酸,硬脂酸,牛磺胆酸,前列腺素G2, 16 (R) -HETE,蛋氨酸,牛磺酸、和pyridoxic酸显著改善模型大鼠,而蛋氨酸、牛磺酸、维生素b6, l -胱氨酸,hypotaurine, L-cysteinesulfinic酸、维生素d3、维生素b6α亚麻酸显著降低;与模型组相比,血清水平的蛋氨酸,牛磺酸、l -胱氨酸,维生素b6, L-cysteinesulfinic酸,亚油酸,骨化三醇,维生素d3,α亚麻酸显著增加,而胆固醇,AA, APS,棕榈酸,4-pyridoxic酸,牛磺胆酸,前列腺素G2, 16 (R) -HETE显著降低(表3)。
3.6。微分后的血清代谢途径的分析电子商务对非酒精性脂肪肝大鼠的干预
MetaboAnalyst分析平台被用来进行浓缩微分代谢物的代谢途径的分析,和KEGG数据库被选为屏幕微分代谢途径基于> 0.1和通路状况的影响 。微分控制和模型组之间的代谢途径包括牛磺酸和hypotaurine新陈代谢,AA新陈代谢,亚麻酸代谢,半胱氨酸和蛋氨酸代谢、维生素B6新陈代谢,酮体的合成和降解,butanoate新陈代谢(图5 (f))。微分模型和EC高剂量组之间的代谢途径包括牛磺酸和hypotaurine新陈代谢,AA新陈代谢,亚麻酸代谢,半胱氨酸和蛋氨酸代谢、维生素B6新陈代谢,硫代谢,亚油酸的新陈代谢(图5 (g))。其中,AA新陈代谢、牛磺酸和hypotaurine新陈代谢,亚麻酸代谢,半胱氨酸和蛋氨酸代谢,和维生素B6代谢通路是常见的正常与模型组之间,还有模型和EC高剂量组之间,这些路径选择的代谢途径欧共体干预模型组。
3.7。不属预定目标的关联分析的代谢组学和肠道微生物群
斯皮尔曼相关分析是用来评估血清差异代谢物之间的关系和属的肠道微生物群在正常水平,模型,和EC高剂量组。显示在图6,乳酸菌,Dubosiella,Lachnospiraceae,脱磷孤菌属,Romboutsia,Akkermansia,Intestinimonas,C._saccharimonas与大多数的代谢物。
3.8。疗效指标的相关分析,氧化应激指标,并与肠道微生物群的促炎细胞因子
斯皮尔曼相关分析是用来评估治疗效果指标之间的关系,氧化应激水平,促炎细胞因子,和肠道微生物群的控制模型,EC高剂量组。显示在图7,Dubosiella,乳酸菌,Intestinimonas与大多数的负相关生理指标,然后呢Romboutsia和脱磷孤菌属与大多数的生理指标呈正相关。此外,Dubosiella,乳酸菌,Intestinimonas一定的促炎细胞因子呈负相关,Romboutsia和脱磷孤菌属与某些促炎细胞因子呈正相关。Dubosiella,Lachnospiraceae,Romboutsia,Intestinimonas,C._saccharimonas与某些氧化应激相关因素。
4所示。讨论
在这项研究中,高脂肪食物喂养被用于生成非酒精性脂肪肝大鼠模型,这与之前的研究一致(31日]。与对照组相比,模型组的大鼠体重和血清水平有了显著提高TG, TC, ALT, AST,病理检查还表示重要的脂肪变性和细胞损伤大鼠模型组肝细胞,这是符合病理非酒精性脂肪肝表现。每个EC剂量组能降低体重,改善血脂异常,和减轻肝脏病理变化在非酒精性脂肪肝大鼠不同程度,表明EC对非酒精性脂肪肝的治疗效果,在高剂量组最为明显。辛伐他汀是一线治疗方案治疗非酒精性脂肪肝的临床实践,而增加体重和减少在非酒精性脂肪肝患者血清ALT水平(32]。它能增强非酒精性脂肪肝通过增加内皮一氧化氮合酶(以挪士)表达,减少诱导一氧化氮合酶(间接宾语)表达和抑制肝星状细胞(HSC)激活33]。因此,辛伐他汀被选为阳性对照组。结果表明,辛伐他汀没有显著不同的EC高剂量组在改善体重、血脂、和病理变化。
