文摘

背景。胃腺癌是世界上第五大诊断恶性肿瘤。巨噬细胞的免疫系统由不均匀混合物,国防身体通过吞噬作用和不同的细胞因子和趋化因子的生产。肿瘤导致巨噬细胞极化方式的不同他们最喜欢的生长和血管生成。Umbelliprenin,自然倍半萜烯香豆素,已被证明对一些肿瘤有抗癌特性,包括胃腺癌。我们的研究的目的是探讨umbelliprenin对巨噬细胞的极化的影响除了一些可溶性因子的测量。方法。集成电路的值5和集成电路50umbelliprenin的AGS和THP-1细胞被估计使用MTT试验。THP-1细胞治疗10μM umbelliprenin,单独或cocultured AGS细胞。流式细胞术分析CD68 THP-1细胞进行治疗,CD86,和CD206标记评估M0、M1、M2巨噬细胞极化,分别。AGS细胞凋亡和坏死的细胞被评估流式细胞术与膜联蛋白标签后V-FITC propidium碘。白介素- 10 (IL)和IL - 12在上层清液的ELISA方法测定含量。格里斯反应分析技术被用来确定一氧化氮(NO)浓度。结果。MTT结果显示低毒性的umbelliprenin THP-1 (IC50= 75.79)相比AGS细胞系(IC50= 48.81)。Umbelliprenin显著增加M1 / M2比率。il - 10含量显著降低M1和M2的上层清液细胞umbelliprenin治疗后,虽然白介素增加M1上层清液的细胞和减少M2上层清液的细胞。Umbelliprenin引起的增加没有上层清液的细胞M1。结论。Umbelliprenin改变了巨噬细胞的分泌物和表型的肿瘤抑制。

1。介绍

胃腺癌(GA)是第五个最常见的大多数恶性肿瘤诊断和胃。尽管癌症的患病率减少在工业化国家,它仍然是第三个癌症相关的死亡率的主要原因。不幸的是,到目前为止,没有很多的治疗选择。手术切除是一个潜在的治疗选项在早期阶段。然而,结果是显著影响过程侵略性,复发和远处转移1]。常规治疗,也被称为新辅助和辅助化疗,可以改善预后和总生存期,但内在和获得性耐药可以减少治疗成功2]。

炎症微环境起着重要的作用在癌症的发展。巨噬细胞在炎症细胞参与先天免疫的过程中,炎症和白细胞渗透的主要部分存在于实体肿瘤(3,4]。因为巨噬细胞的可塑性,至少有两个子集的单核细胞在人体血液,基于古典或替代激活过程。炎症刺激,如脂多糖(LPS)和干扰素-γ(IFN -γ),产生经典激活巨噬细胞,也称为M1巨噬细胞,而抗炎刺激,如IL4和使用IL13,极化巨噬细胞对其或者激活形式,也被称为M2巨噬细胞。每个类型都有特定的受体表达,细胞因子,趋化因子的生产,因此具体的功能。M1子集展品促炎细胞因子白介素- 12 (IL)等促进Th1效应响应,而抗炎M2巨噬细胞具有更高的IL - 10和降低IL - 12生产资料(5- - - - - -7]。

肿瘤相关巨噬细胞(tam)代表最大的人口恶性肿瘤的浸润炎症细胞,改变肿瘤微环境做出贡献通过免疫抑制肿瘤恶化的监管过程,基质形成、入侵、血管生成、转移,和proangiogenic分泌血管内皮生长因子(VEGF)等因素。tam的功能状态不断变化对肿瘤微环境的变化。在肿瘤细胞内,M2-polarized tam发现主要影响抗癌药物的疗效[8]。

Umbelliprenin (UMB)是一种天然的倍半萜烯aurapten香豆素化合物和也有类似的结构,一个是合成了各种抗肿瘤化合物教鞭物种,如柠檬(图1)[9]。UMB是有效的组成部分竹板sinkiangensis中国传统医学(中医),新疆地区几个世纪以来一直被用于治疗胃疾病(10]。UMB已被证明具有独特的药理和生物学特性,如抗炎、免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、细胞毒性、抗菌、抗艾滋病,antileishmanial和antiosteoporosis属性(11,12]。


