文摘

客观的。Polyherbal配方Jathyadi Thailam和Jatyadi Ghritam(JT)在印度传统医学用于糖尿病慢性伤口,瘘,裂缝,湿疹,燃烧管理。我们旨在调查原油的抗菌、抗炎作用乙醇提取物和正己烷JT配方。方法。抗菌活性的JT提取测试估计最低抑制浓度对九参考菌株(麦克风),其中包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐多药(MDR)铜绿假单胞菌,methicillin-susceptible临床菌株S.aureus(MSSA),所有参与糖尿病足感染。植物提取物的抗炎活性是评价LPS-treated巨噬细胞细胞通过测量mRNA水平和分泌炎症介质。结果。的抗菌活性JT提取物对革兰氏细菌(+)较高,与中等收入国家不同从1.95到62.5毫克/毫升。克(−)细菌只有容易乙醇提取物JT。植物提取物被发现是最活跃的参考和临床菌株MSSA,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,biofilm-forming美国epidermidis。JT提取有效剂量依赖性地抑制mRNA的表达和蛋白质的分泌促炎细胞因子il - 6和il - 1β和趋化因子MCP-1 CXCL10 LPS-challenged巨噬细胞。结论。在目前的研究中,我们已经表明,提取的JT配方具有强大的抗菌、抗炎作用,可能参与了慢性伤口愈合活动和有潜力用作外部管理的附加治疗耐多药在伤口的细菌感染。

1。介绍

糖尿病是一种慢性代谢性疾病,其特征是长期的高血糖,这可能导致眼睛、肾脏、神经、血管损伤,无法愈合的伤口1,2]。正常止血的伤口愈合过程包括重叠的阶段,炎症扩散,改造和需要协调的巨噬细胞之间的相互作用,成纤维细胞,角质细胞、上皮细胞和信号分子。巨噬细胞在炎症阶段发挥重要作用的伤口修复杀死病原体,清理受损组织,并产生生长因子诱导血管生成,胶原沉积,伤口关闭(3]。在伤口愈合障碍与糖尿病有关,它展现出M1-polarized巨噬细胞的长期积累与促炎细胞因子水平升高和降低各种生长因子的水平。它已经表明,il - 1β肿瘤坏死因子-α、il - 6和MCP-1水平维持在高水平在糖尿病小鼠的慢性伤口和人类4]。

此外,居民的糖尿病伤口环境细胞及其分泌的信号分子可以显著影响伤口的细菌群落。它已经表明,糖尿病老鼠伤口接种铜绿假单胞菌生物膜显示更高水平的il - 1β甚至比控制伤口il - 6在4周postwounding [5]。糖尿病足溃疡感染(DFI),大多是幼童腹壁薄弱涉及有氧和厌氧细菌生长在协同作用[6,7]。最近的研究显示,克(+)球菌,大多金黄色葡萄球菌,主要负责微生物DFI在西方国家,但在亚洲和非洲,克(-)杆菌是主要的。在金黄色葡萄球菌病原体,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)被发现在11%的DFI隔离(8]。全球耐多药细菌感染的增长作为一个严重的问题,这促使急需寻找替代方案。

药用植物和草药的使用与油或澄清黄油油类产品印度传统医学是一种常见的做法。这些实践有供奉在传统书籍作为药用油(Thailam)和药用澄清黄油或酥油(Ghritam) [9,10]。这个研究的前景看起来一个Ayurveda-based polyherbal配方,Jatyadi广泛用于传统医学对慢性伤口(包括糖尿病伤口)、溃疡、湿疹、烫伤、烧伤治疗局部应用程序(11,12]。药典版本的Jatyadi (Jatyadi Ghritam),就像在印度阿育吠陀规定(AFI),由11种药草和蜜蜂蜡(Sikta)和硫酸铜(Tuttha)[10]。Jatyadi Thailam (JT_AFI)也准备在芝麻油基地而不是澄清黄油如上所述的药典版本Jatyadi Ghritam,而不改变草本成分。JT_AFI显示显著临床疗效在治疗糖尿病伤口后申请10天,45天的随访未见复发(13]。严重的红皮病的另一个临床病例显示,病变完全缓解后三个月的外部应用程序JT_AFI连同其他肠胃外的药物(14]。一个非常初步的尝试已经取得了理解的作用机制JT Thailam通过切除治愈伤口模型大鼠(15),JT Ghritam在diabetes-induced老鼠16]。有趣的是,还有另一个传统版本的这个配方,即Jatyadi Thailam (JT_YG),这是用于在南印度类似的迹象。这个配方的组成(JT_YG)是不同于JT_AFI和是Yogagrantha中引用的文本17]。JT_YG由13个草药强化在椰子油。的JT_YG制定尚未评估使用现代方法,尽管它在临床实践中用于治疗慢性伤口(18]。

