文摘
目的。调查的抗炎和抗氧化活动N-salicyloyltryptamine(望远镜)在实验小鼠全身的卡拉胶(Cg)腹膜炎模型,和评价的影响望远镜在老鼠Cg-induced关节残疾。方法。女性瑞士老鼠提交Cg-induced小鼠腹膜炎或Cg-induced关节残疾后在大鼠腹腔内注射的望远镜(100或200毫克/公斤)。白细胞总数、总蛋白质含量、髓过氧化物酶(MPO)和过氧化氢酶(CAT)的活动,和亚硝酸盐( )硫代巴比土酸活性物种(TBARS)水平测定。结果。望远镜显著减少腹膜渗出液白细胞的迁移。Cg诱发炎症反应由活性氧簇(ROS)的表达式。结果进一步表明,望远镜显著降低MPO和猫活动,以及减少和TBARS水平,相比之下,汽车集团。动物用望远镜治疗显著降低爪子高程时间(PET)关节损伤,诱导后的第一个小时,这种效应持续整个分析。结论。望远镜提出抗炎和抗氧化作用的实验模型carrageenan-induced腹膜炎和关节残疾在小鼠和大鼠,分别,这可能与中性粒细胞迁移的调制以及抗氧化机制的参与。
1。介绍
吲哚核是许多天然和合成分子的一部分重要生物活性(1]。indolic衍生品、benzoyltryptamine N-benzoyltryptamine相关的结构,是先前获得的物种Myrtopsis myrtoidea(Baill)。Guillaumin,家庭芸香料的植物2]。这些衍生品包括化合物N-N-dimethyltryptamine 5-methoxy-NN-dimethyltryptamine,具有拟精神病活动(3]。N-Salicyloyltryptamine或(2-hydroxy-N - [2 - (1 h-indol-3-yl)乙基]苯甲酰胺)抗惊厥的展出,催眠和肌肉松弛剂活动(4]。
体外研究表明,望远镜TNF -负调节的表达α和il - 1β的磷酸化,抑制ERK1/2和我κBα,减少活性氧(ROS)的浓度和氮(RNS)的物种在巨噬细胞,从而导致炎症反应的逆转5]。氧化剂的存在与心血管疾病有关(6)、糖尿病(7),癌症,8)、类风湿性关节炎和关节(9]。研究表明,望远镜施加antiedematogenic活动引起的体内模型中不同的炎代理(10]。然而,没有研究已经发现在文献中显示望远镜体内抗氧化活性的协议。
的一个主要氧化剂炎症过程中一氧化氮(NO) (11),主要是通过激活巨噬细胞;当与氧气反应,形成过氧亚硝基(ONOO−),一个强大的蛋白质氧化剂。ONOO−然后可以使质子化的氢离子(H+),形成高活性和有毒激进,羟基(HO)−有效),其余的毒性作用和O−2(12]。这种激进的支持血管舒张和PGI由于协同效应2,放松肌肉细胞,使白细胞的运动通过内皮细胞(13]。然而,ONOO−也会产生有害影响的有机体,如组织损伤、DNA脱氨基作用,激活核转录信号通路的促炎的代理(14,15]。
最合理的替代抑制活性氧与抗氧化剂补充代理。然而,它常常不可能减弱疾病的进展,减少平均寿命(16]。氧化障碍产生的活性氧或RNS底层几个生产促炎细胞因子和炎症相关的病理生理过程的抑制的抗氧化防御系统和水肿的形成特点17]。在疾病如风湿性关节炎和关节,通常发生在关节,自由基产生,主要是由巨噬细胞和中性粒细胞激活滑膜和软骨细胞9]。从这个意义上说,需要发现新化合物的抗炎和抗氧化电位。
因此,考虑到报告望远镜体内抗炎和抗氧化效果的分析涉及抑制活性氧的缺乏,本研究旨在探讨抗炎和抗氧化作用引起的望远镜在实验性腹膜炎模型和关节残疾在啮齿动物实验模型。
2。材料和方法
2.1。药品和试剂
