文摘
枇杷(枇杷(研究)。采用)。叶子是传统上用来改善肌肉无力,但其对肌肉蛋白质合成的影响需要进一步的研究。因此,我们的目的是调查是否枇杷叶提取物(米歇尔)增强肌肉contraction-induced激活肌肉蛋白质合成信号。雄性Wistar鼠(12周大,n= 6 /组)分为水处理(CON)和米歇尔(米歇尔)治疗组。老鼠注射蒸馏水或米歇尔(1.5克/公斤/天)每天一次口服填喂法为7天。7天,以3 h post-LLE管理、腓肠肌肌在每个老鼠被电刺激的右腿肌肉刺激(EMS) (100 Hz, 30 V)通过五组10等距收缩(7 s收缩,3 s rest)每隔3分钟叠加求交。老鼠被牺牲,双腿的腓肠肌肌肉切除3 h post-EMS。哺乳动物雷帕霉素靶复杂的磷酸化水平1 (mTORC1)信号通路的分子(mTOR Akt, p70S6K)是由西方墨点法。关于蛋白质合成肌肉contraction-induced信号通路,一种蛋白激酶磷酸化在Ser473没有明显反对和米歇尔团体之间的不同。mTOR磷酸化在Ser2448增加了EMS但没有显示反对和米歇尔团体之间的显著差异。p70S6K磷酸化在应对EMS Thr389明显增加,而米歇尔组显示明显高于p70S6K磷酸化在Thr389 CON组。这表明,米歇尔增强肌肉contraction-induced激活p70S6K磷酸化在大鼠骨骼肌。
1。介绍
骨骼肌大约占人体体重的40%;这是一个关键组成部分的日常身体活动和导致的生活质量。骨骼肌质量和强度降低,因为衰老和疾病(1]。严重的骨骼肌肉和力量的损失,如sarcopenia和慢性肾脏疾病相关肌肉萎缩,导致减少流动性(2]。维持骨骼肌肉正常身体活动与此类疾病患者的生活质量是相当具有挑战性。在这种背景下,维持或增加肌肉质量是重要的治疗策略在晚年保持流动性。
哺乳动物雷帕霉素靶复杂1 (mTORC1)是一个关键的调节因子mRNA的起始翻译和已知调节骨骼肌蛋白质合成和随后的肌肉肥大(3]。mTORC1通路的上游组件参与磷酸肌醇3-kinase PI3K / Akt信号。70 kDa核糖体蛋白S6激酶(p70S6K),在信使核糖核酸的翻译起始扮演着重要的角色,是一个关键的下游mTORC1的目标。因此,mTORC1信号(Atk-mTOR-p70S6K)被认为是参与mTORC1活动和随后的肌肉蛋白质合成(4]。
一些传统草药,如Go-sha-jinki-Gan,黄芪多糖,踝骨基数,显示潜在的治疗效果在sarcopenia和疾病相关肌肉萎缩(5- - - - - -7]。然而,临床试验使用传统的草药治疗sarcopenia和疾病相关肌肉流失仍然缺乏,需要今后进一步的调查。枇杷(枇杷(研究)。采用)。叶子已经在几个国家作为传统草药治疗咳嗽和恶心8,9]。枇杷叶提取物(米歇尔)已被证明能够有效地防止aging-induced骨骼肌损失(10]。此外,一项研究表明,米歇尔补充剂抑制dexamethasone-induced减少肌肉力量在Sprague-Dawley老鼠11]。总的来说,这些结果表明使用米歇尔作为治疗剂的可能性,以防止骨骼肌萎缩。增强肌肉蛋白质合成,减少肌肉分解肌肉无力的重要治疗方法。然而,米歇尔对肌肉蛋白质合成的影响仍然未知。
阻力训练能提高骨骼肌质量由肌肉蛋白质合成通过mTORC1信号通路(12]。一项研究表明,米歇尔增强mTORC1信号(Akt-mTOR-p70S6K) [10]。均衡的营养和运动的结合被认为是一个有效的策略来增加肌肉质量。我们因此推测,米歇尔刺激mTORC1信号和增强mTORC1信号结合抵抗运动。要测试我们的假设,我们调查的影响,米歇尔独自,结合阻力运动对大鼠骨骼肌mTORC1信号通路。总的来说,本研究的目的是调查是否米歇尔增强肌肉contraction-induced激活蛋白质合成信号。
2。材料和方法
2.1。枇杷叶提取