本研究的目的是评估己烷的生物活性(JT_AFI十六进制,JT_YG十六进制)和90%乙醇(JT_AFI情感表达,JT_YGee)提取的草本分数JT_AFI和JT_YG配方体外。抗菌研究JT提取是通过汤采用方法估计其麦克风对九个参考克(+)和克(−)菌株和MSSA临床菌株,所有参与糖尿病足感染。植物提取物对促炎细胞因子和趋化因子的影响基因表达和蛋白质分泌检查使用脂多糖(LPS)——刺激人类THP-1巨噬细胞细胞作为模型来理解反应在分子平面的网络在糖尿病伤口的炎症阶段。

2。材料和方法

2.1。收集和验证的植物材料

新鲜植物材料的收集和各地Palghat喀拉拉邦,印度,和干草药收集从各自的草经销商在印度。样本然后在费舍尔验证标本(FRC)树森林研究所的遗传学和育种,哥印拜陀,认可的英国皇家植物园和经Kunjikanan博士。标本被存入FRC凭证编号为所有单个的草药,除了小檗属植物aristata,从24222年到24242年。香草和凭证的细节数据总结表1和表2。小檗属植物aristata根是确定基于API [phytopharmacognostic方法如上所述19]。

2.2。制备和提取的植物材料

所有的植物材料都风干阴影粉。1000克的变种JT草药混合物在4 L顺序提取非极性溶剂正己烷(十六进制)和极性溶剂90%乙醇(EE) 6小时在室温下通过热渗滤法使用索氏仪器。90%乙醇提取物和正己烷集中200毫升和250毫升,分别进行定性和定量分析的植物化学的概要文件。集中提取进一步蒸发,EE提取冻干删除最后的水的痕迹。获得的收益率2.14% (w / w)JT_YG十六进制,3.58% (w / w)JT_YGee(半固体),0.72% (w / w)JT_AFI十六进制,3.33% (w / w)JT_AFIee(半固体)。

股票的解决方案的0.1克/毫升的提取90%的最终DMSO浓度进行了细胞培养分析和股票的解决方案0.5克/毫升50%的最终DMSO溶液和0.25%浓度渐变20了抗菌研究。

2.3。植物化学的分析JT提取

提取测试最初存在的植物化学物质定性根据标准方法如降水或色测试描述Evance [20.),进一步定量估计了只检测到的植物化学物质。量化的总酚和单宁含量提取物是由Folin-Ciocalteu方法根据(21,22]。酚类化合物的浓度和单宁估计从高卢和单宁酸校准曲线,分别。氯化铝比色法与槲皮素作为标准被用于提取的总类黄酮含量的测定(如前所述)(23]。提取的总花青素含量是由pH值微分方法根据(24]。Liebermann-Burchard测试被用于测定植物固醇,胆固醇作为标准(如前所述)(25]。萜类化合物的量化,心脏苷、皂苷是由重力方法根据(26- - - - - -28]。生物碱和蛋白质的定量测定是根据Harborne方法(26和洛瑞29日]。

2.4。气相色谱分析-质谱法(gc - ms)分析

4毫升0.5 N methanolic氢氧化钠添加到150毫克JT十六进制提取和加热蒸气浴,直到脂肪小滴进入解决方案。5分钟后,5毫升BF3-methanol加入烧瓶和混合煮2分钟。饱和氯化钠溶液添加到瓶漂浮甲基酯。他们用一个注射器转移到一个分液漏斗和20毫升的石油醚(b.p。30 - 60°C试剂级再蒸馏)是补充道。层相隔1分钟激烈的颤抖。石油醚层排水通过滤纸和溶剂当时60°C水浴蒸发。1毫升整除的酯JT十六进制提取,并用gc - ms进行分析。

