文摘

目的。传统上,c . sappan医学是心材,需要减少作为一个整体。在这个研究中,叶子和茎的抗肿瘤活性和机制比较的根源石莲子sappan;为了调查是否的茎和叶c . sappan可以用来取代心材抗肿瘤治疗,从而减少资源的破坏。方法。MTT分析被用来识别活跃的网站c . sappan基于人类肝癌细胞(HuH-7)的应用程序。高效液相色谱法(HPLC)是用于分析极性提取物。我们还建立了一个H22 hepatoma-bearing管理腹腔注射小鼠模型的石油醚提取物的叶子和茎(SY②)剂量的20和65毫克/公斤。i.g.组小鼠接种intragastrically相同的提取(剂量的100和325毫克/公斤)在同一时间(12天)。结果。的抗肿瘤c . sappan石油醚提取。的集成电路₅₀石油醚提取物的根(SG②)是56.10μ的g / ml,叶子和茎(SY②)是77.20μ克/毫升。灰色关联分析表明11活跃分数峰值抗肿瘤活性密切相关。肿瘤的大小H22 hepatoma-bearing小鼠显著降低小鼠采用石油醚提取物的叶子和茎(高剂量抑制率分别为55.31%和60.56%)。纤维组织增生,炎症细胞浸润,肿瘤细胞坏死,增殖细胞核抗原(PCNA)的表达和血管内皮生长因子(VEGF)都低于对照组(VEGF< 0.001和PCNA< 0.05)。结论。石油醚提取物的根、叶和茎c . sappan表现出一定的抗肿瘤作用。我们的数据表明,这些影响的机制可能与降低PCNA的表达VEGF和血管生成的抑制作用。我们的发现表明我们可以扩大药用c . sappan叶和茎,从而提高资源利用率和减少资源损失。

1。介绍

作为一种常见的苗族药物,石莲子sappan的心材干豆类贵州民间草药用于治疗肿瘤。根和树皮c . sappan被列为来源草药药物在2019年版的吗中药材质量标准和贵州省民族药材。的主要成分c . sappan类黄酮、二萜内酯、香豆素类和酰胺。最近的研究在c . sappan发现的原油水提取物c . sappan可以抑制多种肿瘤细胞或诱导其凋亡[1- - - - - -3),从而证明了进一步开发利用的价值。其他研究表明,乙酸乙酯提取的c . sappan有显著抑制作用在HGC-27细胞的生长4]。Protosappanin B已被证明对井下电视的扩散,产生抑制作用T24,海拉,SW480肿瘤细胞(5]。此外,巴西红木红被证明能显著抑制人类膀胱癌T24癌细胞的生长和扩散;涉及的机制可能与upregulation C-Fos表达式(6]。巴西木素不仅能抑制皮肤癌细胞的扩散(A431, BCC、SCC25 A375)而且还可以促进皮肤癌症细胞通过激活细胞凋亡的表达caspase-3 [7]。一项研究巴西木素的影响增长的抑制和诱导细胞凋亡在人类胶质母细胞瘤U87细胞表明巴西木素促进细胞凋亡增加对位的乳沟和的表达水平下调caspase-3和caspase-78]。在另一项研究中,研究小鼠肝癌H22细胞的入侵,protosappanin B和丝裂霉素被发现提高昆明小鼠的存活时间(9]。巴西木素也表现出潜在的抑制作用的致瘤性小鼠肺癌A549-FIG BALB / c裸小鼠细胞的抑制磷酸化barrier-to-autointegration因素(BAF) [10]。

传统上,树根和树干c . sappan是用于制造药用提取物。然而,这种做法导致不可逆转的损害树木和严重破坏资源本身。没有现有文献报道比较提取物制成的根源c . sappan与那些由的叶子和茎抗癌效果。在目前的研究中,我们比较了功效的石油醚提取准备的根与叶和茎c . sappan抑制人类肝癌的生长(HuH-7)细胞和小鼠H22肿瘤的抗肿瘤治疗。在本文中,我们提供了实验证据支持的制备药用提取物的茎和叶c . sappan,从而扩大这种资源的使用方式和提供选项来防止损害发生的这些有价值的树木。

2。材料和方法

2.1。药品和试剂

增殖细胞核抗原(抗体克隆VG1)和VEGF(克隆VG1))从DAKO公司购买。胰蛋白酶(生产批号。SH30042.01)、DMEM(生产批号。NXKO731),的边后卫(生产批号。从HyClone NXCO582)购买。氟尿嘧啶收购从天津Jinyao而乙腈(没有。20121018),甲醇(生产批号。20120201)、二甲亚砜(DMSO,生产批号。2012062),磷酸是购自天津Kemiou公司。盐酸表柔比星是由北京Botai公司提供。 Paraformaldehyde tissue fixation solution was provided by the Second Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine.

