文摘

辅政华语(FZHY)公式改善肝纤维化临床和实验实践。基于纤维化和炎症之间的紧密联系,其抗炎作用及相关机制进行了探讨研究。借助炎性巨噬细胞模型,FZHY大大阻止了亚硝酸盐积累没有可观察到的细胞毒性由于其抑制诱导一氧化氮合酶(间接宾语)基因和蛋白质表达concentration-depended的方式。促炎介质包括il - 6、CD86和CD40也受制于FZHY。有趣的是,FZHY诱导抗炎介质血红素加氧酶1 (HO-1)和过氧物酶体proliferator-activated受体γ(PPAR -γ同时)表达式。Downregulation伊诺和mir - 155和upregulation PPAR -γCCl也观察到吗4全身的肝纤维化小鼠在FZHY管理。机械,FZHY明显消除STAT1和MAPK的磷酸化。综上所述,FZYH监管促炎和抗炎介质部分的平衡通过调制STAT1 / MAPK通路和mir - 155 / PPAR -γ轴。

1。介绍

肝纤维化是慢性炎症愈合反应的特点是(1]。基因变化、肝炎病毒感染、过度饮酒、脂质代谢紊乱,和自身免疫性疾病引发持续的肝损伤和随后的慢性炎症,导致肝纤维化(2,3]。理解强调炎症机制是至关重要的发展战略来控制纤维化(4]。

肝巨噬细胞是主要的免疫细胞,由liver-resident巨噬细胞,monocyte-derived巨噬细胞和枯否细胞,引发肝脏炎症反应也扮演着重要的角色在纤维化的病理进展(5]。传统上,巨噬细胞可以分化为促炎/ M1巨噬细胞或抗炎/ M2巨噬细胞在不同的微环境刺激。M1巨噬细胞主要表达诱导一氧化氮合酶(间接宾语)和经典分泌促炎细胞因子如白介素(IL) 6和IL-1β夸大了炎症反应引起的T助手(Th) 1信号如脂多糖(LPS)和干扰素(IFN)γ。越来越多的证据强烈暗示iNOS-derived一氧化氮(NO)与肝脏疾病的发病机理有关在炎症条件。这些炎症介质也成为重要profibrotic中心。il - 1β促进肝纤维化的部分IL-17-dependent方式(6]。因此,针对巨噬细胞和抑制M1 macrophage-led炎症发展方法干扰纤维化(7]。

小分子核糖核酸(microrna)很小,非编码rna,消极的控制目标基因表达式通过促进降解或转化抑制。mir - 155对促炎效应在免疫细胞(肝纤维化的进展8]。PPAR -γ参与肝纤维化的进展的一个目标基因mir - 155 (9]。创新领导力4政府减少PPAR -的表达γ在肝组织和antifibrotic藏红花素的影响在一定程度上通过提高PPAR -γ调节炎症反应和纤维发生的事件(10]。

辅政华语的公式(FZHY)是经中国国家食品药品监督管理局(SFDA)(没有:Z20050546)作为antifibrotic医学在2002年。FZHY由六个中药,包括基数鼠尾草Miltiorrhizae(丹参),冬虫夏草(曹Chong),桃仁(Taoren),松花粉(歌Huafen),Gynostemma Pentaphyllammak(Jiaogulan),五味子对(Wuweizi),用于振兴血液循环,消除血瘀,温补精华,滋养肝根据中医理论。FZYH antifibrotic效应已被证实在积累实验和临床证据(11- - - - - -20.]。目前数据显示FZHY缓解炎性细胞因子TNF -αVEGF和TGF - il - 6和profibrotic基因β1在肝纤维化大鼠模型[21]。然而,它的抗炎机制还有待阐明。