GC - ms分析进行一个安捷伦7890 a GC加上5975质量选择检测器(美国安捷伦科技)。样本分离DB-5MS毛细管柱(30米长x0.25毫米直径x0.25µ米膜厚度)。烤箱温度在40°C 5分钟提高到280°C的速度5°C /分钟。纯氦用作载气以恒定流量的1毫升/分钟。在甲醇稀释样品3µL在分裂模式注入了50的分流比:1。提取物的化学成分被确定的色谱和质谱的使用数据库NIST08图书馆。

2.5。菌株

以下引用和临床菌株用于本研究:金黄色葡萄球菌写明ATCC 25923,金黄色葡萄球菌(MRSA)写明ATCC 33592,美国epidermidisRP62,粪肠球菌29212年,大肠杆菌写明ATCC 25922,铜绿假单胞菌写明ATCC 27853年,耐多药(MDR)铜绿假单胞菌写明ATCC baa - 2108,变形杆菌写明ATCC 29245,肺炎克雷伯菌写明ATCC 33495。参考菌株都从微生物实验室获得里加东大学医院(REUH)。接种的微生物在生物测定复兴以来,新鲜营养Trypticase酱油汤前24小时使用。临床收集的材料是无菌棉拭子从DFI糖尿病足溃疡患者承认REUH。收集临床样本的糖尿病足伤口细菌分离株的伦理委员会批准的心血管和再生医学研究所的拉脱维亚大学。四个金黄色葡萄球菌文化被分离和鉴定微生物的物种水平REUH微生物实验室使用洗液结晶系统(英国Becton, Dickinson)。对抗菌素测试小组根据临床和实验室标准协会指南(30.)磁盘琼脂扩散试验和电性能测试使用Mueller-Hinton (MH)琼脂(英国),正欲与以下的抗菌药物:青霉素、庆大霉素、头孢唑啉、红霉素、克林霉素、万古霉素、环丙沙星和功效。甲氧西林耐药性测试了头孢西丁磁盘屏幕上琼脂板。板接种临床金黄色葡萄球菌文化是20 - 24 h孵化。四的抗菌谱金黄色葡萄球菌菌株显示对甲氧西林(头孢西丁)。

2.6。汤采用方法

的抗菌功效JT提取测试通过确定的最低抑制浓度(麦克风)汤采用方法如Balouiri所述31日与修改)。股票的解决方案庆大霉素(0.4毫克/毫升)和链霉素(1毫克/毫升)被用作麦克风控制在每个实验中按照CLSI标准CLSI - 2017 - m02 a12 [30.]。Unsupplemented MH的培养基配方和没有细菌接种作为积极的和消极的控制,分别在每一个实验。DMSO作为车辆控制在所有菌株的抑制作用。稀释剂的双重的稀释系列DMSO在每个好(从12.5%,6.25%在第二,等等)。DMSO溶液的浓度在6.25%在第二远低于有毒水平分别测试,不抑制细菌的生长。

双重的稀释系列中每个提取准备的MH肉汤(从250毫克/毫升)的浓度和添加到96 -微量滴定板(100µ信用证)。在一夜之间变得新鲜细菌细胞悬浮在无菌生理盐水和调整麦克法兰的浊度标准没有0.5,包含1.5×10的细菌细胞悬液⁸菌落(CFU /毫升)。细菌细胞悬液进一步稀释1:100年在蒸馏水和整除微型板块100µL /。计算麦克风,20 h的孵化后35°C, 10µL整除适当稀释的退出了微量滴定板和接种MH琼脂培养皿和孵化24 h。菌落的每个稀释数和相对于控制培养皿接种24小时前10µL相同的应变,麦克风的决心。MIC值手动计算,假定与最低杀菌浓度在99.9%抑制细菌生长在培养皿中接种后观察(31日]。每个提取统计可靠性测试一式三份。

2.7。细胞培养和分化诱导

人类THP-1单核细胞系得到从写明ATCC(美式文化集合)。THP-1细胞保持rpmi - 1640中含10%胎牛血清和抗生素和孵化有限公司5%₂在37°C。THP-1单核细胞分化成巨噬细胞刺激了佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA) (20 ng / mL) 24 h。介质是PMA-free交换介质前48小时细胞用于实验。

