文摘

石斛兰混合物(DMix)是一种有效的治疗糖尿病肾病(DN),但其作用的分子机制尚不清楚。在这项研究中,我们调查是否DMix调节转化生长因子-β1 (TGF -β1)/ Smads信号转导通路。24 db / db小鼠随机分为三组:模型,DMix,和gliquidone团体,而八db / m老鼠被选为正常对照组。该药物是由连续8周填喂法。体重(BW),肾脏重量(千瓦)、肾脏指数、空腹血糖(FBG)、血脂、24小时尿白蛋白排泄率、血尿素氮和血清肌酐水平测定。肾组织病理改变光学显微镜下观察。实时定量PCR和免疫组织化学染色法检测TGF -的mRNA和蛋白表达水平β1和alpha-smooth肌肉肌动蛋白(αsma),分别在肾组织。TGF -β1 Smad2 p-Smad2、Smad3 p-Smad3,α用免疫印迹sma表达水平测定。结果表明,DMix显著降低光纤光栅级别,BW,千瓦,血脂水平和改善肾功能在db / db老鼠。组织病理学显示DMix减轻肾小球系膜细胞增殖和db / db小鼠肾间质纤维化。此外,DMix减少了蛋白质和信使rna表达水平的TGF -β1,αsma和抑制Smad2 Smad3磷酸化。我们得出这样的结论:DMix可能抑制肾纤维化和延缓DN的发展通过调节TGF -β1 / Smads信号通路。

1。介绍

糖尿病肾病(DN)是一种常见的慢性微血管并发症的糖尿病和糖尿病患者死亡的最重要原因(1,2]。DN的特点是肾小球基底膜增厚,系膜细胞增殖,细胞外基质的积累,导致肾小球硬化症和间质纤维化(3,4]。转化生长因子-β1 (TGF -β1)是一个关键cytokine-promoting纤维化,Smad蛋白是细胞内激酶的底物转化生长因子-β1受体,介导TGF -β1信号通路。激活的TGF -β1 / Smads信号转导通路肾纤维化的发展是一个重要的机制(5- - - - - -7]。石斛兰混合物(DMix)是一种制备用于福建中医药大学第二附属医院(批号:最小Q / yz - 2012 - 315;专利号:ZL201110408411.0)是由施教授在香港的长期临床治疗糖尿病及其并发症。它由石斛兰,黄芪,丹参,中药知母和其他草药。它有降低血糖和血脂水平的影响和改善胰岛素抵抗后临床应用(8- - - - - -10),但潜在的分子机制尚不清楚。在这项研究中,TGF DMix——的影响β1 / Smads信号通路在db / db小鼠肾组织观察DN,和它讨论了改善DN的机制提供实验依据的使用DMix在临床实践中。

2。材料和方法

2.1。药物

DMix煎煮,15克组成石斛兰,20克黄芪,8 g五味子属,15克葛根,20克丹参,18 g生地黄,12克中药知母从Guoyitang诊所购买,福建中医药大学(FJTCM)。Gliquidone平板电脑(生产批号。1140573)从北京购买Wanhui Shuanghe制药有限公司,有限公司,北京,中国。

2.2。动物

db / db老鼠(男,11周大,体重42-46 g)db /米老鼠(男,11周大,体重21 - g)提供的实验动物科学,北京大学医学科学系(许可证号码:SCXK (Jing) 2011 - 0012)和保存在一个specific-pathogen-free环境实验动物中心FJTCM,免费获取标准饮食和水。所有动物实验动物福利按照国际公认的指导方针和FJTCM医学伦理委员会批准(批准号2019 - 034)。

2.3。实验设计

适应性喂养1周后,根据空腹血糖(FBG)水平和体重(BW), db / db小鼠被随机分为三组(n= 8):模型组、DMix集团和gliquidone组(积极的控制)。此外,八个db / m小鼠与正常同龄的表现被选为正常对照组。所有动物通过胃内的行政管理治疗临床等效剂量的体重60公斤的成年人。老鼠在正常控制和模型组管理20毫升/(公斤·d)生理盐水,阳性对照组收到5毫克/公斤·d gliquidone,和DMix治疗组12 g /(公斤·d) DMix, 8周的一天一次。