因此,在本研究中,我们评估FZHY的抗炎作用及相关机制。

2。材料和方法

2.1。材料

FZHY得到从黄海制药有限公司(上海,中国)。RPMI 1640中,胎牛血清(的边后卫),和0.25%胰蛋白酶买来Gibco(罗克维尔市,医学博士,美国)。BCA蛋白质化验设备和试剂盒试剂购自英杰公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。特殊的抗体包括p-JNK (# 9251;1:1000),T-JNK (# 9252;1:1000),p-ERK (# 9101;1:1000),T-ERK (# 9102;1:1000),p-P38 (# 9211;1:1000),T-P38 (# 9212;1:1000),p-STAT-1 (# 7649; 1 : 1000), T-STAT-1(#14994; 1 : 1000), and iNOS(#13120; 1 : 1000) were purchased from cell signaling technology (Beverly, MA, USA). Anti-HO-1 (ab68477; 1 : 10000), CD40 (ab252428; 1 : 1000), IL-6 (ab259341; 1 : 1000), and horseradish peroxidase-labeled goat antirabbit IgG were purchased from Abcam (Cambridge, UK). CD86 (13395-1-AP; 1 : 500) was purchased from ProteinTech Group (Chicago, IL, USA). Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes, western blotting detection reagent ECL, and murine recombinant IFN-γ购买从微孔(贝德福德,妈,美国)。有限合伙人,1400 w,格里斯试剂和MTT买来Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。微rna引物、转录工具和通用PCR反应混合液得到GenePharma公司(上海,中国)。标准化合物钠danshensu salvianolic酸B,腺苷是购自美国国立食品和药物控制(中国,北京)。

2.2。高效液相色谱法(HPLC)测定

FZHY标准化进行HPLC指纹图谱化学标准化合物,如钠danshensu salvianolic酸B(两种化合物分离基数鼠尾草Miltiorrhizae)和腺苷酸(一种化合物从冬虫夏草分离)根据中国药典(2015年版)。

2.3。细胞培养

264.7原始细胞从美国类型文化集合(位于马里兰州Rockville ATTC,)在RPMI 1640培养基培养补充10%的边后卫。细胞通道低于10被使用,和三个复制在每个实验进行。

2.4。细胞生存能力

生264.7的FZHY对扩散的影响细胞MTT试验检测。264.7原始细胞孵化到96孔板的密度10000细胞/好,一夜之间被允许遵循。细胞治疗FZHY在不同浓度(0、12.5、25、50、100、200年,400年,800年和1000年μg / mL)和1400 w(50下μ米)。24小时后,肝癌和0.5毫克/毫升添加到每个小组,并孵化为额外的4个小时。每组的上层清液是丢弃,然后吸光度在490 nm formazan-DSMO解散是阅读。每组的细胞可用性计算细胞相比对照组100%的可用性。

2.5。亚硝酸盐的检测

264.7原始细胞被播种到96孔板的密度100000细胞/被分成对照组,模型组,FZHY治疗组(25、50、100和200μg / mL),阳性药物组1400 w (50μM,分别伊诺的选择性抑制剂)。无血清治疗24小时后,对照组治疗血清1640中,与模型组与LPS刺激(100 ng / mL) /干扰素-γ(100 U /毫升),而FZHY管理组处理25岁,50岁,100年和200年μg / mL和刺激器有限合伙人(100 ng / mL) /干扰素-γ(100 U /毫升)。24小时后,100年μL每个小组收集的上清液和添加到100年μL格里斯反应试剂的10分钟,然后使用微型板块读者阅读在540海里。然后,细胞上清液中的亚硝酸盐含量计算使用硝酸标准曲线。

2.6。动物实验

CCl诱导的小鼠肝纤维化模型4和政府有或没有FZHY进行一项研究[20.,保存肝脏被用于进一步的实验来检测inflammation-relevant介质。

2.7。qPCR分析

生264.7细胞培养,分为控制模型,FZHY治疗组(100年和200年μ分别g / mL)。一夜之间被允许坚持后,细胞治疗血清1640中24小时。细胞和肝组织收集的样品,和总RNA提取试剂盒的方法,和mir - 155,进气阀打开,CD86, CD40, il - 6, PPAR -γ,HO-1被检测到。引物的存在对伊诺,CD86 CD40, il - 6, PPAR -γ,HO-1表中列出1。