2.8。细胞生存能力测试

细胞生存能力进行了实验,细胞计数Kit-8 (CCK-8)(美国Sigma-Aldrich),根据制造商的指示。THP-1细胞(100µL)被播种到96孔细胞培养板的密度10⁴细胞每好,生长在各种浓度的存在与否(3 - 200µg / mL)JT植物提取物。井与死THP-1细胞作为负控制井。CCK-8解决方案(10µL)添加到细胞在24和48 h和盘子被孵化1 h在37°C。吸光度的测定在使用微型板块读者Victor3 450海里^TM(美国珀金埃尔默)。井没有细胞,但包含介质被用作一个空白值减去所有值。每个试验进行了一式三份。

2.9。RNA提取和定量实时聚合酶链反应(存在)

从培养细胞总RNA分离使用试剂盒试剂(美国σ),根据制造商的协议。合成第一链cDNA从2µg RNA使用益生元(dT)引物与恢复援助H - kit(美国热费希尔科学)。执行中存在使用绝对蓝色SYBR绿色主人混合试剂(热费希尔科学、美国)ViiA7实时PCR检测系统(美国应用生物系统公司)。用于基因扩增引物对表中列出3mRNA水平量化和标准化水平的参考基因RPS29使用2^−ΔΔCt方法和作为相对表达与未经处理的细胞的价值观。

2.10。细胞因子和趋化因子的量化

从未经处理和条件得到了媒体JTextract-treated THP-1巨噬细胞。浓度的il - 6、il - 1β、MCP-1 CXCL10生物分子被Luminex测量多路复用免疫测定(研发系统、美国)根据制造商的说明和分析Luminex 200 (Luminex公司(美国)。至少有三个独立的重复每样一式两份。分析物的浓度与五个参数量化物流(5-PL)曲线拟合,并表示在pg / mL。

2.11。统计分析

麦克风的统计分析数据用卡方检验来完成。每个麦克风的中值计算。基因表达的结果表示为平均值±标准偏差(SD)表示数量的实验。学生的t以及用于评估统计学意义上的差异。显著差异被认为< 0.05。使用GraphPad Prism 5.0执行统计分析软件(GraphPad软件公司,美国)。

3所示。结果

3.1。植物化学的评价JT提取

获得的定量植物化学的筛查JT植物提取物显示存在的酚类、蛋白质、单宁、甾醇类和萜类化合物JT_YG情感表达,JT_AFI情感表达,JT_AFI十六进制提取,如表所示4。所有JT提取类黄酮含量最高的JT_YGee提取。这两个JT_YGee和JT_AFI情感表达是富含蛋白质。生物碱是只有在检测到JT_AFIee和皂甙JT_YGee提取物。苷被发现存在只有在己烷提取物JT配方与浓度越高JT_YG- - - - - -十六进制。花青素只有在在座JT_YG提取物。总的来说,JTee提取物含量较高的酚类、蛋白质、单宁、甾醇类和黄酮类化合物。

3.2。化学成分的JT提取

中化学成分的存在JT己烷提取,并用gc - ms分析。的分析JT_YG十六进制显示提取36峰的存在相对应的气相色谱图和21个组件的主要山峰已经确定,表中列出5。主要化合物9日12-octadecadienoic酸、亚油酸(24.86%)、棕榈酸、棕榈酸(17.17%)、cis 13 - octadecenoic酸(15.19%)、cis-13, 16-docosadienoic酸(5.29%)、ar-turmerone (2.49%)、alpha-turmerone (2.03%)、beta-turmerone或curlone (1.84%)、9-octadecenoic酸(Z)甲酯或油酸(1.46%)、植醇(1.61%)、和角鲨烯(1.84%),而其他化合物存在于小数量高峰地区从1.61%至0.09不等。