然后,我们评估的影响电子商务水平的氧化应激和炎症与非酒精性脂肪肝大鼠,它有一个复杂的发病机制,但“两面夹攻”假说是被广泛接受的。脂肪酸进入肝脏,作为TG沉积在肝实质细胞,大量的渐进破坏细胞内代谢疾病的第一个打击。当细胞不能存储大量的游离脂肪酸的TG或超过负载细胞氧化,生成大量的活性氧(ROS)从多余的脂肪酸诱导内质网压力、氧化应激、细胞凋亡、炎症反应是第二个打击疾病发作(34]。我们的研究结果发现电子商务可以增加SOD和氧化酶在非酒精性脂肪肝大鼠活动和降低MDA水平,表明电子商务可以减少氧化应激在非酒精性脂肪肝大鼠模型。脂质过氧化反应的最终产物氧化应激下,MDA水平可以反映细胞和器官的氧化损伤的严重程度(35]。SOD作为细胞内氧游离基清除剂、催化O2- - - - - -来啊2和H2O2从超氧化物阴离子和保护身体36,37]。氧化酶催化转换谷胱甘肽(GSH)氧化谷胱甘肽(GSSG)和保护细胞免受氧化应激(38]。
ELISA和qPCR结果表明,电子商务可以降低炎性反应,肝脏基因表达的差别,对这些就证明了这一点IL-1β,il - 6,TNF-α与降低il - 1β、il - 6和TNF -α血清中水平。过高的血脂水平导致肝细胞产生促炎因子如il - 6、il - 1β和肿瘤坏死因子-α,导致非酒精性脂肪肝发病(39,40]。肿瘤坏死因子-α身体的炎症反应密切相关,脂质代谢和细胞死亡41]。il - 6也是一个重要的促炎因子诱发肝损伤,导致肝细胞凋亡、制造胰岛素抵抗,和参与的开发和发展非酒精性脂肪肝(42]。il - 1β参与代谢活动不同的急性肝损伤症状,促进肝脂肪变性(43]。这些炎性细胞因子引起补偿高胰岛素血症,损害肝脏的脂肪代谢,导致肝细胞脂肪变性;因此,抑制炎症反应可以减轻非酒精性脂肪肝(44]。
EC高剂量组的效果在非酒精性脂肪肝模型大鼠的肠道微生物群使用16 s rRNA测序技术研究。辛普森指数和香农指数减少后的模型组和增加电子商务管理,提出电子商务可以增加肠道微生物群的α多样性在非酒精性脂肪肝大鼠。PCoA情节和聚类树的结果表明,大鼠的肠道微生物群的β多样性欧共体组更类似于对照组与模型组相比,这些结果表明,电子商务可以恢复肠道微生物群的β多样性的非酒精性脂肪肝大鼠对照组的水平。微生物群丰度进一步的分析显示,在门级,每组的主要肠道微生物群的物种拟杆菌门和厚壁菌门和的比值厚壁菌门来拟杆菌门增加在非酒精性脂肪肝模型大鼠,而电子商务大大减少肠道微生物群的F / B比率。F / B比率与机体的炎症反应密切相关,血脂异常45]。血脂异常患者与健康对照组相比,有显著增加的相对丰度厚壁菌门,显著减少拟杆菌门,增加率(46]。临床上,减少患者F / B比率提高脂质(47]。
进一步分析在属级显示丰富的乳酸菌,Dubosiella,Lachnospiraceae,Akkermansia显著降低,大量的吗Alloprevotella和Romboutsia显著增加了模型大鼠相比,在对照组。电子商务增加了大量的治疗乳酸菌,Dubosiella,Akkermansia,Intestinimonas和大量的减少Alloprevotella和C._saccharimonas在非酒精性脂肪肝大鼠模型。乳酸菌是一个主要的益生菌有至关重要的作用在调节身体代谢免疫,等等(48- - - - - -50]。丰富的乳酸菌在模型减少糖尿病、脂肪肝、肥胖,身体的代谢和炎症反应可以增强移植乳酸菌(51]。的Dubosiella降低小鼠急性酒精性肝损伤(52]。的Dubosiella潜在的有益菌结肠炎(53),研究表明,中国药用植物提取物的作用机制金银花hypoglauca和黄芩在减轻炎症和氧化应激小鼠结肠炎可能与增加Dubosiella丰度(54]。