表1
引物序列用于存在放大。
2.8。免疫印迹分析

264.7原始细胞培养与1×10 30 mm文化菜肴6细胞。每组的蛋白质样品收集,免疫印迹蛋白质变性后执行。伊诺的蛋白质表达,HO-1、CD40、CD86和il - 6与之相比β物,肌动蛋白的磷酸化水平p38的兵,和STAT1和p38总额相比,物,ERK和STAT1确定。

2.9。统计评估

数据提出了均值±SD至少三个实验的结果。数据是通过方差分析分析和评估t以及。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。FZHY抑制诱导炎症合成酶的表达伊诺在体外和体内

264.7检查细胞生存能力,原始细胞孵化与FZHY增加浓度(0、12.5、25、50、100、200年,400年,800年和1000年μg / mL)和1400 w (50μ米)24 h。FZHY提出对细胞生存能力200无显著影响μMTT测定以及g / mL 1400 w的剂量50μM(图1(一))。

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图1
FZHY抑制伊诺CCl炎性巨噬细胞和老鼠4治疗肝组织。(一)细胞MTT比色是可行性分析。(b)没有生产评估之后,格里斯反应与模型组(有限合伙人/干扰素-孵化γ)、对照组(车辆控制)和25 - 200μg / ml FZHY治疗组24 h。(c)伊诺mRNA在每组细胞被qPCR评估。每组(d)伊诺蛋白质从细胞被西方墨点法评估。从肝组织(e)伊诺mrna被qPCR评估。从肝组织(f)伊诺蛋白质被免疫印迹评估。值提出了均值±SD(标准差)从至少三个复制。(C)车辆控制巨噬细胞或对照组小鼠;(M)模型组(LPS刺激的100 ng / mL和干扰素-γ在CCl 100 ng / mL4诱导小鼠);1400 w(一个伊诺选择性抑制剂在50岁μ米);100:FZHY治疗组在100的浓度μ巨噬细胞g / mL;200:FZHY治疗组在200的浓度μ巨噬细胞g / mL;FZHY: FZHY剂量治疗组的5.6克/公斤/天六周CCl管理4全身的老鼠; 与C组; 与C组; 与M组; 与M组。

伊诺被用作主要的生物标志物M1炎性巨噬细胞的定义,所以我们进一步检查的影响FZHY剂量的25岁,50岁,100年和200年μ亚硝酸盐积累g / mL,稳定的一氧化氮氧化代谢物,上层清液从不同的细胞治疗。FZHY抑制LPS引起的亚硝酸盐积累+干扰素-γ浓度的方式(图1 (b))。正如所料,FZHY抑制伊诺表达式在基因和蛋白水平对炎性巨噬细胞浓度的方式(数字1 (c)和1 (d))。1400 w,著名的诱导一氧化氮合酶(间接宾语)选择性抑制剂,在50亚硝酸盐产量减少了97.45%μM模型组相比,由有限合伙人加干扰素-γ。

与正常组相比,炎症细胞的浸润,胶原蛋白沉积在门户地区在创新领导力的显著增加4全身的肝纤维化小鼠,而FZHY提出预防和治疗影响CCl4-induced肝脏炎症和纤维化(20.]。伊诺也改变了其在肝纤维化的表达式。伊诺缺乏改善肝脏炎症和胶原蛋白基因编码,导致减少纤维化(22]。我们继续测试伊诺肝组织创新领导力4全身的肝纤维化小鼠有无FZHY管理。结果表明,FZHY政府减少伊诺肝组织中的表达(数字1 (e)和1 (f))。

