文摘

的代表密切相关的中药材(机)起源于芸香科、Aurantii果实immaturus(AFI),Aurantii果实(AF),Citri reticulatae pericarpium viride(CRPV),Citri reticulatae pericarpium(CRP)有更好的功能调节和促进胃肠蠕动。然而,质量的差异密切相关柑橘类测量机直到现在尚未透露。在此,本研究集中在系统的分化密切相关的、深入的理解柑橘类机通过策略集成化学计量学和网络药理学。由超高液相色谱,九类黄酮的内容显示明显的波动在不同物种的汤块(柑橘橙林奈和柑橘网状布兰科),减少水平成熟水果的样本。汤块从不同物种和成熟阶段的正交投影潜伏structure-discriminate分析(OPLS-DA)和聚类分析。结果,四个活性成分包括narirutin,柚苷配基,橘皮苷,3,5,6,7,8,3′,4′-heptemthoxyflavone被过滤掉变量重要性的投影(VIP)值(VIP > 1.0),视为chemotaxonomic标记。此外,components-targets-diseases网络构造通过创新路径分析(IPA)和四个chemotaxonomic标记之间的相关性预测,223年的目标,和三种疾病包括结肠炎、乳腺癌和结肠直肠癌。结果将密切相关的识别具有重要意义柑橘类机和有助于提高测量机的资源利用率。

1。介绍

柑橘类水果,被称为药用和食用植物同源,起到了至关重要的作用在中国传统医学(中医)实践和广泛应用了几千年由于其更大的生物活动,丰富的资源和低毒性(1]。中国药典规定的果实柑橘橙林奈或其品种收获应该使用在5月和6月Aurantii果实immaturus(AFI),这些收获7月受聘Aurantii果实(AF);此外,果皮柑橘网状布兰科8月至12月期间或其品种收获应该被视为Citri reticulatae pericarpium(CRP),这些应该作为7月收获Citri reticulatae pericarpium viride(CRPV) [2]。由于其特殊的治疗效果,四个汤块用来执行不同的用法。AFI常被用来消除痰滞气消散,而房颤缓解胃肠消化不良温柔但有效的方式(3,4]。CRPV主要是用来促进肝脏气的流动,而c反应蛋白通常被用来加强脾和消除痰(5,6]。然而,不同的化学特性的四个汤块没有被系统地报道,这并不有利于了解不同的临床应用。

组件及其功效之间的关系有助于理解CMM的理性的临床应用。网络药理学是一种理想的方法,利用生物信息学预测草药成分的作用机理通过多组分和多目标的策略7]。它通常用于澄清CMM的药效学基础和机制,如人参(8)、甘草(9),黄芪(10]。网络药理学可以预测组件和疾病之间的关系,这将有助于更好地理解质量的差异密切相关柑橘类测量机。

目前,相关报道主要集中在分析化学成分和密切相关的内容柑橘类测量机采用高效液相色谱法(HPLC) [11- - - - - -13),液相色谱-光谱法(质)14- - - - - -17),气相色谱分析-质谱法(gc - ms) [18,19]。此外,研究人员建立了多种策略区分密切相关柑橘类机用最优化方法基于定性或定量数据。易等人发现CRP的挥发性化学特性和CRPV结合气相代谢组学分析化学计量学(20.]。李等人建立了一个全面的战略AFI的比较和AF通过集成HPLC和gc - ms分析和最优化方法(21]。根据UPLC-Q-TOF-MS-based代谢组学,赵等人描述变量chemotaxonomic标记和四个密切相关的代谢机制柑橘类机(22]。这些方法可以成功地歧视密切相关柑橘类机高敏感性和良好的特异性的优点,促进更好的理解不同的药用价值。然而,报道方法受到一些限制,如有限数量的集中化合物进行定量分析,综合分析的缺陷定量analysis-chemometrics-network药理学歧视四密切相关柑橘类测量机。