气相色谱图的分析JT_AFI十六进制提取了33个不同的山峰和25组件对应的主要山峰已经确定,列入表中6。主要化合物6-octadecenoic酸(27.36%)、棕榈酸(10.17%)、3-dibenzofuranamine(13.24%)、正十八烷(5.67%)、反丁烯二酸,2,4-dimethyl pent-3-yl异己酯(5.36%)、反丁烯二酸的,3,5-dichlorophenyl异己酯(4.99%)、9日12-octadecadienoic酸(Z, Z)(3.12%),和叶绿醇(2.23%),而其他的化合物存在于小数量高峰地区从0.321到.97%。

3.3。抗菌活性的JT提取参考菌株

的抗菌性能JT提取阐明在4克(+)(金黄色葡萄球菌写明ATCC 25923,写明ATCC 33592耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,美国epidermidisRP62 A,粪大肠29212)和5克(−)(大肠杆菌写明ATCC 25922,铜绿假单胞菌写明ATCC 27853年,耐多药铜绿假单胞菌写明ATCC baa - 2108,p .奇异君子兰写明ATCC 29245,k .肺炎写明ATCC 33495)参考菌株。麦克风由汤采用方法的结果如表所示7。一般来说,MIC值的范围从1.95到62.5毫克/毫升。提取物的杀菌浓度高于125毫克/毫升以来被视为没有抑制细菌生长稀释12.5% DMSO溶液的影响。

所有JT提取显示更好的抑制活性细菌革兰氏染色(+)相比,克(−)(表7)。当抑制的情况下(MIC)确定比较的情况下没有抑制作用,100%的克(+),只有40%的克(−)菌株有抑制的情况下提取进行了研究。这两个JT_YG十六进制和JT_YGee提取显示低麦克风克(+)细菌比麦克风参考菌株(平均11.7)克(−)株(中值≥125.0)。类似地,两个JT_AFIee和JT_AFI十六进制提取也更积极反对克(+)(平均31.25)而克(−)麦克风(平均93.75)参考菌株。的整体效果JT_YG制定提取物(平均11.7)高于JT_AFI制定提取物(平均31.25)。

为了研究细菌革兰氏染色(+)的最佳功效,中等收入国家进一步提取之间的相比。最低的麦克风是biofilm-forming检测美国epidermidisRP62的应变JT_YGee和JT_YG十六进制提取(1.95毫克/毫升)紧随其后JT_AFIee提取(15.6毫克/毫升)JT_AFI十六进制(31.25毫克/毫升),如表所示7。值得注意的是,结果表明,所有四个提取物写明ATCC 33592株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性最高的抑制活动所示JT_YGee和JT_AFIee提取(15.6毫克/毫升)(表7)。

此外,总体抑制功效克(+)和克(−)细菌提取之间的比较。克(-)细菌敏感EE提取物,除了铜绿假单胞菌写明ATCC baa MDR - 2108。没有显著重要的区别(在抑制之间的频率= 0.527)JT_YGee(平均31.25)JT_YG十六进制(平均62.5)。也没有显著重要的区别(在抑制之间的频率= 0.836)JT_AFIee(平均62.52)JT_AFI十六进制(中值≥125)之间JT_YGee(平均31.25)JT_AFIee(平均31.25)之间JT_YG十六进制(平均62.5)JT_AFI十六进制提取(平均62.5)(表7)。

3.4。抗菌活性的JT提取临床金黄色葡萄球菌菌株

此外,四个金黄色葡萄球菌临床菌株,即704年、526年、250年和588年,dfi隔绝,被汤采用抗菌活性的研究方法。中等收入国家的结果如表所示8。麦克风的值从1.95变化到62.5毫克/毫升中临床菌株和提取,除了JT_YG十六进制提取(7.81毫克/毫升)。的麦克风没有区别JT_YGee(平均15.6)JT_AFIee(平均15.6)提取,同样,之间JT_YG十六进制(平均62.5)JT_AFI十六进制提取(平均62.5),EE提取显示十六进制提取的活动相比更高。我们的数据表明,抑制的频率没有显著不同金黄色葡萄球菌临床菌株和参照组(= 0.590)。

作为一个组成部分JT_AFI配方,具有抗菌潜在的皮肤上,硫酸铜的抑制作用是另外测试金黄色葡萄球菌由汤采用方法临床菌株。硫酸铜原液制备浓度为3.53 mg / mL,等于原来使用的JT_AFI产品(10.6 g / 3 L(水)。我们的数据表明,麦克风是已经通过硫酸铜浓度为0.88µ克/毫升,比原来的浓度要低得多JT_AFI产品(表8)。