基于这些结果,FZHY强烈减毒伊诺CCl炎性巨噬细胞和肝组织4全身的小鼠肝纤维化。

3.2。FZHY增强抗炎酶HO-1的表情

HO-1是血红素的诱导和病原反应酶分解代谢和展品抗炎功能解决细胞氧化应激和炎症级联反应。有限合伙人未能诱导伊诺生产HO-1-overexpressing细胞表明HO-1保护原始264.7细胞炎症损伤(23]。因此,我们检查的影响FZHY HO-1使用qPCR巨噬细胞和免疫印迹分析。结果表明,FZHY HO-1在基因和蛋白水平的表达明显增加(图2)。

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图2
FZHY诱导抗炎HO-1。每组(a) HO-1信使rna被qPCR评估。每组(b) HO-1蛋白进行免疫印迹。的平均数±标准差值提出了至少三个复制。 与C组; 与M组; 与M组。
3.3。FZHY减少其他炎症介质

伊诺,CD86、CD40和il - 6在M1巨噬细胞典型的促炎介质(7]。结果显示CD86、CD40和il - 6信使rna和蛋白质水平有限合伙人+ IFN -增强γ刺激巨噬细胞与对照组相比。表达炎性介质浓度依赖性减少FZHY治疗后。这些发现表明FZHY克制这些促炎介质(图的表达式3)。

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图3
FZHY监管促炎介质。信使rna和蛋白质水平的标记包括CD86 (a、b), CD 40 (c, d), il - 6 (e, f)被qPCR和免疫印迹检测。的平均数±标准差值提出了至少三个复制。 与C组; 与M组。 与M组。
3.4。STAT1 / MAPK信号通路参与了FZHY-Led效果

传感器的信号和转录激活1 (STAT1)参与干扰素的中介γ胞内信号(24]。增殖蛋白激酶(MAPKs),包括p38,细胞外signal-regulated激酶(ERK)和c-JunN-terminal激酶(物),在炎症反应中扮演过重要的角色25]。激活STAT1 / MAPK信号通路导致伊诺和其他促炎细胞因子的诱导。

因此,我们下一个调查是否FZHY抑制伊诺表达式通过调节STAT1 / MAPK通路。有限合伙人+干扰素-γMAPK和STAT-1的磷酸化水平增加。FZHY治疗浓度依赖性废除磷酸化STAT1和MAPK(图4)。

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图4
FZHY对STAT1 / MAPKs信号通路的影响。(一)p-STAT1 STAT1, (b) p-JNK物,(c) p-ERK ERK和(d) p-p38和p38蛋白质表达被西方墨点法评估,计算成像系统。的平均数±标准差值提出了至少三个复制。 与C组; 与C组; 与M组; 与M组。

这些数据表明,STAT1 / MAPK通路参与FZHY-led效果。

3.5。FZHY调制mir - 155 / PPAR -γ轴

mir - 155 / PPAR -γ轴调节炎症和肝纤维化的进展(9]。在炎症条件下,mir - 155水平明显提高。然而,FZHY大大了mir - 155的高水平和调节目标基因的表达PPAR -γCCl的巨噬细胞和肝脏组织4全身的肝纤维化小鼠(图5)。

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图5
FZHY mir - 155 / PPAR -监管γ轴。mir - 155和PPAR -γ信使rna在每组巨噬细胞(a, b)和肝组织(c, d)被qPCR评估。的平均数±标准差值提出了至少三个复制。 与C组; 与C组; 与M组; 与M组。
3.6。通过高效液相色谱法分析FZHY的化学质量控制

我们确定了三个化合物的化学质量控制FZHY通过高效液相色谱分析(图6)。danshensu钠的含量(8.3%)、salvianolic酸B(13.25%)和腺苷酸(3.95%)FZHY满足中国药典的要求。