干枇杷叶(中国,HB60511)从Uchidawakanyaku购买(日本东京)。米歇尔是如前所述,修改(7,11]。20克的米歇尔是碎成粉末,在200毫升蒸馏水浸泡30分钟23±1°C,在小火煮30分钟。汤是经过筛网过滤器和离心机在4000 rpm 12分钟23±1°C。上层清液过滤,储存在−80°C到使用。米歇尔的浓度大约是0.25克/毫升。高效液相色谱法(HPLC)表明,乌索酸的量(UA)为7.16毫克/ 100毫升的米歇尔和0.4毫克/公斤体重/天。
2.2。动物实验
研究协议批准的顺天堂大学动物保健委员会(19-07)。先前描述的肌肉电刺激(EMS)全身的肌肉收缩协议后(13)做了一些调整。十二个雄性Wistar鼠(12周)分为两组和管理米歇尔或蒸馏水后一周的适应。老鼠从日本购买SLC, Inc .(日本静冈县)和安置在控制环境条件下(23±1°C, 55±5%相对湿度)下12 h与随意光/暗周期获得水和一个标准实验室的饮食。老鼠服用米歇尔(1.5克/公斤/天)11]或蒸馏水intragastrically通过口服填喂法使用喂养针(Fuchigami Kikai,京都,日本)光异氟烷麻醉,一天一次7天。所有群体都饿死前12 h政府的第七天。7天,3 h政府后,老鼠麻醉在感应室3.0%异氟烷和21% O2和78% N2。右边的头发低后肢剃,删除使用脱毛霜。每个麻醉老鼠容易被放置在一个摇篮专门为刺激右侧腓肠肌肌。在一个典型的实验中,由气体通过面罩吸入麻醉是维护不断提供2.0%异氟烷和21% O2和78% N2,使用一个开路气体麻醉机。一个电极放置在膝关节,另一个是放在脚跟。脚是固定在踏板在90°伸展腓肠肌肌肉。电刺激器是用于单相矩形脉冲放电。腓肠肌肌右腿的老鼠受到EMS (100 Hz, 30 V)通过五组10等距收缩(7 s收缩,3 s rest)每隔3分钟叠加求交。老鼠被心脏切除,牺牲和腓肠肌肌肉EMS后收集3 h。双腿的腓肠肌肌肉得到了水处理的大鼠(CON)和米歇尔(米歇尔)治疗组(n= 6 /组)。
2.3。免疫印迹分析
腓肠肌肌肉在液态氮冷冻和粉状其次是同质化T-PER组织蛋白质提取试剂(美国热科学、沃尔瑟姆,MA)含有蛋白酶(热科学)和磷酸酶抑制剂(罗氏、巴塞尔、瑞士)。蛋白质浓度测定采用BCA化验试剂按照制造商的指示(热科学)。肌肉蛋白质提取物(20μg)在10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和electroblotted PVDF膜。膜是孵化Tris-buffered脱脂牛奶5%生理盐水/渐变20 (TBST) 1 h 23±1°C,紧随其后的是隔夜孵化主要抗体在4°C。所有抗体都从细胞信号技术购买(丹弗斯、马、美国),包括phospho-Akt Ser473(猫。不。4060年),总Akt(猫。不。4691),phospho-mTOR Ser2448(猫。不。5536年),总mTOR(猫。不。 2983), phospho-p70S6K Thr389 (cat. no. 9234), and total p70S6K (cat. no. 2708). Blots were washed thrice with TBST and incubated with a horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody (1 : 5000 dilution) for 1 h at 23 ± 1°C. Blots were again washed thrice with TBST and developed using an ECL chemiluminescence substrate (Amersham, Buckinghamshire, UK). Band intensities were quantified using the Image Lab v.5.2.1 software (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). The blots were then stained with Ponceau S to verify equal protein loading.