的Lachnospiraceaebutyrate-producing细菌,一项研究发现,大量的吗Lachnospiraceae减少在非酒精性脂肪肝患者(55]。丁酸盐生产由细菌是一个关键的功能在维持肠道微生物群的体内平衡,和丁酸显著减轻肝病通过调节肠道微生物群和肠道屏障功能,从而减少炎症和氧化损伤的肝脏(56]。脱磷孤菌属促进炎症反应和代谢紊乱的有机体。在2型糖尿病模型中,大量的脱磷孤菌属显著升高(57]。抑制脱磷孤菌属丰富的微生物群移植可以改善糖尿病(58]。Romboutsia是细菌与肥胖有关,而一些研究表明之间的正相关关系Romboutsia和脂肪59]。在高脂肪食源性高脂血症大鼠模型中,螺旋藻platensis 55%乙醇提取物增强通过减少大量的脂质代谢Romboutsia(60]。大量的增加Akkermansia减少高脂肪饮食引发的脂多糖水平升高和葡萄糖代谢维持体内平衡是必要的(61年]。一项研究发现显著增加的百分比Akkermansia肠道微生物与二甲双胍治疗的肥胖老鼠和它在抑制脂质代谢过程中的作用62年]。Intestinimonas也butyrate-producing肠道菌与典型药物和抗炎作用63年]。C._saccharimonas是条件致病菌痛风患者的肠道中显著升高(64年]。此外,绿色茶叶粉可以减少高脂肪的食源性疾病在脂类代谢,同时减少大量的C._saccharimonas在他们的肠子65年]。PICRUSt分析用于预测相关的代谢途径改变肠道微生物群,包括脂肪酸代谢、牛磺酸和hypotaurine新陈代谢,维生素B6新陈代谢,柠檬酸循环,glycerophospholipid新陈代谢,半胱氨酸和蛋氨酸代谢。
PCA和OPLS-DA血清不属预定目标的代谢物的代谢组学表明,非酒精性脂肪肝模型大鼠明显不同于控制老鼠,和EC干预后大鼠的血清代谢物水平明显不同于非酒精性脂肪肝大鼠模型。使用MetaboAnalyst微分代谢物的代谢途径分析表明,电子商务可以影响AA代谢的代谢途径,牛磺酸和hypotaurine新陈代谢,亚麻酸代谢,半胱氨酸和蛋氨酸代谢,和维生素B6的新陈代谢。牛磺酸和hypotaurine新陈代谢,半胱氨酸和蛋氨酸代谢,和维生素B6代谢通路是常见的途径,提出电子商务可能影响非酒精性脂肪肝的治疗通过调节肠道微生物群,进而影响牛磺酸和hypotaurine代谢的通路,半胱氨酸和蛋氨酸代谢,和维生素B6的新陈代谢。
4.1。牛磺酸和Hypotaurine代谢
牛磺酸和hypotaurine代谢是许多疾病密切相关。在我们的研究中,人们发现牛磺酸和hypotaurine水平减少在非酒精性脂肪肝模型大鼠和EC治疗后显著增加。牛磺胆酸含量增加,EC治疗后下降。牛磺酸具有不同生理功能的细胞,如改善糖脂代谢、免疫调节、抗炎和抗氧化作用66年]。已经表明,牛磺酸补充预防肥胖和胰岛素抵抗[67年]。牛磺酸可降低炎症在脂肪组织减少巨噬细胞浸润68年]。此外,肝牛磺酸水平影响肝脏代谢类固醇和其他脂类代谢69年- - - - - -71年]。牛磺酸是公认的抗氧化剂,提高抗氧化酶的活动超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶(72年]。Ebrahim Sakthisekaran表明补充牛磺酸对老鼠是有效地避免生物膜脂质过氧化增加引起的损害身体的抗氧化能力(73年]。高浓度的牛磺酸有助于保护胃粘膜免受氧化应激(74年]。牛磺酸王亚南,发现防止acetaminophen-induced在大鼠肝损伤,和牛磺酸增强许多肝功能指标碳tetrachloride-induced肝纤维化模型通过提高血清转氨酶和胆红素水平和抗氧化作用75年,76年]。