,一个全面的战略整合九类黄酮和化学计量学分析的量化是首先提出识别四个紧密相关柑橘类测量机。本研究主要集中在分析黄酮类化合物在AFI,房颤,c反应蛋白,并通过UPLC-variable CRPV波长检测方法。不同的物种(C。橙l和C。网状布兰科)、发展阶段(AFI房颤,CRPV和CRP)显然是歧视通过正交信号校正偏最小squares-discriminate分析(OPLS-DA)和聚类分析。通过变量投影(VIP)值的重要性,narirutin (Nar),橘皮苷(Hed),柚苷配基(唠叨),3,5,6,7,8,3′,4′-heptemthoxyflavone(玫瑰)确定为潜在chemotaxonomic标记。此外,创造力通路分析(IPA)应用于预测之间的关系四个化学标记和三种疾病包括结肠炎、乳腺癌和结肠直肠癌。总之,本研究的目的是提供一个简单和方便的策略来更好地了解不同特征的四个紧密相关柑橘类测量机。

2。材料和方法

2.1。试剂和材料

甲醇和乙腈(高效液相色谱级)是由Sigma-Aldrich制造公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。甲酸是购自上海阿拉丁生化科技有限公司(上海,中国)。水是由Milli-Q纯化水净化系统(美国微孔,Billerica的)。参考标准,包括narirutin (Nar),柚皮苷(南),橘皮苷(Hed) neohesperidin (Ned),柚苷配基(唠叨),川陈皮素(不),3,5,6,7,8,3′,4′-heptemthoxyflavone(玫瑰),和tangeretin (Tar),从上海得到原液生物技术有限公司(上海,中国)。Poncirin()从上海得到标准生物技术有限公司(上海,中国)。

八十批次的样品包括20批AFI (AFI1-AFI20编号),20批AF (AF1-AF20编号),20批CRP (CRP1-CRP20编号),和20批CRPV(编号CRPV1-CRPV20)从药材市场,购买的详细信息如表所示S1。所有样品都存入国家重点实验室基于组件的中药,天津中医药大学(天津)。

2.2。标准溶液的制备

九个标准组件被直接准确地加权和溶解在甲醇获得9个股票的解决方案对Nar浓度为4.148毫克/毫升,11.998毫克/毫升Nan, 7.002毫克/毫升Hed, Ned 10.006毫克/毫升,2.416毫克/毫升穷,1.505毫克/毫升唠叨,1.511毫克/毫升,0.051毫克/毫升消息灵通的,分别为焦油和0.559毫克/毫升。之后,混合溶液制备最终浓度为0.581毫克/毫升,Nar南1.320毫克/毫升,0.572毫克/毫升Hed, Ned 1.301毫克/毫升,0.338毫克/毫升穷,0.211毫克/毫升唠叨,0.060毫克/毫升,0.003毫克/毫升消息灵通的,分别为焦油和0.050毫克/毫升。随后,工作的解决方案是稀释成一系列不同浓度建立校准曲线的标准解决方案。

2.3。样品溶液的制备

准确称量样品粉末(0.2 g)转移到锥形瓶,用近30毫升甲醇为30分钟60°C。离心(18213 g, 10分钟)后,上层清液注入了UPLC系统检测Nar,南Hed,内德,穷,唠叨,不是,玫瑰和焦油。只有AFI和房颤,上层清液受到稀释5倍甲醇分析南和内德。

2.4。UPLC分析

量化的主要化合物从样品上执行ACQUITY UPLC h级+系统(水公司,米尔福德,妈,美国)。0.2%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)是用来执行的分离ACQUITY UPLC®本·C18列(100毫米×2.1毫米,1.7μ在35°C m)。流量为0.3毫升/分钟。采用梯度洗脱程序如下:19 - 25% B在0 - 4分钟,25 - 60% B在4分钟,60 - 90% B在11至15分钟。不同检测波长进行相应检测的主要化合物,Nar与0 - 9分钟280海里,南Hed,内德,穷,和唠叨,在10 - 15分钟和330海里,玫瑰和焦油。进样体积是2μl

