文摘
背景。肾间质纤维化(RIF)是一种肾脏疾病的重要原因,严重影响人们的健康。作为传统中药,Shen-Shuai-Ling配方(SSLF)具有明显的肾功能。然而,治疗效果的SSLF RIF及其分子机制仍不清楚。方法。首先,潜在的目标和途径的SSLF RIF被网络药理学预测,然后,毛地黄黄酮和目标蛋白的绑定SSLF被分子对接和Co-IP实验验证。最后,SSLF的影响和木樨草素PLZF和(Pro)肾素受体(PRR)被免疫印迹和qPCR实验验证。血管紧张素(Ang) 1、Ang-2和转化生长因子-β(TGF -β)是肾间质纤维化的索引。结果。通过drug-active component-target网络图,我们发现木樨草素的连接,最多和早幼粒细胞白血病锌指(PLZF)是目标蛋白质。去分析和KEGG通路分析的目标是使用Cytoscape执行ClueGO。分子对接实验和Co-IP用于证明木樨草素和PLZF可以组合。免疫印迹和qPCR结果表明SSLF和木樨草素显著调节PLZF的表达和PRR的水平下降,Ang-1 Ang-2, TGF -β。的超表达PLZF PRR的表达减少,降价的PLZF PRR的表达增加,过度的PRR Ang-1的表达减少,Ang-2, TGF -β。结论。SSLF抑制PRR和肾间质纤维的upregulation PLZF水平。
1。介绍
慢性肾脏疾病(CKD)是一种疾病,肾脏结构或功能异常持续时间超过3个月。RIF是一种常见的慢性肾病的病理特征。RIF由纤维组织和正常组织的替代肾功能衰竭后长期和持续的肾损伤。抑制RIF在慢性肾病的治疗中具有重要意义。
的细胞外基质(ECM)过度积累RIF[的肾脏是一个重要的原因1,2]。TGF -β起着关键的作用在调节上游由ECM的因素。在调节TGF - Ang-2具有十分重要的意义β上游的因素。PRR起着重要的作用在调节生产Ang-2 [3]。2002年,一个新成员PRR上游的肾素-血管紧张素系统(RAS)被发现位于主要在细胞表面和细胞间隔,尤其是细胞核周围的空间(4,5]。PRR参与生产Ang-2主要通过两个途径:蛋白水解途径和nonproteolytic途径(6,7]。
PLZF也称为锌手指和BTB (Broad-complex Tramtrack,和小摆设)域包含16 (ZBTB16)或锌指蛋白145 (Zfp145)。在人类中,PLZF基因位于位置23 (11 q23处)的11号染色体的长臂,和基因表达产品是由673个氨基酸组成的转录因子8,9]。高度保守的在人类、老鼠和老鼠。PLZF是一种转录因子,可以作为转录抑制剂和转录激活因子,并激活的机制目前尚不清楚。与此同时,目前尚未阐明PLZF是否充当催化剂或行列式的镇压。发现renin-treated HEK293细胞会导致PLZF核易位,然后,PLZF招募到PRR基因的启动子,抑制PRR转录。
SSLF处方由鑫郑,精通中医60多年的临床经验10]。SSLF已明显影响改善肾功能,延缓慢性肾病的进展,可以明显减轻临床症状,如便秘、腹胀。
SSLF的功能机制研究和理解其潜在在肾纤维化的抑制作用,我们首先预测可能的目标和途径SSLF使用网络药理学为肾纤维化分子对接,然后,我们用分子对接和Co-IP实验来验证SSLF及其木樨草素的绑定目标蛋白质。最后,免疫印迹和qPCR实验被用来找到SSLF和木樨草素抑制肾纤维化的机制。
2。材料和方法
2.1。实验草药配方
SSLF由草大黄(DH),草种植党参(DS)、草黄芪(总部),草的龙(ML),草红花(HH),草灵芝(JLZ),草当归(DG),草丹参(RS),草淫羊藿(YYH),和草蒲公英(PGY)。SSLF用于我们的研究是由重庆处理中药研究所(中国重庆)。
2.2。细胞培养和实验治疗
人类肾脏2 (HK-2)细胞从美国购买类型文化集合(写明ATCC)(美国马纳萨斯)。HK-2细胞在DMEM / F12培养基培养(Gibco)。此外,10 6雄性SD大鼠20毫克/公斤SSLF intragastrically 7天。动物实验动物伦理委员会批准重庆医院中医。老鼠被安乐死,在8天血清收集。HK-2细胞被播种科汉解释说暴露在含药血清和空白血清为24小时。HK-2细胞治疗10 ng / ml TGF -β和100海里肾素24小时。
2.3。网络Pharmacology-Based分析
活性成分SSLF被从网站上获取http://www.swisstargetprediction.ch/。选择相关的基因对人类RIF GeneCards (https://www.genecards.org/)疾病数据库。PPI网络是由字符串数据库(https://string-db.org/),drug-component-target网络是由Cytoscape 3.6.0。去分析和KEGG通路分析进行86目标站点Cytoscape ClueGO,和富集分析结果可视化。