图1
umbelliprenin结构。

UMB的抗癌特性是通过外在和内在的凋亡通路介导的(13),导致抑制G0 /G1细胞周期和减少肿瘤迁移和入侵。这个过程可以通过Wnt,伯灵顿,NF -kB,飓风E和其他一些途径(14]。

本研究旨在调查UMB巨噬细胞的极化的影响及其对tam的影响使用AGS细胞行cocultured THP-1。

2。材料和方法

2.1。试剂

Umbelliprenin (UMB)从Golexir帕尔斯有限公司购买(Mashhad-Iran)。rpmi - 1640中,3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴(MTT)粉,phorbol-12-myristate-13醋酸(PMA)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。胎牛血清(的边后卫)和青霉素和链霉素(100 U /毫升)购买(Gibco®,生活技术,美国),和台盼蓝和DMSO从默克公司(德国)购买。

2.2。UMB准备

股票的解决方案是由溶解2毫克的UMB 25μL DMSO溶液形成一个218.3毫米的解决方案,和一个串行稀释。我们增加了0.5μ每200 L的UMB解决方案μL的,使最终的无毒DMSO溶液的浓度(少于0.25% )在所有样本。

2.3。细胞培养,MTT试验

THP-1和AGS细胞系获得巴斯德研究所(Tehran-Iran)。AGS和THP-1细胞系都种植在rpmi - 1640中补充10%的边后卫,100 U /毫升青霉素,100μg / ml链霉素,孵化出了37°,C0湿润,95%和5%2。两个细胞系通道在使用前至少五次。

指数增长的THP-1(10000个细胞/)和AGS细胞(4000 /)隔离被播种在200年96 -孔板包含一式三份μL (rpmi - 1640中孵化24小时(37°C,湿度95%,5%的公司2)。第二天,中取代和不同浓度的细胞治疗UMB(2.1, 4.2, 8.5, 17岁,34.1,68.2,136,272.8和545.7µ20米),24小时后μL (MTT(5毫克/毫升)的解决方案是添加到每个孵化一个额外的4小时。包含THP-1离心机在1000 rpm的井和20°C 5分钟前在黑暗条件下孵化。然后,包含麻省理工的媒介解决方案是轻轻删除,和100年μL的DMSO溶液添加到每个。15分钟后,吸光度是在540 nm和630 nm)使用ELISA读者(BioTek)。我们使用UMB集成电路5(10μ米)在AGS细胞进一步调查。

2.4。THP-1极化

从M0巨噬细胞分化THP-1细胞,PMA (50 nM)用于24小时。孵化的M0巨噬细胞与有限合伙人(50 ng / ml)和干扰素-γ(50 ng / ml)额外的24小时内使他们成为M1-type巨噬细胞。获得M2-type巨噬细胞,孵化M0巨噬细胞是通过IL4的存在(25 ng / ml)和使用IL13 (25 ng / ml) 24小时。

2.5。Coculture AGS的THP-1派生的巨噬细胞

与M0 coculture AGS的巨噬细胞, THP-1细胞被播种在每个室,插入到6-well板包含RPMI 1640中处理50 nM PMA。然后,M1巨噬细胞极化,有限合伙人(50 ng / ml)和干扰素-γ(50 ng / ml)被使用,或M2巨噬细胞极化,IL4 (25 ng / ml)和使用IL13 (25 ng / ml)被添加到中24小时。与此同时, AGS细胞/好被播种到6-well附着板包含RPMI 1640中。24小时后,插入钱伯斯在AGS插入包含井后改变介质与新鲜的RPMI介质。在24小时内,浮层被用来评估il - 10、il - 12和一氧化氮。AGS细胞收集评估凋亡通过测量膜联蛋白V /π指数通过流式细胞术。巨噬细胞亚型被确定通过CD68 (M0)、CD86 (M1),和CD206 (M2)标记通过流式细胞术(CyFlow空间)。