2.2。植物材料

石莲子sappan(l)托托。植物从Ceheng聚集贵州省县,中国。凭证标本的c . sappanGZTM 0018426,保持贵州中医大学贵阳。

首先,我们地面1.0公斤的干叶子和茎c . sappan成粉然后回流三倍(75%乙醇,5000毫升;4小时/回流)。提取被混合和集中;乙醇提取产生143.0克(SY①)。糟粕被晒干并提取和水三次。接下来,我们进行了六个回流持续0.5小时,8回流持续1小时,12回流持续2个小时。溶剂回收,然后我们离开水提取物;水提取物的产量为37.1 g (SY⑥)。不同极性提取物提取乙醇提取物,产生6.29克hydromethanolic提取(SY⑤), 3.15 g的正丁醇提取物(SY④), 2.02 g的乙酸乙酯提取物(SY③),石油醚提取物和1.38克(SY②)。

这个过程被重复准备提取的根源c . sappan(1.0公斤)。使用这种策略,我们获得了112.5 g的乙醇提取物(SG①), 0.05 g的石油醚提取物(SG②), 5.72 g的乙酸乙酯提取物(SG③), 1.12 g的正丁醇提取物(SG④), 1.05克hydromethanolic提取(SG⑤)和19.6克水提取物(SG⑥)。

2.3。细胞系

H22小鼠肝癌细胞株和人类肝癌HuH-7细胞系是购自上海细胞研究所,中国科学院。杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)用于保持细胞(中含有青霉素G (100 U /毫升)的边后卫,链霉素(100 U /毫升),和谷酰胺(2毫米)毫克/毫升)。

2.4。动物

我们的实验涉及雄性和雌性昆明小鼠(证书号SCXU(钱)2015 - 0004年,在18到22岁的克重)。当地的动物保健和使用委员会批准了实验过程。所有实验是根据提供的指导方针进行动物研究伦理委员会(CEPA)。老鼠被安置在标准条件下饲养室(12 h黑暗/光周期;20 - 25°C;60 - 75%湿度)随意获得食物和水。

2.5。确定的影响c . sappan提取物对人类肝癌HuH-7细胞增殖的抑制作用

的影响c . sappanMTT比色提取是化验,通过确定集成电路₅₀经济增长的抑制作用。

2.5.1。MTT检测

这些化验是如前所述11,12]。首先,一个细胞悬液(1×10⁵细胞/毫升)被添加到96孔板。然后,100年μ每个提取的l是放置在单独的井和放置在一个孵化器(5%股份有限公司₂,24小时37°C)。水提取物和hydromethanolic提取物与NS溶解。DMSO(< 0.1%)被用来援助正丁醇的增溶,乙酸乙酯,石油醚提取物。管理组与药物血清(100剂量的孵化μ20 g / ml,μg / ml, 4μg / ml);每组三个复制设置。孵化后48小时,50μl (MTT(5毫克/毫升)被添加到每个;其次是4 h潜伏期。接下来,媒介被和DMSO (150μl)被添加到每个。吸光度测试了Multiskan FC标(热费希尔科学)在570海里。这些实验重复两次。数据被用来计算细胞增殖抑制率(IR₁),见以下方程:

2.5.2。确定活动分数的抗肿瘤效应

基于初步实验,最有效的活动分数是石油醚提取物。使用方程(1抑制率(IR),我们决定₁HuH-7细胞)。实验组出现零组(无电池),阳性对照组(包含最终浓度的盐酸表柔比星20、10、5,2.5和1.25μg / ml),两个分数管理组(在剂量的200、100、50岁,25岁和12.5μg / ml),和两个对照组(PBS或DMSO)。

2.6。高效液相色谱法(HPLC)分析

高效液相色谱用于调查的稳定性、可重复性和精度的提取物。相对标准偏差小于3.0%。

2.6.1。样品溶液制备

每个样品极性提取物(0.2克)重准确,放置在不同容量的玻璃瓶(10毫升)。一定体积的甲醇被添加到体积烧瓶然后彻底动摇了。样本然后用近30分钟,冷却20°C。解决方案被过滤,0.45μ米微孔膜和作为测试样品。