2.4。分子对接
毛地黄黄酮的三维结构是获得TCMSP (https://tcmspw.com/tcmsp.php),关键靶蛋白的三维结构是蛋白质数据库(检索http://www.rcsb.org/pdb)、受体蛋白质被AutoDock氢化4.2.6软件,收费计算,受体蛋白质和配体分子被七弦琴AutoDock 1.1.2分子对接。确认是通过对接,结合能得分,最好的结合能获得图分析。PyMOL被用作三维图形显示受体蛋白质之间的相互作用的小分子配体。
2.5。免疫印迹分析
细胞被收集并添加到里帕溶解产物包括PMSF和蛋白酶抑制剂的鸡尾酒。上层清液转移到一个预冷1.5毫升离心管,离心20分钟在13000 rpm的浓度测定。30 ug /总蛋白质是在100°C煮10分钟,10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(SPS-PAGE),然后转移到一个PDVF膜,关闭5%的脱脂牛奶在室温下1 h,并与TBST洗3次,每次5分钟。3% BSA初级反稀释溶液被稀释1:1000∼2000年在4°C隔夜孵化,孵化与二级反稀释溶液(1:1000)1 h第二天。
2.6。Coimmunoprecipitation
毛地黄黄酮是用生物素标记EZ-LinkTM Biotin-LC-Hydrazide(热科学)。24小时孵化后,离心收集的细胞、预冷•瑞帕缓冲了。暂停15分钟离心机。蛋白质添加琼脂糖珠和离心机15分钟去除蛋白琼脂糖珠。在4°C添加兔抗过夜。蛋白琼脂糖珠被添加到捕获抗原抗体复合物在一夜之间在4°C。琼脂糖beads-antigen抗体复合物被离心收集。样本煮5分钟。煮沸后,sds - page电泳标本进行检测。
2.7。qPCR
从样本中提取总RNA使用试剂盒试剂(豆类、日本)。互补脱氧核糖核酸是reverse-transcribed使用PrimeScript TM RT工具包(豆类、日本)。中存在的反应系统和程序中描述的指令结核病绿色预混料交货Taq II(豆类、日本),使用CFX96实时系统(美国Bio-Rad)。计算了基因的相对表达水平2−∆∆CT算法。每个基因的引物序列如下:PLZF-F (GCTACTGTGCAAGGCCAACCA) PLZF-R (GCGGTGGAAGAGGATCTCAAACA) PRR-F (GGTAGGGAAGGCAAACTCAGTG) PRR-R (ATTGAGGGGGAGTGAACTGAGAAC) Ang-1-F (AAGATTGCTTCAGCCAGCGTC) Ang-1-R (AGGTGACTTTGGCTACAAGCATTGT) Ang-2-F (TTCAACCTCGCTGTGGCTGA) Ang-2-R (AACTTTGCACATCACAGGTCCAA), TGF -β行进(AATACAGCAACAATTCCTGGCGA), TGF -β第一轮(CGCACAACTCCGGTGACATCAAA) GAPDH-F (CTGGGCTACACTGAGCACC)和GAPDH-R (AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG)。
2.8。统计分析
使用SPSS 23.0分析数据。两组独立样本的均值比较t以及,多个组样本的均值分析了单向方差分析(< 0.05)。独立所有的实验都重复三次,结果表示为平均值±标准差。
3所示。结果
3.1。共同的目标和网络的可视化SSLF和RIF
为了研究在RIF SSLF所扮演的角色,我们首先预测747年的目标SSLF SwissTargetPrediction数据库中的活性成分,筛选了414年的目标RIF-related基因GeneCards数据库中,并获得了86个交叉基因通过交叉分析(图1(一))。然后我们使用颠覆阴谋可视化组件之间的交叉基因SSLF(图1 (b))。我们使用字符串数据库获取protein-interaction网络,把网络到Cytoscape 3.6获得视觉蛋白质相互作用网络图(图1 (c))。网络图表明STAT3、VEGFA AKT1在中心位置。最后,我们使用Cytoscape 3.6 SSLF及其组件和目标进行分析,画出drug-active component-target网络图。我们发现木樨草素最连接,PLZF是目标蛋白(图1 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。去KEGG通路富集分析