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图6
高效液相色谱法分析FZHY使用三个成分。

4所示。讨论

炎症是一个关键的组件和一个贡献者profibrogenic进步。越来越多的证据表明,抗炎治疗对其在肝纤维化的治疗效果(26]。针对慢性炎症的纤维发生可能导致潜在antifibrotic疗法。巨噬细胞发挥核心作用在肝脏炎症和纤维化的发展进程27]。M1巨噬细胞诱导酶和分泌细胞因子调节纤维发生(28]。因此,控制M1巨噬细胞极化在纤维化提供了一个至关重要的战略。

有限合伙人+干扰素-γM1可以激活巨噬细胞,产生炎性表型。伊诺是M1巨噬细胞的一个重要标志。过度不,气体信号分子活性高属性,由进气阀打开导致氧化和nitroxidative炎症条件下压力。这些发现表明,FZHY抑制伊诺在基因和蛋白水平的表达浓度的方式。亚硝酸盐的积累和稳定生产的也减少了FZHY(图1)。因此,FZHY抗炎活动取决于其抑制和进气阀打开。其他M1标记,包括CD86、CD40和il - 6,也减少了在FZHY政府(图3)。

现有的证据表明,HO-1了至关重要的作用在抗炎症反应和抗氧化剂的进步29日]。感应的HO-1 LPS刺激巨噬细胞,抑制促炎介质的生产,而缺乏HO-1提出炎性表型(30.]。诱导引起的HO-1没有从伊诺减毒伊诺表达和生产(31日]。之间有一个负反馈循环HO-1和进气阀打开。先前的研究表明,FZHY调节抗氧化基因HO-1改善营养fibrosing肝病(32]。值得注意的是,FZHY也同时诱导抗氧化酵素HO-1表达坚决炎性损伤引发的细胞保护机制(图2)。这些数据暗示的抗炎作用FZHY部分归因于HO-1的感应。

STAT1 / MAPK信号通路参与了炎症的进展(33]。结果表明,STAT1 / MAPK通路的激活是非常被FZHY(图4)。

小分子核糖核酸(microrna)是至关重要的炎症和纤维化的进展。积累的研究表明,促炎mir - 155提升肝纤维化。高架mir - 155在小鼠模型观察酒精中毒患者的肝纤维化和肝硬化肝脏。Profibrotic CCl酒精饮食或基因4治疗减少mir - 155 KO小鼠(9]。mir - 155目标PPAR -γ、SMAD2/5 Snail1, STAT3调节纤维化表型(34]。mir - 155缓蚀剂PPAR -的表达增加γ在alcohol-treated巨噬细胞。激活PPAR -γ抑制伊诺表达M1巨噬细胞并显示抗炎作用。PPAR -酪氨酸硝化γ伊诺削弱其转录活性和稳定性(35]。

网络药理学的方法和基于单元的分析显示,schisandrin B, salvianolic酸,和山柰酚FZHY可以绑定到PPAR -γ(19]。我们发现促炎mir - 155增加而其目标基因PPAR -γ减少在LPS刺激的干扰素-γCCl或4全身的肝纤维化小鼠,而FZHY减少mir - 155的水平和调节PPAR -的表达γ(图5)。

5。结论

总的来说,我们的研究结果表明,FZHY施加抗炎作用有限合伙人+干扰素-γ全身炎症调制的促炎和抗炎介质通过MAPK / STAT-1信号通路和mir - 155 / PPAR -γ轴(图7)。未来的研究需要从FZHY阐明活性化合物和核心目标和途径深入底层炎症和纤维化之间的关系。


图7
总结FZHY抗炎机制。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果都包含在这篇文章。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

杨Qing-Qi Chang Yi-Feng锅,贾谊的贡献同样工作。

确认

这项工作得到了上海国际科技合作基金项目(18400731400),国家自然科学基金(81730109,81730109,81730109,81001666),本科生的创新项目上海中医药大学(2020 shutcm152)和中国国家科技重大项目(2009 zx09311 - 003)。