2.5。方法学验证

用于测试的可行性分析方法测试化合物的定量分析,精密(内部和interday)、稳定性、线性、检测极限(LOD),量化的限制(定量限),重现性,恢复系统的验证。盘中和interday精度进行评估通过执行六个复制在同一天注射,连续三天,分别。样品的稳定性方案准备在室温下进行重复注射(0,2,4,6,8,10,12 h,分别。两个复制校准曲线建立了基于峰面积(y)和相应的浓度(x)的测试化合物。LOD和定量限计算信噪比(S / N)约3和10使用标准的解决方案,分别。6个样品的解决方案从同一批次进行分析,确认可重复性。复苏调查通过分析六个示例解决方案处理,加入适量的0.1 g标准溶液的样品粉末。

2.6。创新途径分析

四个测试化合物的结构包括玫瑰,Nar, Hed,唠叨从PubChem下载数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[23]。潜在的人类目标的四个组件从瑞士获得目标预测数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)[24]。所有目标都导入到Microsoft Excel软件删除重复的值。音标是用来预测化合物的规范化途径和网络,目标,并根据已知疾病基因和蛋白质之间的相互作用。

2.7。数据分析

Originpro 2016软件(美国马Originlab公司北安普顿)和SIMCA 14.1软件(Umetrics、期刊、瑞典)被用于数据的统计分析。复制目标被Microsoft Excel 2016(美国雷德蒙的微软公司(Microsoft Corp .),佤邦)。

3所示。结果与讨论

3.1。优化提取条件和方法的验证

类黄酮在柑橘类CMM所示与治疗肝损伤,调节胃肠蠕动,和其他生物活性(25]。UPLC、9个黄酮类化合物包括Nar Nan, Hed,内德,穷,唠叨,不是,玫瑰,焦油是理想的分离在15分钟(图1)。

(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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(e)
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图1
代表UPLC色谱的混合标准溶液(a)和示例解决方案的CRPV (b)、c反应蛋白(c), AF (d), AFI (e) (1。Nar 2。南3。Hed 4。内德,5。穷,6。唠叨,7。不是,8。消息灵通的,9。焦油)。

为了满足最大化的关键挑战的萃取效率测试化合物与不同的分化极性相同的提取条件下,最好是采用“蜘蛛网”模式优化提取条件根据我们组多变量估值方法(26- - - - - -30.]。表达简洁,测试化合物的峰面积每克被分配一个米- - - - - -k相应地,除以他们最大的峰面积(一个k(马克思))给E米- - - - - -k。见公式(1),k来标示不同的化合物,和米代表不同的提取条件(不同的溶剂,不同的固液比,和不同萃取时间)。Em k是用于构造不同维度的“蜘蛛网”模式(p我在公式()2)。阴影面积越大,越接近最优的提取条件。两个维度之间的角被标记为α(α= 360°/n,n= 9)。

提取溶剂四汤块进行调查,包括50%和75%甲醇水溶液和甲醇(60°C)(图2)。下声波降解法和甲醇在60°C,“蜘蛛网”的阴影区域四个汤块表现出最大的价值。AFI,作为一个典型样本,受到优化固液比(1:100年,1:125年,1:150年,和1:200)和提取时间(10分钟、20分钟、30分钟、40分钟),获得最佳提取条件。总之,最好的提取是通过与甲醇超声提取样品粉末(溶剂/材料在150:1)60°C为30分钟。


图2
优化提取条件的“蜘蛛网”模式,包括萃取剂、固液比、超声时间。

优化的提取方法为方法学验证铺平了道路,展示在表的详细结果1。盘中interday精度是好的和相对标准偏差(RSD)小于3.0%。9测试化合物的rsd为低于2.8%在12 h在室温下的稳定性研究。9测试组件的校正曲线建立了确定系数(r2在测试)超过0.999,显示良好的线性范围。LOD和定量限值低于0.1120μ和0.5872克/毫升μ分别g / mL。再现性研究的结果是令人满意的,rsd小于3.0%的测试化合物。此外,平均回收率范围从92.65%到106.98%,RSD小于2.8%。因此,所建立的方法可成功地用于后续研究。