2.6。UMB治疗组

在PMA, THP-1细胞分化成M0巨噬细胞。M0 M1和M2巨噬细胞可以分化成巨噬细胞通过添加有限合伙人+干扰素-或IL4 +使用IL13培养基。UMB被加入到培养基在巨噬细胞增殖的不同阶段评估对巨噬细胞极化的影响以及il - 10、il - 12和一氧化氮浓度的变化(图文化传媒作为一个巨噬细胞功能指标2)。


图2
UMB治疗组的详细描述。UMB集成电路5( )介绍了在阶段。流式细胞仪是用来识别M0、M1和M2巨噬细胞使用CD68、CD86和CD206。ELISA用于评估的il - 10、il - 12水平。格里斯反应分析技术被用来确定一氧化氮(NO)浓度。
2.7。一氧化氮测定

亚硝酸盐作为一氧化氮的标记的评估是通过格里斯试剂测量一氧化氮。执行测试,100年μL收集细胞培养上清液和混合着50μL磺胺1%和50μL N-1-naphthyl乙烯盐酸盐0.1%。10分钟后在室温下孵化,吸光度测量使用ELISA读者在540海里。

2.8。白介素化验

所有试剂和对细胞因子il - 10、il - 12的抗体购自BD生物科学有限公司根据协议和测试工具。吸光度测量在450 nm的ELISA读者。

2.9。膜联蛋白V /π化验

为了解决AGS细胞的凋亡和坏死的程度,附件V-FITC使用FITC附件V / PI双染色进行细胞凋亡检测装备,BD,美国。胰蛋白酶解包含EDTA(0.02%)和PBS胰蛋白酶(0.05%)是用于AGS细胞的收获。然后,这些细胞被洗了三次PBS溶液和resuspended 1 x绑定缓冲的浓度 细胞/毫升。100年μL是转移到培养管,5μL FITC附件V和5μLπ被添加。混合物在黑暗中孕育了15分钟。最后,400年μL 1 x绑定缓冲被添加到每个管,和流式细胞术(贝克曼库尔特史诗XL.MCL)分析。

2.10。数据分析

图表和统计制图组的比较方法和测量集成电路50和集成电路5MTT试验进行使用GraphPad Prism 6.0软件,和 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。UMB对AGS和THP-1细胞细胞毒性的影响

MTT试验进行检测THP-1 UMB细胞毒性和AGS细胞系在24小时内。的集成电路50值75.79 THP-1和AGS细胞系µ米(CI 95%;61.49 - 93.42)和48.41µ米(CI 95%;分别为33.02到70.97)。IC的THP-1细胞系价值5是23.26µ米(CI 95%;15.18到35.66),AGS,它是11.12µ米(CI 95%;3.65到33.85)。UMB 10µM是集成电路5在AGS细胞用于所有后续实验研究UMB对这些细胞以最小的细胞毒性的影响(图3)。


图3
可行性的结果THP-1 AGS细胞培养在不同UMB使用MTT测定浓度。每个点代表均值±SD的三重化验。
3.2。UMB对巨噬细胞极化的影响

UMB IC的净效应5生产M0、M1和M2是减少的影响,可能与细胞毒性UMB(图的影响4)。


图4
mo的百分比(CD68) M1 (CD86)和M2 (CD206) UMB IC5(10μ米)处理和未经处理的THP-1细胞是由流式细胞术。每个酒吧代表均值±SD的三个独立的实验。 < 0.05; < 0.01; < 0.0001。

UMB集成电路的影响5在THP-1分化M0 M1和M2巨噬细胞和随后的极化巨噬细胞亚型是评估通过对比亚型巨噬细胞比率UMB-treated和未经处理的THP-1细胞。结果显示显著增加M1 / mo ( = 0.0212),显著降低M2 / mo ( = 0.0334),并显著增加M1 /平方米( = 0.0483),这表明UMB-treated细胞作用的M1支配和M2减少(图5)。