该望远镜2-hydroxy-N - [2 - (1 h-indol-3-yl)乙基)苯甲酰胺是通过“房子”合成之前报道(Joao萨姆、PB、巴西;专利文件:BR 200304393 - a)在药物化学实验室,UFPI(特雷西纳、PI、巴西)5]。角叉菜胶、醋酸、法螺x - 100, L-methionine,氯化羟胺,核黄素,硫代巴比土酸(稍后通知),格里斯试剂,钠dodecylsulfate O-dianisidine, hexadecyltrimethylammonium溴化(HTAB),磷酸钠,5、5′-dithiobis——(2-nitrobenzoic酸)(DTNB)和亚硝酸钠从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。吲哚美辛(Indocid®)、磷酸钠、硫酸锌、过氧化氢、三基地,氢氧化钠,三氯乙酸从默克公司购买(达姆施塔特,德国)。土耳其的解决办法是购买Newprov (Pinhais、公关、巴西)。
2.2。动物
女性Wistar鼠(170 - 230 g)和瑞士老鼠(新g) (n每组= 6)被用于实验。动物们保持在23±1°C和黑暗12-12 h /光周期,他们有免费的食物和自来水。实验协议后,腹腔内政府动物安乐死的硫喷妥钠(150毫克/公斤,i.p)。所有实验的传导协议授权的使用动物是动物使用伦理委员会(CEUA)从大学联邦Piaui(不许可。082/14;批准日期:11月24日—- 2014),以及他们遵循国际上推荐的指南。
2.3。望远镜的效果在老鼠Carrageenan-Induced腹膜炎
女性瑞士老鼠(25 - 30 g)治疗腹腔内与车辆(80年0.9%生理盐水+ 5.0%渐变),望远镜的剂量50,100和200毫克/公斤),或吲哚美辛的剂量10毫克/公斤。30分钟后,卡拉胶(0.05毫升1.0%)管理进入腹膜腔(18]。4个小时之后,进行安乐死,然后,腹膜腔洗了5毫升的肝素化(10国际单位/毫升)PBS溶液(19]。额外的渗出物整除收集分析髓过氧化酶(MPO)的活动,过氧化氢酶(CAT)、亚硝酸盐( ),硫代巴比土酸活性物种(TBARS)。
2.4。总在腹膜渗出液白细胞计数
样品0.380毫升的土耳其人的解决方案(1/20)被添加到0.02毫升的腹膜渗出物,和白细胞的数量是计算使用光学显微镜下纽鲍尔室。总白细胞的数量是根据以下公式确定:细胞/毫米3=N×20×2.5,N代表细胞的数量,20是土耳其人的稀释因子的解决方案,和2.5总量到纽鲍尔室。结果表示为总白细胞/毫米3(20.]。
2.5。测量的蛋白质在腹膜渗出物
蛋白质是量化使用特定蛋白质定量工具(21]。双缩脲试剂、氢氧化钾溶液(KOH)和硫酸铜(CuSO4),与酒石酸钠和钾(KNaC有关4H4O6h·42O),被用来剂量蛋白质。渗出液离心后,上清液收集和转移到特定的比色皿和放置在一个Labtest®的自动生化分析仪,序号1208.26(小湖圣、MG、巴西),根据制造商的建议。
2.6。髓过氧化酶(MPO)活动的评价腹膜渗出物
MPO活性显示化验的方法(21]。简单地说,400年μL腹膜炎渗出物的离心机在4000克7分钟4°C。然后,100年μl上层清液的收集和加入1毫升0.5% HTAB缓冲区,pH值6.0 (hexadecyltrimethylammonium溴铵),离心机,享年4500岁并为10分钟4°C。然后,10μl的上层清液于200年撤销和孵化μ阅读解决方案的l(0.167毫克/毫升O-dianisidine和1.0% H2O2在磷酸缓冲pH值6.0)。5分钟后,MPO活性测定在450海里,表示单位MPO每微升(U MPO /μL)。
2.7。评价腹膜渗出物中过氧化氢酶活性(CAT)
简单地说,样品(20μL)孵化了50 mM磷酸盐缓冲剂,pH值为7.0(1.2毫升)。后,1.0毫升30 mM H2O2增加,吸光度测量在240海里每2分钟6分钟。猫活动中表达μ摩尔H2O2分解/分钟/μL腹膜渗出物(22]。
2.8。亚硝酸盐的测定( )内容在腹膜渗出物
简单地说,20μL的腹膜渗出物添加蒸馏水(1:4 v / v),报除蛋白300 g / L的孵化硫酸锌(1:20 v / v),其次是离心15分钟在1000(23]。100年之后,μL的格里斯试剂添加到100μ上层清液的L。10分钟后,吸光度在550海里(读24]。获得纳米标准曲线2解决方案(亚硝酸钠)测定亚硝酸盐的浓度。结果的表达μ摩尔/毫升的腹膜渗出物。