3.5。JT植物提取物对细胞活力的影响

的影响JT提取的可行性THP-1巨噬细胞检查,以确定的提取物的浓度对细胞无毒。从图可以看出1,没有细胞毒性效应是24和48 h后观察细胞的治疗JT_YG十六进制和JT_AFI在浓度小于50十六进制µg / mL和JT_YGee和JT_AFIee在浓度小于12µ克/毫升。因此,对于后续的实验中,50浓度µ克/毫升JT_YG十六进制和JT_AFI十六进制和10µ克/毫升JT_YGee和JT_AFIee被用来引起最大反应不会引起细胞毒性。暴露在汽车控制DMSO从0.2到0.003%没有影响细胞的生存能力(数据未显示)。

3.6。JT提取物抑制基因表达在THP-1巨噬细胞炎性细胞因子和趋化因子

我们量化的表达水平促炎细胞因子il - 6、il - 1β肿瘤坏死因子-α,和chemokines-MCP-1 CXCL10化学引诱物因素参与单核细胞/巨噬细胞和t细胞的招募。THP-1巨噬细胞与LPS刺激(1µg / mL)有或没有添加不同浓度的JT十六进制(50、10和1µg / mL)JTee(10和1µg / mL)植物提取物。每个分子的表达在mRNA水平调节在THP-1 4 h与LPS刺激后巨噬细胞(图2)。所有剂量依赖性的方式提取显示最有效的抑制il - 6, CXCL10 MCP-1基因表达。添加JT_YG十六进制在50岁、10和1µg / ml导致显著降低LPS -刺激白介素mRNA水平95%,84% (< 0.0001)、22% (= 0.0019),CXCL10 mRNA水平95% (< 0.0001)、61% (= 0.0006)和21% (= 0.005)和MCP-1水平81% (< 0.0001)、60% (= 0.005)和11% (分别为= 0.096)(数据2(一个)和2 (d))。添加JT_AFI十六进制在50岁,10岁和1µg / mL导致显著减少LPS-stimulated il - 6的mRNA水平92% (< 0.0001)、66% (= 0.0003)和28% (= 0.009),CXCL10 mRNA水平92% (< 0.0001)、54% (= 0.001)和34% (= 0.002)和MCP-1水平74%,44% (< 0.0001)和15% (分别为= 0.062)(数据2(一个)和2 (d))。添加JT_YGee在10到1µg / mL导致LPS-stimulated il - 6 mRNA水平的显著减少了95%和51% (< 0.0001),CXCL10 mRNA水平到94年(< 0.0001)和30% (= 0.003)和MCP-1水平56% (= 0.0002)和22% (分别为= 0.011)(数据2(一个)和2 (d))。添加JT_AFIee在10到1µg / mL导致显著减少LPS-stimulated il - 6的mRNA水平80% (< 0.0001)和20% (= 0.004),CXCL10 mRNA水平74% (< 0.0001)和10% (= 0.058)和MCP-1水平24% (= 0.001)和3% (分别为= 0.069)(数据2(一个)和2 (d))。一个重要的65% (= 0.0004)和43% (在il - 1 = 0.005)减少β信使rna和72% (< 0.0001)和36% (= 0.008)降低TNF -α信使rna检测50µ克/毫升JT_YG十六进制和JT_AFI十六进制提取,分别为(数字2 (b)和2 (c))。然而,只有JT_YGee 10点µg / mL能够显著(= 0.001)抑制il - 1β基因表达(图2 (c))。接触到10µM地塞米松作为积极的控制显著降低LPS-stimulated mRNA水平的所有测试分子(图2)。暴露在车辆控制DMSO没有影响细胞因子表达在LPS刺激细胞(数据未显示)。