2.4。光纤光栅测量水平,BW,肾脏重量(千瓦)、肾脏指数(KI),血脂水平和肾功能

光纤光栅的老鼠水平测量血糖仪和试卷每隔2周治疗期间,使用血液收集的尾巴尖。管理8周后,小鼠的重量决定,老鼠置于代谢笼。尿液收集24小时,尿白蛋白排泄率(阿联酋)确定使用尿蛋白定量工具(南京建成生物工程研究所、南京、中国)。治疗后,所有老鼠都通过腹腔内注射2%戊巴比妥钠麻醉(0.01 mL / g)。轨道血液收集分离的血清检测血尿素氮(BUN)测定,血清肌酐(Scr)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平。生化分析工具都是购自南京建成生物工程研究所(中国南京)。老鼠牺牲后,肾脏都移除,用生理盐水洗净,称重。

2.5。肾组织学

肾组织的一部分在4%多聚甲醛溶液固定,嵌入在石蜡,切成4μ米厚的部分,然后沾hematoxylin-eosin(他),周期性acid-Schiff (PAS),和马森。彩色肾脏部分被放大的光学显微镜下检查×400。平均肾小球面积、总肾小球系膜基质面积比地区PAS-stained部分,和胶原蛋白的比例积累区域在马森三色染色部分肾小球面积测量使用ImagePro + 6.0定量软件。在每个部分中,十个肾小球是随机挑选的,积极的信号选择肾小球是突出显示和测量,和积极的地区是量化整个肾小球的比例。

2.5.1。他染色

干肾组织部分使用二甲苯脱蜡、梯度酒精,和蒸馏水,然后用苏木精染色10分钟,分化与1%盐酸酒精5 s,然后放入曙红3分钟。然后,脱水和透明的密封进行了光学显微镜下观察。

2.5.2。PAS染色

干肾组织部分使用二甲苯脱蜡、梯度酒精,蒸馏水紧随其后碘酸氧化5分钟和希夫试剂的解决方案,持续15分钟。苏木精染色后1分钟,1%盐酸酒精分化3 s、脱水、透明的密封进行显微镜检查。

2.5.3。马森染色

干肾组织部分使用二甲苯脱蜡、梯度酒精,和蒸馏水,然后固定1 h Bouin固定剂的解决方案。马森复合染色溶液浸泡10分钟,和1%的钼磷酸盐分开10分钟。胶原纤维呈红色和苯胺蓝浸泡在2%的解决方案5分钟。然后,脱水和透明的密封进行了光学显微镜下观察。

2.6。实时定量PCR (RT-qPCR)

总RNA提取小鼠肾组织与RNAiso +试剂(豆类、东京、日本)和浓度决定。然后,cDNA被逆转录合成使用逆转录工具包(豆类、东京、日本)。PCR反应了使用PCR工具包(豆类、东京、日本)在下列反应条件:初始变性30年代在95°C,紧随其后的是40周期的变性5 s在95°C,退火55°C 30年代,在72°C和扩展1分钟。SDS 2.4软件被用来分析CT值的样品检测PCR过程中,使用β肌动蛋白作为内部参考和采用ΔΔCt相对定量分析的方法,与2^−△△Ct作为一个数量相对目标RNA的表达。PCR引物(表1)所提供的设计和福州上亚生物技术有限公司有限公司(福州、中国)。

2.7。免疫组织化学

肾脏组织在4%多聚甲醛溶液固定,嵌入在石蜡,切成4μ米厚片,烤2 h,使用二甲苯脱蜡两次,与梯度酒精水化,放入煮熟的柠檬酸钠溶液为抗原修复,和自然冷却到室温(18 - 30°C)。的部分与磷酸盐(PBS)冲洗三次,co-incubated与内源性过氧化物酶阻断剂在室温下10分钟,冲洗三次与PBS和co-incubated没有免疫动物血清在室温下10分钟。去除血清后,主要抗体添加一滴一滴地如下:兔子anti-TGF -β1,反αsma多克隆抗体(1:100稀释;Abcam,剑桥,英国),一夜之间在4°C的环境和PBS冲洗三次;biotin-labeled羊anti-rabbit免疫球蛋白(准备使用,福州Maixin生物科技有限公司,有限公司,福州,中国),在室温下孵化与PBS 10分钟,冲洗三次;和streptavidin-peroxidase(福州Maixin生物科技有限公司、福州、中国),在室温下孵化为10分钟,冲洗三次PBS。轻拍(武汉博士德生物技术有限公司,武汉,中国)然后添加颜色开发,用蒸馏水冲洗,hematoxylin-dyed,利用青水冲。组织使用酒精梯度脱水,接着干,之后,他们与二甲苯透明,与中性胶密封。组织部分被评估为阳性染色(棕色)在光学显微镜下观察。Image-Pro + 6.0图像分析软件用于半定量的分析;十不重复包含肾小球高倍率(×400)视觉领域被随机选择从每个部分计算累积光密度(IOD)阳性染色的面积测量部分(区域);平均的值被用于分析和相关蛋白表达是由平均密度(IOD /区域)。