2.9。测定硫代巴比土酸活性物种在腹膜渗出物(TBARS)内容
硫代巴比土酸活性物种(TBARS)决心,20毫升的渗出物中添加0.5%稍后通知(600μ左)和20%醋酸pH值3.5 (350μL)。然后,样本加热在100°C和煮45分钟,其次是冰浴15分钟。后来,50毫升8.1%的十二烷基硫酸钠(SDS)补充道,并在12000年样本离心机15分钟25°C。吸光度在420、490和550纳米过滤器。标准曲线得到的丙二醛(MDA)来确定TBARS内容。结果表示为MDA nmol /毫升的腹膜渗出物(25]。
2.10。评价NST-Induced Carrageenan-Induced关节残疾在大鼠的影响
并行carrageenan-induced腹膜炎,望远镜在关节运动障碍的影响程度进行评估。设定30分钟后,立即角叉菜胶诱导前关节残疾,动物被提交给联合残疾测试了60秒的速度每分钟3转(RPM),结果都被记录下来作为一项控制措施(26]。动物被治疗腹腔内与车辆(0.9%氯化钠+ 5.0% Tween80),望远镜在剂量为50,100和200毫克/公斤,或消炎痛剂10毫克/公斤。30分钟后,100年的动物收到intraarticular政府μL (300μg)的卡拉胶股胫关节的爪子。测量进行每小时60秒,直到第六个小时和一个24小时后阅读。
2.11。统计分析
结果表示为±SEM。单向方差分析之后,图基的测试后或双向方差分析Bonferroni紧随其后的测试后被应用。被认为是在显著性水平的差异 。进行了统计分析和图表绘制使用GraphPad棱镜®软件6.01版本Windows (GraphPad软件、美国加州拉霍亚https://www.graphpad.com)。
3所示。结果
3.1。望远镜对白细胞的总数在老鼠Carrageenan-Induced腹膜炎渗出物
预处理的动物与望远镜(100和200毫克/公斤)能够显著降低总白细胞的迁移(分别为1.37±0.07,0.59±0.05)腹膜渗出物,以及消炎痛(10毫克/公斤)(0.5±0.1),与汽车相比组(2.56±0.11)。望远镜的剂量50毫克/公斤不是有效的在这个协议(图1)。
3.2。总蛋白的测定在腹膜渗出物
望远镜剂量的100和200毫克/公斤或消炎痛(10毫克/公斤)显著减少腹膜渗出物中总蛋白质的浓度与汽车相比。望远镜在50毫克/公斤不是有效的在这个协议(图2)。
3.3。望远镜对髓过氧化酶(MPO)活动
髓过氧化物酶活性降低动物对待望远镜(1.38±0.20,1.43±0.24剂量的100和200毫克/公斤,分别)或消炎痛(1.09±0.20)相比,汽车集团(3.90±0.31)。没有明显的结果中观察到的望远镜治疗组50毫克/公斤(图3)。
3.4。望远镜对过氧化氢酶(CAT)活性的影响
NST-treated组(100和200毫克/公斤),猫活动显著下降(分别为0.93±0.10,0.71±0.15)相比,汽车集团(1.84±0.27)。吲哚美辛治疗(10毫克/公斤)过氧化氢酶活力显著降低(0.69±0.04)相比,汽车集团(1.84±0.27)(图4)。
3.5。望远镜对亚硝酸盐的影响( )浓度
望远镜的剂量的100和200毫克/公斤提升显著降低亚硝酸盐的浓度(分别为14.09±1.17,13.02±1.51)与腹膜渗出物相比汽车集团(33.05±3.57)。同样,动物用消炎痛治疗(10毫克/公斤)也显示出显著的减少浓度。另一方面,望远镜50毫克/公斤(图没有出现任何显著的影响5)。
3.6。望远镜对TBARS的浓度的影响
望远镜(100和200毫克/公斤)能够降低浓度的硫代巴比土酸活性物种(分别为3.10±0.53,2.40±0.24)相比,汽车集团(4.68±0.32)。同样,消炎痛(10毫克/公斤)减少TBARS浓度(2.94±0.32)。另一方面,任何有意义的结果的望远镜观察到的最低剂量50毫克/公斤(图6)。