为了探索SSLF的功能和潜在的目标信号通路的作用,我们用Cytoscape ClueGO分析86目标和KEGG通路富集分析结果可视化。的富集分析表明,生物过程(英国石油公司),这是相关的急性炎症反应,激素代谢过程,积极调控的蛋白质定位膜,并负调控的基因沉默RNA(图2(a))。分子功能(MF),它与蛋白结合的规定,有关蛋白质磷酸酶绑定和生长因子受体绑定(图2(b))。在蜂窝组件(CC),这可能与膜microdomain clathrin-coated泡膜,基等离子体膜(图2(c))。KEGG路径的分析显示,86潜在目标的SSLF肾纤维化主要是与PI3K-Akt相关信号通路,Rap1信号通路,HIF-1信号通路(图2(d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。毛地黄黄酮和目标之间的相互作用的蛋白质
为了研究木樨草素的影响在SSLF PLZF和核心目标蛋白质,我们首先选择的关键组件木樨草素和核心目标基因AKT1 (PDB ID: 1 unq), VEGFA (PDB ID: 3 v2a), STAT3齐亚(PDB ID: 4),和PLZF (PDB ID: 1 buo)分子对接。毛地黄黄酮和核心目标蛋白质的结合能是5.58千卡/摩尔(AKT1), 5.25千卡/摩尔(VEGFA), 4.08千卡/摩尔(STAT3)和6.48千卡/摩尔(PLZF)。氨基酸残基(LEU29, ARG28、ALA47 LEU84)木樨草素和PLZF形成氢键。木樨草素的氨基酸残基,PLZF (ALA-30、GLY-31 GYS-34, glu - 85,创- 81,HIS-46,和PHE-45)形成疏水相互作用(数字3(一)-3(d))。验证木樨草素和PLZF及其目标蛋白质之间的关系,我们与生物素标记木樨草素,观察木樨草素是否可以绑定到PLZF和其他目标蛋白质。Co-IP结果表明,毛地黄黄酮可以结合PLZF(图3(e))。因此,我们怀疑SSLF,毛地黄黄酮可以通过调节PLZF抑制肾纤维化。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.4。SSLF和木樨草素上调PLZF HK-2细胞水平
为了验证SSLF能否调节PLZF,我们第一次添加肾素诱导HK-2细胞的纤维化。实验分为两组:对照组和模型组。模型组分为三组。第一组是低剂量SSLF(鼠血清浓度的20%),第二组是中等剂量SSLF鼠血清浓度(40%)。第三组是大剂量SSLF鼠血清浓度(60%)。SSLF的影响和对PLZF检测到免疫印迹实验和qPCR实验。免疫印迹结果表明SSLF显著调节的表达PLZF PRR的水平下降,Ang-1 Ang-2, TGF -β。qPCR结果与免疫印迹结果(数据一致4(一)和4(b))。同样,结果表明,毛地黄黄酮可以上调PLZF的表达,减少PRR、Ang-1 Ang-2, TGF -β(数据4(c)和4(d))。最近,人们已经发现,在HEK293细胞中肾素能引起核易位PLZF,然后PLZF招募PRR基因的启动子,抑制PRR转录。我们证实,毛地黄黄酮可以绑定到PLZF,我们怀疑,毛地黄黄酮可以通过移植调节下游纤维化PLZF抑制PRR表达式。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。Ang-2 PLZF Ang-1的水平降低,TGF -β通过抑制PRR HK-2细胞
为了研究的影响PLZF PRR的下游靶基因,我们首先构造了一个超表达细胞模型和可拆卸的PLZF模型。我们用免疫印迹和qPCR实验来验证PLZF PRR上的影响。结果表明,过度的PLZF可以减少PRR的表达水平,击倒PLZF可能增加PRR的表达水平,和Ang-1的表达水平,Ang-2, TGF -β是一致的与PRR(数据5(一)和5(b))。发现renin-treated HEK293细胞导致PLZF核易位,然后PLZF招募PRR基因的启动子,抑制PRR转录。
(一)
(b)
(c)
(d)
来验证是否PLZF抑制PRR表达,我们在HK-2诱导纤维化细胞与肾素,发现积极的药物TGF -βPLZF水平降低和增加PRR和其他指标的指数肾间质纤维化。在细胞overexpressing PLZF PRR显著增加,肾间质纤维化的水平的其他指标,表明PLZF并抑制肾间质纤维化的指数水平通过抑制PRR表达式,qPCR也得出相同的结论(数据进行验证5(c)和5(d))。
4所示。讨论