2.8。免疫印迹分析

肾组织存储在液态氮与适当的混合蛋白质溶解产物完全地产生组织匀浆。离心后(4°C, 12000 rpm, 15分钟),从上层清液总蛋白提取和使用bicinchoninic酸测定蛋白质浓度测定。然后,30μg的每个样本用于10% sds - page凝胶电泳,转移到聚偏二氟乙烯膜,并与5%的脱脂牛奶在室温下密封1 h。主要抗体(TGF -β1 Smad2 p-Smad2、Smad3 p-Smad3,αsma)在一夜之间被添加和孵化膜在4°C。与tris-buffered生理盐水冲洗后,0.1% 20 (TBST),渐变膜在室温下二次抗体孵育1 h。TBST清洗后,细胞膜染色使用增强化学发光和通过凝胶成像系统查看。相应的抗体稀释如下:β肌动蛋白(1:1000稀释;Abcam,剑桥,英国),TGF -β1(1:500稀释;Abcam,剑桥,英国),Smad2(1: 1000稀释;Abcam,剑桥,英国),p-Smad2(1: 300稀释;Abcam,剑桥,英国),Smad3(1: 5000稀释;Abcam,剑桥,英国),p-Smad3(1: 2000稀释;Abcam,剑桥,英国),αsma(1: 500稀释;Abcam,剑桥,英国),goat-anti-mouse免疫球蛋白二次抗体(1:2000稀释;Beyotime、上海、中国)和goat-anti-rabbit免疫球蛋白二次抗体(1:1000稀释;中国上海Beyotime)。加沙地带的灰度值是衡量使用实验室的图像分析软件,结果表达的相对目标蛋白的表达,使用β肌动蛋白作为内部参考。

2.9。统计分析

使用SPSS 22.0统计软件分析数据,这是表示为均值±标准差(SD)。多个样本组之间的区别进行了分析使用单向方差分析。Bonferroni方法用于两两对比组的方差齐次时,和Tamhane T2比较时使用方差是异构的。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。比较普遍的迹象

正常组小鼠在良好的心理状态,响应,闪亮的头发,和一个好的饲养条件。db / db老鼠无精打采、反应迟钝,与饮食和增加尿量;上述症状的老鼠在每个治疗组与模型组相比不同程度改善。

3.2。DMix db / db小鼠空腹血糖水平的降低

光纤光栅水平db / db老鼠约3×高于正常组( )。DMix组光纤光栅水平逐渐下降随着治疗时间(图1)。4星期后,有一个显着减少的光纤光栅水平DMix组与模型组相比(星期4, ;星期6和8, ),DMix之间的观察,没有统计上的显著差异和阳性对照组( ),表明DMix在db / db老鼠可以降低血糖。

3.3。比较BW,千瓦和KI每组

BW,千瓦,吻db / db老鼠明显高于正常组( , )。DMix治疗8周后,BW,千瓦,KI的老鼠都低于模型组不同程度(KI, ;BW和KI, )(图2(一个)- - - - - -2 (c))。此外,有DMix和gliquidone组之间无显著差异( )。

3.4。DMix TC和TG水平的影响db / db老鼠

小鼠的血清TC和TG水平模型组显著高于正常组( )。TC和TG水平DMix和gliquidone组明显低于模型组(TG, ;TC, )(图3(一)和3(b))。有DMix和gliquidone组之间无显著差异( )。这些结果表明,DMix可以调节脂类代谢。

3.5。DMix改善肾功能的db / db老鼠

每组小鼠肾功能指标的测量,包括可控硅,包子和阿联酋。这些指标都显著的高于模型组比正常组( ),表明该DN小鼠模型成功建立,肾功能不全在DN老鼠。可控硅,面包,和阿联酋的老鼠DMix组明显低于模型组( ),但是有DMix和gliquidone组之间无显著差异( )(图4(一)-4(c))。这些结果表明,DMix对肾脏有保护作用的db / db老鼠。