表1
总结线性回归的结果,钟表、定量限、精密度、重复性、稳定性和恢复AFI的测试化合物。
3.2。9测试化合物的定量分析在四密切相关柑橘类测量机

由验证UPLC-variable波长方法,9类黄酮的含量80批次的样品表现出表S2。为了直观和清楚地显示分布的内容有趣的类黄酮在煎煮,我们标准化的相关内容,并表达了他们的数据,计算了Ck/ Ck(马克思)(化合物的内容分为的最大内容相应的化合物,k表示不同的化合物)。如图3,九个黄酮类化合物的相对含量较大的波动在两个物种的样本(c .橙l .,c .网状布兰科)。各种化合物的内容可以达到2.02 - -46.96毫克/克Nar (RSD = 83.99%), 1.53 - -186.51毫克/克Hed(RSD = 109.68%), 0.22 - -6.91毫克/克没有(RSD = 100.46%), 0.03 - -0.91毫克/克玫瑰(RSD为89.94%)和0.10 - -4.21毫克/克焦油(RSD = 110.81%),分别为。南、Ned和穷没有检测到C的果皮。网状布兰科的内容在C的水果。橙l的范围在0.52 - -117.24毫克/克(RSD = 40.16%), 0.57 - -195.73毫克/克(RSD为65.07%)和0.00 - -5.16毫克/克(RSD = 68.45%),分别为。唠叨的内容之间的样品是0.02和3.17毫克/克(RSD = 106.86%),除了c反应蛋白。


图3
九个黄酮类化合物的相对含量80批次样品的四个紧密相关柑橘类测量机。

组件的特点的积累两个物种在不同的发展阶段进行了研究。水果的C。橙l,the contents of the tested components were higher in AFI than in AF except for Hep, and the total content in AFI was significantly higher (the average value was 219.36 mg/g) than that in AF (the average value was 101.87 mg/g). The result suggests that as fruits become ripe, the total content of flavonoids decreases correspondingly. Similarly, in the pericarp of C.网状布兰科,集中分析物的总含量可达189.39毫克/克CRPV,而73.76毫克/克在c反应蛋白测定。这可能是由于样品的不同表型的次生代谢产物在不同成熟阶段(21,22]。一般来说,生样品中黄酮类化合物的含量(AFI或CRPV)更丰富的比成熟的样品(房颤或c反应蛋白)。

3.3。歧视密切相关的柑橘类测量机的化学计量学

多元统计方法的主要工具之一,主成分分析(PCA)通常是用来建立一个低维平面或空间可视化分类趋势样本(31日,32]。它也被用来从数据删除离群值(33]。通过引入正交信号校正(OSC)过滤器,变异X(描述符变量)被降低模型复杂度通过正交投影潜伏structure-discriminate分析(OPLS-DA),这是不相关的Y(属性变量)来实现良好的歧视样本(34,35]。此外,它一直成功地应用于研究代谢组学和机36- - - - - -39]。

保证模型的准确性,离群值(AFI8、AF4 CRPV2, CRPV6, CRP11,和CRP13)被移除之前的建设利用主成分分析法(PCA)区分模型(图S1)。如图4(一)AFI,房颤,CRPV和CRP成功歧视的第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2),分别占52.4%和16.2%。的适合OPLS-DA模型被显示R2X(0.976)和R2Y(0.886)。OPLS-DA模型goodness-of-prediction (问2= 0.864)。评估预测能力,OPLS-DA模型的交叉验证(图S2)。结果证明该模型有效成立。如图4 (b)玫瑰,Nar Hed,唠叨被过滤掉变量重要性的投影(VIP)值(VIP > 1.0),被视为chemotaxonomic标记识别四密切相关柑橘类测量机。

(一)
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图4
歧视四密切相关柑橘类测量机由OPLS-DA (a)和VIP值的测试化合物(b)。这些化合物被标记为红色,对样本的分化有重要影响。

此外,集群的热图是用于显示黄酮类化合物的相对含量的趋势和分类样本(图之间的关系5)。红色框表示内容发生在更高层次与样本的平均水平相比,在一个蓝色的箱子中意味着较低的内容。与此同时,分类集群与OPLS-DA的结果是一致的。四个紧密相关柑橘类机是杰出的。总的来说,化学计量学被证明是一种可行的策略来区分属机密切相关。