3.7。望远镜对Carrageenan-Induced关节残疾
注射角叉菜胶(300μ每100克μL(总量)的股胫关节关节残疾证明造成动物爪子海拔增加车辆组。在目前的研究中,望远镜(100和200毫克/公斤)和吲哚美辛(10毫克/公斤)显示显著显著降低爪子高程时间(PET)在观察4 h,这角叉菜胶注射后24小时。望远镜(50毫克/公斤)显示,在观察期间无显著抑制作用(图7)。
4所示。讨论
化合物含有吲哚核与色氨酸的代谢有关,可能出现配体在不同地区的indolic核心(27]。吲哚环具有杂环结构描述1866年,目前在相当数量的天然化合物主要是从植物(28]。望远镜由一个N-benzoyltryptamine-related化学结构,一个孤立的生物碱的植物物种Myrtopsis myrtoidea(Baill) Guillaumin [2]。此外,最近的一项研究表明没有明显毒性的迹象和任何动物死亡后腹腔内的望远镜在2000毫克/公斤紧随其后的是14天的观察(10]。
Indolic衍生化合物存在于生物组织如色氨酸,褪黑素,和5 -羟色胺是强有力的氢氧自由基隔绝,防止细胞氧化损伤和减轻白细胞游走(27]。因此,carrageenan-induced急性腹膜炎的老鼠被选为调查机制望远镜的抗氧化和抗炎作用。腹腔内接种时,卡拉胶可以增加毛细血管通透性,导致白细胞浸润,溢出的蛋白质进入组织,或渗出物和细胞因子的释放。这些事件是重要的触发炎症过程(29日]。在这种背景下,这个实验模型允许量化细胞迁移到腹腔,涉及炎性细胞因子和趋化因子的角色30.]。
考虑到细胞事件,评价白细胞的存在是炎症反应的重要评估安装。中性粒细胞在几个炎症条件发挥重要和关键的作用[31日]。在这项研究中,动物使用望远镜显示显著减少白细胞的数量和总蛋白在腹膜渗出物。这可能导致炎症的恢复过程。
然后,望远镜调节活动等重要酶复合物髓过氧化酶(MPO),过氧化氢酶(CAT)和亚硝酸盐(NO)含量和硫代巴比土酸活性物种进行了分析。可以经过活化的白细胞释放MPO在时间或在细胞外空间。发布时,它与过氧化氢反应形成的NADPH氧化酶和增加的潜在毒性的氧化剂32]。一项研究表明,抑制MPO活性物质可能出现重要的抗炎活动(33]。在这项研究中,也观察到类似的结果与望远镜或消炎痛治疗组,MPO浓度降低,建议抗炎活性的望远镜在这个过程。
腹膜渗出物中的过氧化氢酶的活性评价。这种酶催化的减少H2O2在H2O消除活性氧,这有助于有效地抗击炎症过程(34]。过氧化氢酶活性的下降是观察研究。这可能与腹膜渗出液白细胞细胞的减少,因为抗氧化剂酶是由线粒体的一部分,主要是白细胞(35]。这项研究表明,过氧化氢酶活性降低减少患者骨髓细胞谱系;然而,从慢性粒细胞白血病患者白细胞增多有很高的过氧化氢酶活性(36]。
活动后,望远镜在腹膜渗出物的亚硝酸盐浓度进行了分析。2号是一个相对短暂的活性物种构成几个生物过程。一氧化氮(NO),它已作为一个重要endothelium-derived放松因素,负责调节血管血流促进血管舒张(37]。考虑到没有参与炎症相关的细胞和分子事件,减少生物合成的激进的使用没有合酶抑制剂,如L-NAME,一直调查作为一个潜在的治疗炎症性疾病的(38]。因此,我们调查了望远镜的作用浓度的亚硝酸盐在老鼠carrageenan-induced腹膜炎。低浓度和极端短半衰期等因素阻碍没有剂量的生物样品(39]。因此,间接测定可以由等离子体硝酸盐和亚硝酸盐的用量40]。动物腹腔内处理望远镜提升显著减少亚硝酸盐浓度的剂量的100和200毫克/公斤。有趣的是,提取得到的分数Alstonia scholarisl .含有生物碱,如picrinine valesamine, escolaricin,含有indolic核的结构,也没有显示抗炎效应的抑制和铂族元素2从花色(41]。