3.6。DMix对肾脏病理形态学的影响db / db的老鼠

他(图5(一个))并不是(图5 (b))染色显示明显的肾组织结构,正常肾小球大小、形态、和间隙空间,在系膜矩阵尺寸没有增加,肾小管腔通畅,完整的上皮细胞,没有糖原沉积。db / db小鼠肾小球肥大,一个更大的系膜增殖,系膜区,局部毛细血管管腔狭窄,肾小管上皮细胞空泡变性,肾间质细胞,大量的红点的糖原沉积。DMix和gliquidone组与模型组相比,改善肾小球基底膜薄,大大减少系膜细胞增殖,较小的细胞外基质,和更少的糖原沉积比模型组。此外,在DMix gliquidone组、肾的管状结构几乎恢复正常。马森染色(图5 (c)显示胶原纤维积累在肾小球阻力指标在模型组病变的老鼠,也许可以和和胶原纤维沉积DMix治疗后明显改善。定量分析结果显示,肾小球面积、系膜基质的百分比,百分比的胶原蛋白积累区域模型组与对照组相比显著增加( )。治疗8周后,肾小球面积、系膜基质的比例,胶原蛋白积累的比例与模型组相比显著降低( , )。无显著差异观察DMix和gliquidone组( )(图5 (d)- - - - - -5 (f))。

3.7。DMix抑制TGF -的mRNA和蛋白表达水平β1,αsma在db / db小鼠的肾组织

TGF -β1已被确定为一个潜在的目标DN治疗,同时的水平αsma,标记参与肾小管epithelial-mesenchymal过渡(EMT)过程,被认为反映了肾纤维化的程度(11,12]。DMix评价治疗效果,信使rna表达水平的TGF -β1,α使用RT-qPCR sma测量在肾组织中。结果表明,该表达式TGF -β1,αsma在肾组织的小鼠模型组明显高于正常组( )。此外,TGF -的表达式β1,αsma在DMix gliquidone组低于模型组(αsma, ;TGF -β1, );然而,他们仍高于正常组(图6(一))。此外,没有观察到显著差异DMix和gliquidone组( ),表明DMix抑制的mRNA表达TGF -β1,αsma在肾组织中db / db老鼠。

为了进一步证明DMix的治疗效果,免疫组织化学染色检测执行大量的TGF -β1,αsma蛋白在小鼠的肾组织。与RT-qPCR结果是一致的。TGF -β1,αsma在小鼠的肾脏弱表达在正常组和模型组(TGF -强烈的表达β1, ;αsma, );棕色阳性染色主要是检测肾小球和肾小管的上皮细胞。丰富的TGF -β1,αsma显著低于治疗组与模型组相比,( );然而,它仍高于正常组(数字6 (b)- - - - - -6 (d))。同时,观察无显著差异DMix和gliquidone组( ),表明DMix减少了大量的TGF -β1,αsma的肾组织中蛋白质db / db老鼠。

3.8。DMix抑制了TGF -β1 / Smads信号通路在db / db小鼠的肾组织

Smad通路的激活及其随后的核换位TGF -是一个关键的一步β在DN 1-mediated肾纤维化13]。的磷酸化Smad2 Smad3也TGF -一个重要的信号转导过程β1 / Smads信号通路,他们的表情表明TGF -β1 / Smads信号通路激活(14]。TGF -的表达β1 Smad2 p-Smad2、Smad3 p-Smad3,αsma在小鼠肾组织通过西方墨点法测量。TGF -的蛋白表达β1、p-Smad2 p-Smad3,αsma模型组显著高于正常组( ),表明TGF -β1 / Smads信号通路激活在db / db小鼠肾组织。治疗8周后与DMix TGF -的表达β1、p-Smad2 p-Smad3,αsma蛋白明显低于模型组(TGF -β1:β肌动蛋白,p-Smad2: Smad2,αsma:β肌动蛋白, ;p-Smad3: Smad3, ),但是没有显著改变Smad2和Smad3蛋白的表达(图7(一)- - - - - -7 (d))。有DMix和gliquidone组之间无显著差异( )。西方印迹显示DMix抑制TGF -β1 / Smads信号通路在db / db小鼠的肾组织。

4所示。讨论

目前,DN对人类健康造成巨大威胁,传统中药在DN的治疗取得了良好的效果。在初步实验研究和临床实践,DMix已被证明有很好的治疗效果在糖尿病及其并发症8- - - - - -10,15- - - - - -17]。在这项研究中,我们观察到DMix可以治疗DN通过抑制肾纤维化和改善肾功能。DMix TGF -的表达减少β1,αsma和抑制磷酸化Smad2 Smad3,从而DN发展放缓。