慢性肾病是一种疾病,肾脏结构或功能异常持续时间超过3个月。目前,慢性肾病是一个世界性的公共卫生问题。的患病率逐年增加。延长的疾病和疾病的发展,一些患者会进入终末期肾病(ESRD) [11,12]。终末期肾病患者在最后阶段的慢性肾功能衰竭引起的各种原发性或继发性肾脏疾病,这些疾病危害全球人类健康的关键。RIF ESRD的是一个重要的原因,过度积累和沉淀的ECM肾脏导致肾脏纤维化的发病机制。相关的分子信号通路影响ECM积聚是复杂的,包括各种细胞因子和激素、代谢以及动力学因素(13- - - - - -15]。SSLF包含草大黄(DH),草种植党参(DS)、草黄芪(总部),草的龙(ML),草红花(HH),草灵芝(JLZ),草当归(DG),草丹参(RS),草淫羊藿(YYH),和草蒲公英(PGY)。SSLF已明显影响改善肾功能,延缓慢性肾病的进展。
研究SSLF功能机制和理解其潜在在肾纤维化的抑制作用,首先,我们发现,STAT3 VEGFA,十字路口AKT1基因SSLF和RIF的十字路口的核心蛋白基因。使用SSLF-compound-target-RIF网络,我们发现,毛地黄黄酮单体的药物,大多数连接,PLZF是目标蛋白质。为了研究PLZF SSLF的效果,我们用分子对接和IP SSLF实验发现的关键组成部分,毛地黄黄酮,可以绑定到PLZF。目前,PLZF的转录抑制的机理是PLZF与目标基因的启动子结合通过九个锌指结构在c端,然后其氨基端BTB / POZ域新兵核coinhibitory复合物。PLZF主要的生理功能包括调节造血细胞的分化,维持造血祖细胞池的稳定性,维持骨骼的正常发育和男性生殖细胞的更新,参与神经细胞的发展,调节细胞周期,和参与细胞生长、增殖、分化和凋亡。最近的研究表明,PLZF还参与免疫反应,environmental-dependent抗癌和抗肿瘤作用16- - - - - -21]。
TGF -β影响ECM积聚是最有效的因素,它可以刺激生产和抑制ECM降解ECM。Ang-2属于RAS, RAS的重要途径之一TGF -密切相关β。经典的RAS Ang-2主要是肾素的转换。RAS肾素是一种重要的激素分泌,可以催化血管紧张素转换Ang-1,和Ang-2 Ang-1随后被劈裂的王牌。发现在老鼠身上注射Ang-2能增加肾小球TGF -的表达β,阻止Ang-2的活动可以大大降低TGF -的表达β,减少ECM的形成,有效地减缓疾病的进展(22,23]。据报道,PRR起着重要的作用在调节生产Ang-2 [24]。PRR主要位于细胞表面和细胞间隔,尤其是细胞核周围的空间。PRR参与生产Ang-2主要通过两个途径:蛋白水解途径和nonproteolytic途径(25,26]。
调查是否SSLF调节PLZF,我们首先用肾素诱导纤维化HK-2细胞。然后,免疫印迹和qPCR实验表明,SSLF可以显著上调PLZF的表达,减少的表达PRR和其他指标的肾间质纤维化。然后我们还发现木樨草素,SSLF的重要组成部分,可以上调PLZF的表达,减少PRR和其他肾间质纤维化标志物的表达。目前的研究发现,renin-treated HEK293细胞导致核易位PLZF,然后PLZF招募PRR基因的启动子。然后我们发现,过度的PLZF抑制PRR水平和其他指标的肾间质纤维化使用免疫印迹和qPCR renin-induced肾间质纤维化模型。的击倒PLZF导致显著增加PRR水平细胞和其他指标的显著增加肾间质纤维化和qPCR也得出相同的结论进行验证。这表明PLZF确实可以调节PRR表达式。此外,我们发现TGF -β减少了PLZF水平和抑制PRR和其他指标的肾间质纤维化。验证PLZF影响肾间质纤维化通过调节PRR,我们过表达PRR和免疫印迹和qPCR结果显示,在HK-2细胞,PRR显著增加的肾间质纤维化的其他指标,表明PLZF并抑制肾间质纤维化通过抑制PRR表达式。
5。结论
我们第一次预测的目标和途径SSLF RIF使用网络药理学,然后我们用分子对接和IP实验来验证SSLF及其关键组件的绑定,毛地黄黄酮,目标蛋白质。最后,用免疫印迹和qPCR实验中,我们发现SSLF毛地黄黄酮可以上调PLZF的表达和抑制PRR水平。在未来的研究中,我们将进一步验证SSLF的效果和木樨草素在调节通过PLZF肾间质纤维化动物模型,收集临床资料分析SSLF消费之间的关系和表达水平的PLZF身体更好的临床应用提供依据。
数据可用性
研究支持的数据包括在这项研究中。
信息披露
Na歌和海涛你co-first作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项研究得到了国家自然科学基金(没有。81904012)和重庆省自然科学基金(nos. cstc2018jcyjAX0783, cstc2018jcyjAX0808, cstc2020jcyj-msxmX0036,和cstc2019jxjl130007)。