图5
集群的热图分析基于类黄酮的含量四个汤块。
3.4。分析网络药理学的Chemotaxonomic标记

作为一个受欢迎的战略、创新路径分析(IPA)可以用来预测组件间的相关性,通过独特的算法和目标,和疾病报告文学(40]。重点筛选chemotaxonomic标记包括玫瑰,Nar, Hed,唠叨,components-targets-diseases网络构造的理解密切相关的质量差异柑橘类测量机。

使用PubChem数据库,我们得到消息灵通的的结构,Nar, Hed,唠叨。232年瑞士目标预测数据库(表的目标S4)被玫瑰的信件,Nar, Hed,唠叨,在删除冗余目标人类作为一个有限的物种。然后,223年的目标都集中在异丙醇为核心的分析。此外,465规范的途径和21网络说明,揭示目标和炎症之间的密切关联,癌症和神经系统疾病。如图6(一)行表示,黄色的阈值 。排名的目标和途径之间的关系显示,这些目标的规定分别由测试化合物可能具有抗炎,抗肿瘤,通过引发信号通路和神经活动,结直肠癌转移信号通路,CERB神经信号。相关的疾病,包括乳腺癌,结肠癌,结肠炎,选择components-targets-diseases网络的建设。四个化合物,223年的目标,和三个疾病结合利用“通路设计师”的功能。如图6 (b)148年,126年的目标是与乳腺癌有关,与结直肠癌相关目标,分别和54目标参与结肠炎。Hed,推测玫瑰,Nar和唠叨对结肠炎的治疗起到诱导作用,乳腺癌,结肠癌,与一些文献报道一致41- - - - - -43]。

(一)
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(b)
(b)
图6
十大通路有关的目标chemotaxonomic标记(a)。网络图的components-targets-diseases (b)。(蓝色代表chemotaxonomic标记,红色代表了疾病,和其他颜色代表目标在不同的位置)。

4所示。结论

介绍工作,建立UPLC-variable波长检测方法显示接受的线性,精度、可重复性和准确性,成功地用于9个主要黄酮类化合物的定量分析四个紧密相关柑橘类测量机。总黄酮类化合物含量波动明显不同的物种(C。橙l和C。网状布兰科),到期两个物种减少。同时,OPLS-DA,聚类分析被用来执行优秀AFI的歧视,房颤,CRPV和CRP。OPLS-DA,筛选化合物与贵宾(VIP > 1.0)值被认为是四chemotaxonomic标记(玫瑰,Nar Hed,唠叨)。此外,components-targets-diseases网络开发显示chemotaxonomic标记和疾病之间的相关性结肠炎,乳腺癌和结肠癌通过集中目标。本研究首先提出了一种综合策略,同时比较四个紧密相关柑橘类测量机基于类黄酮的含量,这可能提供了一个简便的方法研究属机密切相关。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Qixuanμ和yap张构思设计的概念和研究方法。应崔新柴,Junlian刘建议提供方法和目标搜索。李Yongzhi Huijuan Yu,跃飞王抛光和修订后的手稿。所有作者同意最后的手稿。Qixuanμ和yap张写的手稿。Qixuanμ和本文yap张同样的贡献。

确认

这项工作是支持的科技发展基金天津市教育委员会高等教育(2018 zd02)。

补充材料

四表S1:样本信息密切相关柑橘类测量机。表S2:九类黄酮的含量四密切相关柑橘类测量机样品(毫克/克,n= 3),“-”,信号低于LOD。表S3:所有的目标对应于四个chemotaxonomic标记。利用主成分分析法(PCA)图S1:离群值确定分数从AFI (a), AF (b), CRPV (c),分别和CRP (d)。红色圆圈表示异常样本。图S2:排列测试(n= 200)执行给(R2= (0.0,0.0107),问2= (0.0−0.202)]AFI (a), (R2= (0.0,0.0153),问2= (0.0−0.196)]AF (b)、(R2= (0.0,0.000873),问2= (0.0−0.218)]CRPV (c)和(R2= (0.0,0.0089),问2= (0.0−0.21)]OPLS-DA CRP (d)。(补充材料)