DN是由多种因素引起,包括高血糖,高血压,高脂血症(18- - - - - -20.]。db / db的鼠标是一种广泛使用的动物模型研究DN,的发病机理是由于缺乏瘦素受体基因(21,22]。这个实验的结果表明,db / db小鼠体重明显大于db / m老鼠。此外,血糖、可控硅和包子的水平,和KI db / db小鼠均明显高于正常组。此外,db / db老鼠表现出蛋白尿,血脂异常,肾小球肥大和纤维化,确认,DN模式是成功的。与DMix治疗后,这些参数明显减弱(数字1- - - - - -4),这与先前的研究一致,我们的临床观察9- - - - - -11]。此外,他,不是,马森染色表明,肾脏病理损伤的程度和纤维增生明显改善模型组与政府的DMix(图5)。DN的特点是蛋白尿和肾小球硬化(23,24),我们的结果表明,DMix不仅可以减少尿蛋白水平也降低了肾纤维化,表明DMix有效防止DN的发展。

DN的发病机制很复杂,尚未完全阐明。肾间质纤维化是一个重要的肾功能恶化DN发病的机制。因此,延缓DN的发展的关键在于抑制肾间质纤维化(25,26]。TGF -β1 / Smads肾纤维化的核心途径和发展的重要因素之一的DN (27,28]。TGF -β1被认为是一个重要因素导致肾间质纤维化和先前的研究已经证实,TGF -β1是在DN (29日,30.]。Smad2和Smad3下游TGF -β1,促进Smad2 Smad3磷酸化,激活。两种蛋白有很高的同源性,随后被转移到细胞核、调节fibrosis-related目标基因的表达,如αsma,加速肝纤维化的进展31日- - - - - -33]。p-Smad2和p-Smad3蛋白质的表达是TGF -的一个标志β1 / Smads信号通路激活(34,35]。研究表明,p-Smad2 p-Smad3表达水平明显增加患者的慢性肾脏疾病和肾纤维化动物模型,从而激活TGF -β1 / Smads信号通路,同时增加的表达αsma蛋白质、间充质细胞的标记,它的表达水平反映了肾纤维化的程度(36- - - - - -38]。TGF -的抑制β1 / Smads信号通路可以有效地减少DN肾纤维化和改善肾功能(39,40]。在这项研究中,免疫组织化学(图6 (b)- - - - - -6 (d))和免疫印迹(图7)分析表明,TGF -的表达水平β1、p-Smad2 p-Smad3,αsma蛋白质DMix组显著降低。TGF -的mRNA的表达β1,αsma(图6(一))与蛋白质表达的TGF -是相一致的β1,αsma。这些结果表明,DMix可能抑制肾纤维化由于负调节TGF - DNβ1 / Smads通路。

糖尿病并发症的治疗重点是早期预防。有许多类型的药物的临床治疗DN。有效地降低血糖,避免肾毒性是重要的选择依据。Gliquidone建议口服治疗DN的早期阶段,因此,作为一个积极的控制在当前的研究中,因为它可以促进胰岛素分泌通过绑定到特定的受体胰腺细胞膜,施加一定的肾保护作用[41]。在我们的研究中,我们观察到DMix和gliquidone db / db小鼠的血糖水平降低,抑制了TGF -β1 / Smads信号通路,改善肾脏功能和病理结构的模型动物。以前的研究已经表明high-glucose环境增加TGF -的表达β肾脏和激活TGF - 1β1 / Smads信号通路在糖尿病的发展,这是糖尿病肾病的进化密切相关(42,43]。因此,我们推测,DMix可以降低血糖水平,抑制TGF -β1 / Smads通路,它可能代表一个重要的预防和治疗机制受雇于DMix DN。

虽然研究结果证实了我们的假设,我们的研究可能有一些限制。例如,尽管DMix对DN肾纤维化的影响,需要更多的和更大的研究和临床试验进一步验证。此外,由于时间和金融的限制,我们无法进行细胞实验调查DMix对DN的影响,和具体的机制仍需研究。

5。结论

我们的结果表明,DMix施加DN老鼠的肾脏保护作用,这可能是抑制肾EMT并通过调节TGF -纤维化β1 / Smads通路,从而延缓DN的进展。因此,DMix可能是一种很有前途的药物治疗DN。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持的福建中医药大学研究平台管理项目(没有。X2019001-platform)、福建省自然科学基金(2018 j01873和2019 j01333号)和中国国家自然科学基金(没有。81703909)。