2.6.2。色谱条件

提取分析高效液相色谱法(安捷伦1100四元泵和脱气装置,美国)在权力平等主义的模式。所有分析分析迪玛列上维持在25°C(250毫米×4.6毫米,5µm)。注射体积和流量是10μ分别l和1.0毫升/分钟。梯度洗脱了与移动阶段(0.1%磷酸)、B(甲醇)和C(乙腈)如下:0分钟,5% B和C的5%;1分钟,15% B和C的15%;60分钟,25% B和C的25%;140分钟,33% B和C的33%;270分钟,40% B和C的40%;340分钟,45% B和C的45%;和360分钟,50% B和c . 50%检测波长为240 nm。

2.7。小鼠肿瘤模型

H22 hepatoma-bearing小鼠随机分为一个胃内的(专营)低剂量组和高剂量组,一个氟尿嘧啶(FU)组、对照组、低剂量组和高剂量组。急性毒性实验的基础上,SY②LD₅₀是1961毫克/公斤。剂量服用高剂量组(i.p)是LD的1/30₅₀,低剂量(i.p)高剂量的1/3。剂量服用高剂量组(专营)LD的1/6₅₀而低剂量(专营)高剂量的1/3。最后12天的政府时期,我们测量肿瘤病变,并测量了体重。我们也评估肿瘤组织中VEGF和PCNA的表达。

2.7.1。管理、分组和建模

腹水tumor-derived老鼠由移植H22小鼠肝癌细胞(0.2毫升/鼠标)进入腹腔。7天后,我们使用了一个喷射器来提取nonbloody腹水然后放入一个无菌培养皿中(13]。细胞腹水被稀释到1.0×10⁷细胞/毫升。然后,0.2毫升的腹水被接种到每个鼠标的左前腋窝(2.0×10⁶肿瘤细胞/鼠标)。

总共60老鼠分组如下(n= 10 /组):i.g.低剂量组(100毫克/公斤),i.g.高剂量组(325毫克/公斤),FU组(83毫克/公斤),对照组,ip低剂量组(20毫克/公斤),和ip高剂量组(65毫克/公斤)。SY②管理每个鼠标从疫苗接种后的第三天的剂量(0.2毫升/ 10 g)。所有小鼠安乐死在13天。肿瘤抑制率(IR₂),然后由重量决定肿瘤并应用以下方程:

2.7.2。肿瘤组织病理分析

肿瘤组织固定、脱水、嵌入分块,然后沾hematoxylin-eosin(他)。光学显微镜是用来确定是否有病变发生。病变被评估使用评分系统(3点:病变占领> 50%;2分:病变占30 - 50%;1分:病变占领< 30%)用于评估病变。我们也评估一系列指标,包括纤维组织增生,炎症细胞浸润,肿瘤细胞坏死。

2.7.3。化验,以确定VEGF和PCNA的表达

免疫组织化学进行了按照制造商的指示使用以下分组:胃内的(渐开线齿轮),低剂量组,i.g.高剂量组,氟尿嘧啶(FU)组、对照组,腹腔内注射(i.p)高剂量组和ip低剂量组。

管理上的老鼠牺牲后13天。肿瘤组织被浸泡,脱水,嵌入式,deparaffinized,分段在4μm。部分被孵化与VEGF、用PBS洗净,浸泡在0.3%的H₂O₂缓冲(30分钟),水洗,孵化在PBS(10分钟),然后孵化主要抗体20分钟在4°C。部分被用PBS(10分钟),孵化与想象™20分钟,然后用一个颜色孵化源底物溶液孵化了20分钟。Immunopositivity被表示为棕色/黄色颗粒位于细胞质中。五组织(100字段)的新血管形成的致密区域选择(14)和微血管的数量在每个视图视场(200字段)。

其他部分组织的免疫组织化学染色细胞核抗原。PCNA-positive蛋白质(棕色/黄色颗粒)是位于细胞核。五个组织领域被随机选择计数PCNA-positive肿瘤细胞(400字段)。

2.8。统计方法

数据用SPSS 23.0版进行了分析。值为0.05或更少的被认为是具有统计学意义。数据提出了均值±标准差(SD)个人组(n≥3)。

3所示。结果

3.1。c . sappan提取物抑制HuH-7细胞的扩散

的抗肿瘤效果c . sappan提取总结在表1。分析表明,SY②和SG②显著抑制HuH-7细胞的增殖(数字1- - - - - -3)。这些数据表明,c . sappan石油醚提取物(SY②和SG②)可能是最有效的积极抵御肿瘤的分数。集成电路的均值₅₀重复实验值是作为最后的指数抑制。的集成电路₅₀盐酸表柔比星的价值,SY②,和SG②5.11μ77.20 g / ml,μ56.10 g / ml,μ克/毫升(表2)。的集成电路₅₀SG②小于SY的②。此外,SY②的抑制作用强于SG②。