Hypotaurine是牛磺酸合成的前体生产牛磺酸通过酶作用[77年]。它是一种抗氧化剂和单线态氧清除剂,保护细胞不受氧化应激损伤78年]。有人提议hypotaurine的抗氧化作用可能与SOD酶失活的预防79年]。Hypotaurine减少肝损伤和非酒精性脂肪肝小鼠模型中的脂肪积累,并补充hypotaurin显示增加胰岛素敏感性在肥胖小鼠肥胖模型(79年]。牛磺胆酸是一种共轭初级胆汁酸形成的胆汁酸结合牛磺酸在肝细胞中。淤胆型肝病,牛磺胆段炎症反应在疾病进展中扮演着重要的角色80年]。牛磺胆酸水平显著升高患者的代谢剖面非酒精性脂肪肝(81年]。肝脏中牛磺胆酸激活鞘氨醇1-phosphate受体2 (S1PR2)介导的信号通路参与肝脏炎症和纤维化的过程(82年]。斯皮尔曼的分析表明,牛磺酸是相关联的乳酸菌,Akkermansia,Intestinimonas和负相关Romboutsia;hypotaurine呈正相关Dubosiella和Akkermansia和负相关C._saccharimonas;和牛磺胆酸呈正相关脱磷孤菌属和C._saccharimonas和负相关,Lachnospiraceae和Intestinimonas。因此,推测是EC对牛磺酸和hypotaurine代谢的影响可能与大量的的规定乳酸菌,Akkermansia, Intestinimonas,Romboutsia、Dubosiella Lachnospiraceae脱磷孤菌属,和C._saccharimonas。
4.2。半胱氨酸和蛋氨酸代谢
半胱氨酸和蛋氨酸代谢是一个氨基酸代谢与氧化应激密切相关,可以调节氧化应激通过蛋氨酸/谷胱甘肽S-transferase通路(83年]。我们的研究发现,甲硫氨酸、l -胱氨酸和L-cysteinesulfinic酸减少后,模型组大鼠和提高药品监督管理局。蛋氨酸和胆碱缺乏饮食是常用的在啮齿动物中导致非酒精性脂肪肝。老鼠的蛋氨酸缺乏降低低密度脂蛋白(LDL)的合成和线粒体功能障碍ß氧化,导致快速和大规模积累三酰甘油在肝细胞,导致肝细胞脂肪变性,这构成了“第一次打击”,增加肝脏其他损伤的易感性84年];肝细胞脂肪变性导致线粒体减少游离脂肪酸的吸收,导致游离脂肪酸增加ß氧化,导致氧化应激和脂质过氧化作用,构成一个“第二次打击”到肝脏85年]。高胆固醇的饮食可以补充蛋氨酸显著降低肝脂肪变性,氧化应激,纤维化引起的高胆碱(86年]。蛋氨酸是一种重要的氨基酸在体内,提供所需的甲基胆碱在体内的合成,促进磷脂的合成,合成脂蛋白,并促进脂肪的运输组织其他肝脏减轻脂肪肝(87年,88年]。l -胱氨酸是抗氧化剂谷胱甘肽的前体和必不可少的营养对维持正常的肝功能。l -胱氨酸可以转换(NAC)和牛磺酸、蛋氨酸和防治等,提供细胞的需要89年,90年]。补充l -胱氨酸降低血清甘油三酯升高和TC肝癌引起的浓度(91年]。l -胱氨酸的作用下可转化为半胱氨酸半胱氨酸还原酶(92年]。半胱氨酸转化为减少谷胱甘肽(GSH)催化谷氨酸,半胱氨酸连接酶(GCLC)及谷胱甘肽合成酶(GSS),参与细胞的减少过程和肝脏中磷脂代谢,保护细胞免受脂质过氧化损害(93年]。它已经表明,半胱氨酸可以上调谷胱甘肽水平和改善氧化应激在high-glucose培养肝细胞在糖尿病性脂肪肝大鼠模型和(94年]。长期补充l -恢复心血管病变引起的高脂肪饮食的老鼠(95年]。膳食补充剂与半胱氨酸剂量依赖性促进了抗氧化酶活性和血清血脂水平,降低大鼠肝(96年]。L-cysteinesulfinic酸是一个中间在活的有机体内氧化l -胱氨酸、半胱氨酸和牛磺酸的前兆。半胱氨酸亚磺酸盐是由半胱氨酸亚磺酸盐hypotaurine脱羧酶脱羧,然后氧化牛磺酸。