3.7。植物提取物抑制炎性细胞因子和趋化因子的分泌THP-1巨噬细胞

下一步,我们测量分泌到培养基中细胞因子水平当THP-1巨噬细胞暴露于有限合伙人(1µg / mL)的存在与否JT十六进制(50µg / mL)JT- - - - - - EE (10µg / mL)提取物。24小时后,培养基收集,和细胞因子浓度测定Luminex工具包。所有的细胞因子分泌显著增加巨噬细胞治疗有限合伙人(图3)。JT_AFI十六进制和JT_YG十六进制提取物能够显著降低il - 6的分泌il - 1β、MCP-1 CXCL10从巨噬细胞(图3)。il - 6、MCP-1 CXCL10分泌也显著减少JTee提取物(图3(一个),3 (c),3 (d))。然而,只有JT_YGee提取10点µg / mL明显降低LPS-stimulated il - 1的分泌β(= 0.005,图3 (b))。

4所示。讨论

相反的药理学方法可应用于研究配方用于阿育吠陀了解他们的行为方式。很少有报告提供明确的潜在机制的协同治疗作用的草药成分(32]。本研究试图了解传统的潜力JT版本和乙醇和正己烷提取物的生物活性草本的分数JT_AFI和JT_YG配方体外。

到目前为止,伤口愈合的机制和效果JT使用配方进行了调查在活的有机体内切除伤口模型和燃烧损伤大鼠(15,33]。作者报道更快的老鼠的伤口愈合过程处理JT由于成纤维细胞的增殖,增加蛋白质合成,增强胶原蛋白的形成,reepithelization,伤口收缩能力。然而,我们所知,没有研究抗菌和抗炎的潜力JT。因此,本研究评价乙醇和正己烷提取物的抗菌和抗炎活动获得JT_YG和JT_AFI配方。JT_AFI配方是由13个草药成分随着硫酸铜强化油。本研究只关注的草药分数JT配方。JT_AFI评估没有硫酸铜了解草药组合的作用,硫酸铜为其抗菌的功效[34]和伤口愈合活动已是不争35]。

最近的研究使用分子方法如对糖尿病溃疡16 s rRNA测序显示更高水平的微生物多样性,特别是厌氧菌和革兰氏(−)比先前已知的物种通过培养方法(36]。其他细菌参与发展类金融机构在欧洲,揭示了传统的培养,包括p .奇异君子兰,铜绿假单胞菌、克雷伯氏菌spp。、大肠杆菌,厌氧菌(37]。与此相反,在温暖的国家(特别是在亚洲和非洲),有氧克(−)杆菌,尤其铜绿假单胞菌,更多的是发展类金融机构的原因。的抗菌活性JT提取是评估克(+)和克(−)参考菌株和四个金黄色葡萄球菌从临床分离菌株感染的糖尿病足溃疡。我们观察到,JT提取显示更好的抑制活性比革兰氏细菌革兰氏染色(+)(−)菌株。值得注意的是,克(-)细菌敏感EE提取物,菌株的情况除外铜绿假单胞菌写明ATCC baa MDR - 2108。这可以解释为存在较高的酚类、单宁、甾醇类,黄酮类化合物在EE提取。之间的直接相关性酚类和黄酮类的总结内容和不同植物提取物的抗菌活性报道(38]。

有趣的是,最有效的抗菌活性JT观察提取物对参考菌株,即金黄色葡萄球菌(MSSA耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)美国epidermidis。此外,提取物对所有四个临床菌株有效金黄色葡萄球菌,最高的麦克风7.81毫克/毫升的价值JT_YG十六进制提取和不同麦克风从1.95到62.5毫克/毫升临床菌株之一JT_YG情感表达,JT_AFI情感表达,JT_AFI十六进制提取物。它已被证明金黄色葡萄球菌是最常见的病原体中分离出细菌的革兰氏染色(+)从糖尿病足伤口感染39,40]。此外,这两个金黄色葡萄球菌和美国epidermidis菌株能够形成生物膜在许多慢性伤口的州,包括发展类金融机构,这似乎影响伤口愈合延迟伤口reepithelization,减少抗菌素和免疫反应的影响,并进一步增加伤口的感染(41]。