3.2。高效液相色谱分析

图3显示了极地的高效液相色谱色谱提取做好准备c . sappan的根源。与SG②相比,100分钟和410分钟之间,SG④, SG⑤, SG⑥没有显示出色谱峰。从0分钟到130分钟,SG③最色谱峰。这些数据意味着根比茎和叶有更多的组件。SY的色谱图②明显不同于其他四个样本(图4)。与SY③相比,SY④, SY⑤, SY⑥, SY②没有共同的山峰。

高效液相色谱法分析发现,15906.1和13736.9的总峰地区活跃的分数(SG②和SY②)。有26个常见的山峰(数字5- - - - - -9)。

3.3。灰色关联分析

分析表明,最有效的活动分数的石油醚提取物c . sappan(SY②和SG②)。的集成电路₅₀HuH-7细胞作为药效学指标活跃的化学物质。然后我们使用灰色关联分析抗肿瘤活性和常见的山峰之间的关系(15- - - - - -17]。分析表明,常见的山峰是抗肿瘤相关活动(相关系数> 0.6):31 > 3 > 33 > 5 > 29 > 35 > 6 > 30 > 15 > 28 > 26峰(表3)。

3.4。分析肿瘤的重量

表4和图10 ()表明,肿瘤重量FU组与对照组相比显著降低( );高剂量ip组( )和i.g.集团( )显示类似的效果。这表明高剂量(i.g.和i.p。)可以抑制肿瘤的生长。然而,肿瘤的重量低剂量组(i.g.和i.p。)与对照组没有显著不同。

3.5。肿瘤病理评分(他染色)

在对照组,肿瘤细胞显示深染色质染色,不规则的形状,和多态性(数据10 (b)和11)。治疗组肿瘤细胞显示不同程度的坏死,纤维组织增生,炎症细胞的浸润。低剂量组,没有显著影响病变与肿瘤有关。在高剂量组,有显著减少病变评分( )(表5(a))。

3.6。VEGF表达

光学显微镜显示VEGF-positive产品本地化在细胞质中,表示动脉内皮细胞的细胞质中,小静脉和毛细血管瘤(数字10 (c)和11)。血管生成在肿瘤组织在低剂量明显抑制,高剂量,傅注射组( )(表5(b))。

3.7。PCNA表达

光学显微镜检测到细胞核PCNA-positive产品(数字10 (d)和11)。高剂量组PCNA的表达显著降低( )比对照组(表5(c))。肿瘤细胞增殖显著抑制ip和傅i.g.高剂量和注射组。

4所示。讨论

在这项研究中,高效液相色谱色谱表明,有相似的化学成分的根,茎,叶。我们还利用灰色关联分析来评估每个组件的相对贡献肿瘤抑制;11个常见的山峰被证明是与肿瘤抑制活性。这些组件表现出协同的抗肿瘤效应,符合中医的优势(多组分和多目标)(18]。分析表明,c . sappan代表的关键资源大量的抗肿瘤化合物,从而为未来的研究提供一个有用的基础专注于识别与抗肿瘤活性的化合物。

表1和2表明,石油醚提取的c . sappan表现出最好的抗肿瘤活性。石油醚提取物的叶子和茎(SY②)显著地抑制肿瘤细胞的增殖与IC₅₀77.20μg / ml;这是甚至比根,传统上被用来准备提取的资源(根:SG②;集成电路₅₀= 56.10μg / ml)。因此,由此可见,叶子和茎也可以用作抗肿瘤药物治疗。灰色关联分析表明,11个活动分数表现出共同的山峰(33 # 31 #,3 #,5 #、29 #,35 #,6 #,30 #、15 #,28 #,26 #)抗肿瘤活性密切相关。这个基础是用于下一步的研究主要集中在提取,分离,鉴定与抗肿瘤活性的化合物。

有显著降低H22肿瘤组织的hepatoma-bearing老鼠为了应对高剂量管理(表4)。肿瘤细胞在对照组显示深染色质染色,不规则的形状,和多态(数字10 (b)和11)。在治疗组肿瘤细胞表现出不同程度的坏死,纤维组织增生,炎症细胞的浸润。肿瘤细胞的病变评分高剂量组显著低于其他组,从而表明,石油醚提取物的叶子和茎有一个可靠的和精确的抗肿瘤效应在活的有机体内。与其他组相比,高剂量治疗组显示减少纤维组织增生,炎症细胞浸润,肿瘤细胞和坏死;这些组织还显示增殖细胞核抗原、VEGF的表达减少。