望远镜的抗氧化活性脂质过氧化作用也是调查;众所周知,这种现象是非常有害生物,因为它有利于自由基反应增加细胞损伤(42]。科学文献报道,脂质过氧化反应是直接与动脉粥样硬化等疾病的发病有关,风湿性关节炎,和阿尔茨海默病(43,44]。脂质过氧化造成的损失的评估氧化应激和炎症是由确定硫代巴比土酸活性物种(TBARS)在实验小组。从这个意义上说,动物对待望远镜显示显著的低浓度的TBARS剂量的100或200毫克/公斤与汽车相比。研究表明,吲哚生物碱如16-formyl-alpha-methoxystrictamine tubotaivine和picralinal抑制分泌xylene-induced小鼠耳肿胀。这些生物碱抑制炎症性介质的浓度,如TBARS、铂族元素2, ,和丙二醛carrageenan-induced空气袋在老鼠身上的实验模型(45]。
先前的研究表明,氧化剂的存在在关节滑液有利于脂质过氧化作用和诱导软骨细胞退化和软骨过氧化反应。这些事件是关节炎的发展的一个主要危险因素(46]。在平行,中性粒细胞减少尿酸crystal-induced痛风是重要的炎症过程的逆转(47]。因此,考虑到参与的中性粒细胞迁移,降低氧化应激,望远镜的效果在老鼠carrageenan-induced关节残疾评估。这个测试是基于联合使用的功能残疾通过炎症过程作为衡量(laesa来电显示)。这种技术被广泛用于筛选可能的镇痛和抗炎药物(48- - - - - -50]。
关节炎的感应intraarticular注射角叉菜胶的发展提供了一个模式类似于carrageenan-induced老鼠爪子水肿。卡拉胶在关节腔促进管理的第一个小时的解放介质引起水肿和炎症性多形核粒细胞的快速渗透,导致损坏由于关节发炎时敏化表现为肢体撤军关节按(机械痛觉过敏)51]。carrageenan-induced关节残疾的在这个模型中,望远镜是有效地降低爪子海拔(PET)。NST-treated动物显示减少关节残疾后第一个小时卡拉胶。
化合物含有吲哚核提出antinematode和抗炎活动由5-lipoxygenase作为抑制剂和环氧酶酶,分别将花生四烯酸转化为白细胞三烯和前列腺素(52]。研究报道,吲哚生物碱已经表现出广泛的生物活性,如抗炎活动,因为他们抑制超氧化物阴离子生成和释放人类嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(50- - - - - -53]。他们还具有抗惊厥、心血管和抗菌特性(45]。因此,目前的研究证实了以前的发现,因为我们发现望远镜减少爪子海拔时间与车辆组相比。
5。结论
在这方面,目前的研究证据支持望远镜的抗炎作用及其可能的好处在治疗联合残疾。此外,临床前和临床研究可能相关的关于其潜在的应用程序作为一个有效的抗炎药物和治疗的目的,以确保它的安全。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
旧金山a·奥利维拉和斯坦利·j·g·古铁雷斯概念化的研究。Benedito p·苏萨否决权,旧金山v . m . Cunha布鲁诺戈麦斯,丹尼尔·b·Nunes Layane诉阿莫林,埃弗顿m·洛佩斯开发方法。Benedito P苏萨否决权,费尔南达·r·c·阿尔梅达和旧金山a·奥利维拉表现形式分析和调查研究。Benedito·苏萨否决权和丹尼尔·d·r·丹尼尔·b·Nunes Arcanjo写了初稿。玛丽亚·f·v·苏萨费尔南达·r·c·阿尔梅达和旧金山a·奥利维拉和回顾了文章中写道。斯坦利·j·g·古铁雷斯,玛丽亚·f·v·苏萨和旧金山的a·奥利维拉收集资源。旧金山的a·奥利维拉监督这项研究。
确认
这项工作是支持的斗篷(Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量优越,巴西)(硕士奖学金)和CNPq(慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府,巴西)(Chamada Universal-MCTI / CNPq没有。14/2014)。