2.4。统计分析
所有的数据都表示为平均值±标准偏差(SD)。统计分析了利用双向方差分析其次是图基的事后测试使用GraphPad棱镜5软件(美国圣地亚哥,CA)。统计学意义是 。
3所示。结果与讨论
3.1。体重、进水口和饮食摄入
体重、进水口和饮食摄入量没有显著不同米歇尔和蒸馏水组后7天(数据没有显示)。
3.2。肌肉Contraction-Induced肌肉蛋白质合成信号
关于肌肉contraction-induced mTORC1 (Akt-mTOR-p70S6K)信号,一种蛋白激酶磷酸化在Ser473不是针对EMS(图的影响1)。mTOR磷酸化在应对EMS Ser2448增加,但没有明显反对和米歇尔组(图之间的不同2)。p70S6K磷酸化在应对EMS Thr389明显增加,而米歇尔组显示明显高于p70S6K磷酸化在Thr389相比CON组(图3)。
4所示。讨论
在目前的研究中,我们调查了枇杷的影响(枇杷(研究)。采用)叶提取物对肌肉contraction-induced激活蛋白质合成信号。我们的研究结果表明,米歇尔独自管理并不影响mTORC1信号,但它增强肌肉contraction-induced mTORC1信号通过激活p70S6K磷酸化在Thr389鼠骨骼肌。这些发现表明,米歇尔的影响管理mTORC1信号没有添加剂,但协同与肌肉收缩。另一方面,我们的研究结果表明,米歇尔政府大幅度增加p70S6K Thr389磷酸化,但没有显著改变一种蛋白激酶磷酸化Ser473的价格相比对照组。在先前的研究中,一种蛋白激酶磷酸化(Ser473)受到米歇尔治疗体外(10]。因此,米歇尔的影响可能在不同的体外和体内设置。
先前的研究已经证明mTOR / p70S6K之间的关系和肌肉蛋白质合成。小笠原群岛和Suginohara报道,促进肌肉蛋白质合成的抵抗运动(经皮电刺激诱发肌肉收缩)是由mTOR (rapamycin-sensitive mTORC1和rapamycin-insensitive mTORC1或mTORC2) (14]。然而,最近的一项研究报道,运动性蛋白质合成mTOR / p70S6K无关。你等人报道,蛋白质合成的机械加载mTORC1-independent myotenectomy-induced肌肉肥大(15]。不同的实验方法诱导肌肉hypertrophy-like电刺激或myotenectomy-induced肌肉肥大也可能导致肌肉蛋白质合成的不同途径。因此,mTOR / p70S6K表达式和肌肉蛋白质合成之间的关系尚不清楚。我们没有阐明mTOR / p70S6K和肌肉蛋白质合成之间的关系由EMS在这项研究中。然而,EMS-induced增加肌肉蛋白质合成受mTOR / p70S6K信号(14]。
Figueiredo等人证明mTOR Ser2448是负面反馈循环机制的一部分涉及p70S6K磷酸化(16]。然而,mTOR Ser2448磷酸化可以诱发肌肉contraction-induced激活mTORC1和p70S6K磷酸化在先前的研究17,18]。此外,抑制Akt Ser473磷酸化被发现减少p70S6K Thr389磷酸化在一项研究19]。总的来说,这些发现表明一种蛋白激酶的磷酸化Ser473, mTOR Ser2448,和p70S6K Thr389激活肌肉收缩和在肌肉contraction-induced肌肉蛋白质合成中扮演着中心角色。
许多活性化合物,包括UA,已确定在米歇尔。一个体内研究表明,UA可以减少肌肉萎缩和肥大刺激(20.]。此外,UA增强p70S6K磷酸化Thr389但不影响一种蛋白激酶磷酸化在应对Ser473抵抗运动(21]。相反,慢性UA管理局(6周)被发现影响一种蛋白激酶磷酸化在一项研究22]。然而,一个政府的UA并不影响一种蛋白激酶磷酸化(ser473) [21]。因此,米歇尔的影响可能在不同的单一和慢性政府。这些发现与目前的研究是一致的。在这里,我们调查的影响,米歇尔mTORC1信号在肌肉收缩后3小时以内。小笠原群岛等al.indicated UA增强p70S6K磷酸化Thr389 6 h后抵抗运动,但并不影响一种蛋白激酶磷酸化Ser473 [21]。UA的主要影响肌肉contraction-induced mTORC1信号被认为通过p70S6K发生。我们的研究结果表明,米歇尔增强mTORC1信号通过激活p70S6K Thr389。但是,还需要进一步的研究来确定的最佳时间点contraction-induced蛋白质合成后肌肉收缩米歇尔管理。
这项研究有一些局限性。首先,我们评估肌肉收缩后只有一个时间点。其次,研究了蛋白质合成信号通路只是局限于mTORC1 (Akt-mTOR-p70S6K)信号通路。因此,它不检查mTORC1通路的上游组件,这是已知参与一种蛋白激酶和细胞外signal-regulated激酶1/2 (ERK1/2)信号23mTORC1)和下游目标,包括真核起始因子4 e结合蛋白1 (4 e - bp1)和p70S6K,两者都扮演了一个重要的角色在信使核糖核酸的翻译起始。第三,肌肉蛋白质合成并没有评估在这个研究。这些限制需要在将来的研究中得到解决。
5。结论
总的来说,我们的研究结果表明,米歇尔增强肌肉contraction-induced激活p70S6K磷酸化在Thr389鼠骨骼肌。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
信息披露
这个手稿的一部分是第十届国际会议上脆弱Sarcopenia研究和Geroscience (ICFSR) 3月11 - 13日,2020年,法国图卢兹。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是支持由jsp KAKENHI补助金(16 k12940 16 h03205 19 k22820 SM,和19 k19887 Y-LH)、卫生、体育和医学研究所顺天堂大学,日本妇女研究中心的顺天堂大学体育和科学研究补助金的社会对女性的健康科学研究(ROHTO制药有限公司)。作者要感谢先生偏向Cirak与实验提供支持。