过度增殖和远处转移是恶性肿瘤的重要生物学特性。因此,开发方法来抑制肿瘤细胞的扩散和防止其远处转移已成为临床治疗的主要焦点。PCNA、VEGF和其他因素扮演了一个重要的角色在促进肿瘤的扩散和转移,PCNA是细胞周期蛋白,细胞DNA聚合酶的辅助蛋白质存在于每个发展阶段的肿瘤细胞和正常细胞的增殖周期。然而,PCNA表达在G0和G1阶段的低水平。PCNA的表达开始于G1期,在S期达到高峰,但在M和G2阶段显著减少。这意味着增殖细胞核抗原表达的变化是一致的与DNA合成和是一个最有效的标记检测细胞增殖。PCNA表达可以直接反映肿瘤细胞的扩散。PCNA的表达越高,越活跃的细胞增殖;因此,PCNA被看作是一个细胞的增殖状态的一个有用的指标(19- - - - - -21]。许多研究表明,肿瘤组织的转移和增长依赖于充足的营养供应,新血管,和氧气。另一方面,由于高渗透率的新血管,肿瘤细胞可以很容易地通过和传播。浸润和转移[血管再生提供了条件22]。VEGF家族成员的受体酪氨酸激酶(RTK)家庭和在肿瘤血管生成中发挥关键作用。因此,VEGF是最重要的一个诱导的血管生成和血管通透性增加。一旦VEGF结合其相应的受体,它可以刺激肿瘤血管内皮细胞的增殖,增加血管通透性,提供一个合适的依据肿瘤浸润和转移;因此,VEGF是肿瘤治疗的主要目标之一(23]。

我们表明,叶子和茎的石油醚提取物可以显著抑制肿瘤细胞的增殖在活的有机体内。我们的数据也表明,在治疗组中,每个剂量抑制肿瘤的增殖,有显著减少肿瘤大小与模型组相比,也有减少病变的程度。免疫组织化学染色显示肿瘤组织内PCNA-positive细胞的数量低于模型组,从而表明机制SBLPE在肿瘤增殖的抑制作用可能与抑制高PCNA的表达。SBLPE显示抑制VEGF的表达在肿瘤组织中以一种有效方式,VEGF是最强的angiogenesis-promoting因子和扮演了非常重要的角色在促进肿瘤组织的扩散和转移。我们的数据表明,SBLPE抑制血管内皮细胞中VEGF的表达。此外,我们的数据表明,SBLPE抑制小鼠H22肿瘤生长和血管生成和抑制了远处转移的肿瘤细胞通过血管不成熟。结合SBLPE-treated肿瘤组织中VEGF的表达,我们的数据表明,SBLPE可能抑制H22肿瘤生长和血管生成的抑制VEGF的分泌肿瘤细胞,抑制肿瘤细胞的转移和扩散。

肿瘤细胞增殖和转移的机制是复杂的。我们的研究只调查了机制anti-H22肿瘤效果通过评估抗肿瘤生长和微血管的生长。现在需要进一步的研究来证实这些机制和识别相关的通路。然而,重要的是要注意,SBLPE仍然是一个混合物。现在需要进一步的研究来确定SBLPE中的有效成分。然而,我们的研究结果提供有意义的依据有效物质的进一步鉴定与抗肿瘤作用。

5。结论

在本文中,我们演示了,第一次,石油醚提取准备的叶子和茎c . sappan可以抑制肿瘤细胞的扩散。相比传统的资源准备医疗提取物(树根和树干),茎和叶的使用所造成的损失就会相应减少宝贵的资源。因此,我们的数据表明,使用的资源准备提取的范围可以扩大到叶子和茎,从而保护价值c . sappan资源。

石油醚提取准备的叶子和茎c . sappan降低PCNA的表达VEGF的H22肿瘤hepatoma-bearing老鼠。灰色关联分析表明活动分数的11个常见的山峰是抗肿瘤活性密切相关。数据提供一个有用的基础提取、分离和鉴定化合物抗肿瘤活性。

数据可用性

这个项目的所有数据都可以从相应的作者。

信息披露

元李董和Minghong co-first作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由贵州省科技部门的支持贵州大学中医药联合基金项目(QianKeHe ZY子[2010]LKZ7021),贵州一流学科建设项目(GNYL[2017] 008号),综合症中医药理(肯塔基州QianJiaoHe子[2017]006号),贵州省重点实验室的处方。贵州省国际科技合作项目(QianKeWaiHe G子[2010]7012号),贵州省科学技术计划项目任务(QianKeHe SY子[2009]3104号),贵州大学中医博士发起的项目(GuiZhongYiBoShiQiDong[2020] 75郝)。