斯皮尔曼的分析表明,蛋氨酸呈正相关Romboutsia和C._saccharimonas和负相关乳酸菌和Intestinimonas;l -胱氨酸呈正相关Intestinimonas和负相关C._saccharimonas;和L-cysteinesulfinic酸呈正相关,乳酸菌,Lachnospiraceae,Akkermansia,Intestinimonas和负相关脱磷孤菌属。因此,这是猜测,EC半胱氨酸和蛋氨酸代谢的影响可能与大量的的规定乳酸菌,Lachnospiraceae,Akkermansi,Intestinimonas,Romboutsia,脱磷孤菌属,C._saccharimonas。
4.3。维生素B6的新陈代谢
维生素B6的新陈代谢有抗氧化剂,王亚南,血胆固醇降低,anti-angiosclerosis效应(97年,98年]。在我们的研究中,人们发现吡哆醛和吡哆胺显著降低模型大鼠和增加电子商务管理后,虽然4-pyridoxic酸后增加模型中的老鼠和减少药物管理局。吡哆醛是一个活跃的形式的维生素B (99年,吡哆醛通常转化为pyridoxal-5-phosphate (PLP)吡哆醛激酶,充当辅因子数参与氨基酸代谢酶(One hundred.]。PLP可以减弱钙信号在体外和抑制钙进入脂肪细胞和随后的脂肪细胞脂肪酸合成酶的表达(FASN),从而抑制脂质合成(101年- - - - - -103年]。3治疗脂肪氧化,增加胰岛素敏感性中t3l1脂肪细胞显著减少氧化和炎性应激(104年]。吡哆胺可能是晚期糖化终产物中的抑制剂,和维生素B6导数和anti-glycation代理(105年]。一项研究表明,吡哆胺显著抑制促炎基因的表达在内脏脂肪组织HFD老鼠的106年]。吡哆胺抑制HFD-induced体重增加和肥胖大鼠巨噬细胞M1极化,增加GLO1表达血管周的愤怒和内脏脂肪组织通过通路,在那里猜测,吡哆胺是治疗肥胖症的候选人或与肥胖相关的炎症并发症(107年]。吡哆胺调节氧化应激、先进的糖基化、炎性因子水平和代谢紊乱。同时,它能改善非酒精性脂肪肝患者的微循环(108年]。4-pyridoxic酸是最后的维生素B6分解产物。维生素B6的在身体代谢,进一步脱去磷酸和氧化,并最终生成4-pyridoxic酸,在尿液中排出(109年]。一些研究表明,血清4-pyridoxic酸升高在肾功能不全(110年]。然而,4-pyridoxic酸与脂肪肝之间的关系尚不清楚,需要在后续实验研究。斯皮尔曼的分析表明,吡哆醛是负相关C._saccharimona;吡哆胺是负相关乳酸菌和Romboutsia;和4-pyridoxic酸呈正相关Romboutsia和C._saccharimona和负相关乳酸菌。因此,这是猜测,EC在三羧酸循环的影响可能与大量的的监管C._saccharimonas,乳酸菌,和Romboutsia。
5。结论
总之,我们的研究显示多个改善EC对非酒精性脂肪肝的影响,包括增强肝功能、血脂以及减轻病理变化,氧化应激和炎症反应。EC对非酒精性脂肪肝的机理可能与增强肠道微生物群的变更、调节代谢途径的牛磺酸和hypotaurine新陈代谢,和半胱氨酸和蛋氨酸代谢以及维生素B6的新陈代谢。
数据可用性
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信息披露
京苗和郭会上分享第一作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是支持的科技项目关键字段的中药天津市卫生委员会(2020006);综合中西医天津中医药管理局科研项目、天津市卫生委员会(2021135);天津市重点学科(专业)建设项目;和中国肝炎防治基金会中西医肝病基金项目(YGFK20210022)。