在最近的过去,把评价结果变得更具挑战性由于患病率的增加耐多药的病原体,特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。有趣的是,在各国发展类金融机构不同耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的流行增加欠发达国家(8]。因此,我们已经阐明的抗菌活性JTee和JT十六进制提取物对两种主要抗多种抗菌素的细菌中发现的糖尿病wounds-MRSA和耐多药铜绿假单胞菌。所有四个提取最大的潜在价值对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,最高的乙醇提取物的抑制活性JT配方与麦克风15.60毫克/毫升和己烷后分数与麦克风31.25毫克/毫升。然而,只有JT_YG十六进制和JT_AFIee提取物能够抑制克(-)MDR的增长铜绿假单胞菌,虽然有较高的麦克风价值62.5 mg / mL。的抗菌效果JT提取物中发现本研究可能的机制之一,加速伤口愈合活动,从而支持传统的使用。

这种微生物感染和更高水平的生物膜在慢性伤口可能会影响细胞的活动参与伤口愈合和分泌细胞因子和生长因子的合成。促炎细胞因子在伤口需要启动正常伤口修复,但他们的表达水平增加需要仅是暂时性的。此外,细菌及其生产木糖醇会导致长期的促炎细胞因子il - 1等β、il - 6和TNF -α抗炎细胞因子的差别,对这些TGF -β和il - 10在糖尿病伤口,导致长时间的伤口愈合的炎症阶段(5]。本研究探讨是否JT提取物能够调节炎症活动LPS-challenged THP-1巨噬细胞细胞。我们的结果表明,所有JT植物提取物剂量依赖性降低il - 6, MCP-1 CXCL10 THP-1巨噬细胞中基因表达和蛋白质的分泌反应有限合伙人;然而,只有JT_YG情感表达能够显著降低il - 1的分泌蛋白和基因表达β细胞因子。己烷提取的JT配方也显示调节肿瘤坏死因子-的效力α基因的表达。的JT提取物能够正常过表达细胞因子在慢性伤口,因此,可以缩短长期炎症。

在目前的研究中,植物化学的分析和gc - ms显示存在相当数量的生物活性化合物和植物化学物质类黄酮、萜类、甾醇类、苷类、脂肪酸的JT植物提取物,可以为他们的抗菌和抗炎活动作出贡献。它已经表明,皂甙、黄酮类和酚类化合物具有消炎和抗真菌活性。萜类化合物具有抗菌活性,发挥积极作用在伤口愈合,增加抗氧化剂的浓度在伤口,恢复发炎组织(42]。此外,JT-十六进制提取ar-turmerone丰富,一个-turmerone,ß-turmerone,姜黄的精油的主要成分姜黄。几项研究已经表明,姜黄精油具有强大的抗菌活性等多种细菌S.aureus,E.coli,P.aeruginosa,B.subtilis(43- - - - - -45]。其他植物成份JT提取物、角鲨烯等香附子,叶绿醇从刺桐使丰富多彩和Azadirachta indica和豆甾醇来自Pongamia皮纳塔也可能导致的生物效应JT提取物。研究已经证明,角鲨烯促进改造和组织修复反应信号通过抑制核factor-kappa B,诱导一氧化氮合酶,促炎细胞因子的生产,如il - 1β和肿瘤坏死因子-α和抗炎细胞因子il - 10、il - 4的刺激46,47]。叶绿醇的生物活性和植物甾醇可以归因于抗炎活动通过减少白细胞和中性粒细胞迁移,il - 1β、il - 6和TNF -α水平和氧化应激以及抗菌作用[48- - - - - -50]。

JT提取物显示出相当数量的游离脂肪酸,如棕榈油酸、亚麻油酸、硬脂酸及其酯。游离脂肪酸显示抗菌的重要作用预防增长目标细菌细胞壁和细胞膜的结构和功能和炎症过程通过调制的一氧化氮和细胞因子在伤口处生产51,52]。

5。结论

本研究提供的证据表明,乙醇和正己烷提取的JT配方具有强大抗菌活性对克(+),并在较小程度上,克(−)细菌和抗炎反应中起着关键作用有限合伙人在巨噬细胞。因此,这项研究提供了一个理由的增效贡献各种草药的使用JT管理无法愈合的伤口。

数据可用性

所有数据期间使用本研究可从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢卡斯帕·Jekabsons(拉脱维亚大学医学院、药理学)与统计分析他的帮助。这项研究是由有效的协作项目从拉脱维亚和AVP大学研究基金会(批准号ZD2016/20226)。