图5
M1 / M0、M1 / M2和M2 / M0 UMB-treated巨噬细胞和未经处理的巨噬细胞细胞的比例。每个酒吧代表均值±SD的三个独立的实验。 < 0.05。
3.3。UMB影响AGS Cocultured THP-1细胞

THP-1细胞被播种到插入钱伯斯和分化成M0、M1、M2亚型巨噬细胞通过添加区分因素。UMB + PMA显著增加M1 / M2与对照组相比,但UMB M1-potentiating效应降低了M0分化后coculture + UMB组(图6(一)和表1)。M1极化通道,UMB + LPS和干扰素-γ增加了M1 / M2比率(图6 (b)和表1),在M2极化,UMB + IL4和使用IL13增加这个比例也显著(图6 (c)和表1)。UMB时也显著增加M1 / M2的比例添加到M1和M2分化细胞(数字6 (b)和6 (c)和表1)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图6
M1 / M2比cocultured UMB IC5 (10μ米)治疗与AGS细胞巨噬细胞由流式细胞术在M0 (a), M1 (b),和M2 (c)极化过程。每个酒吧代表均值±SD的三个独立的实验。 < 0.05; < 0.001; < 0.0001;ns:不重要。
表1
UMB影响M1 / M2的比率cocultured AGS和THP-1细胞。
3.4。AGS细胞的凋亡/坏死分析

为了评估潜在的凋亡和坏死的UMB势差现象cocultured AGS细胞,cocultured AGS细胞进行了分析通过膜联蛋白V-FITC / PI双染色流式细胞术24小时后的UMB 10µM曝光。我们的结果没有显示出显著变化的膜联蛋白V /π在AGS细胞cocultured M0、M1、M2细胞后添加UMB(图7)。


图7
AGS细胞的膜联蛋白V /π化验cocultured UMB 10μ米治疗M0、M1和M2的细胞。每个酒吧代表均值±SD的三个独立的实验。 < 0.05; < 0.01; < 0.001; < 0.0001;ns:不重要。
3.5。UMB对一氧化氮的影响生产

在目前的研究中,亚硝酸盐作为一氧化氮产量指数被认为是。Cocultured上层的媒体使用一氧化氮测定设备进行评估。结果表明,UMB显著降低没有生产M0 PMA + UMB和coculture + UMB组(图8(一个)和表2M1),但没有增加生产cocultured巨噬细胞而没有显著影响有限合伙人+干扰素-γ+ UMB组(图8 (b)和表2)。M2 cocultured巨噬细胞没有表现出显著差异在一氧化氮(图的生产8 (c)和表2)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图8
上层清液中一氧化氮测定UMB 10μ米治疗与M0 AGS细胞巨噬细胞(a), M1 (b), M2 coculture (c)。每个酒吧代表均值±SD的三个独立的实验。 < 0.05; < 0.01; < 0.001; < 0.0001;ns:不重要。
表2
UMB对一氧化氮浓度的影响(μ在媒体cocultured M)。
3.6。UMB影响白细胞介素- 10”和Interleukin-12生产

M1和M2的coculture上层清液的收集测定il - 10、il - 12。结果表明,il - 10的内容在M1和M2 cocultures显著下降。M1 coculture显示的白介素含量显著增加,虽然在M2 coculture,显著降低(图9和表3)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图9
il - 10、il - 12浓度媒体UMB 10μM与AGS细胞巨噬细胞cocultured治疗。每个酒吧代表均值±SD的三个独立的实验。 < 0.05; < 0.01; < 0.001; < 0.0001。
表3
UMB影响白细胞介素- 10”和interleukin-12浓度在媒体cocultured (pg / ml)。

4所示。讨论

的抗肿瘤特性UMB一直在研究各种类型的癌细胞。在目前的实验中,MTT测试表明,该集成电路50值75.79 THP-1和AGS细胞系µ米(CI 95%;61.49 - 93.42)和48.41µ米(CI 95%;33.02到70.97),分别显示了UMB THP-1细胞的毒性较低。

因为没有足够的信息对无毒浓度的UMB, THP-1细胞治疗在AGS IC5浓度的UMB评估其对癌细胞的抑制影响通过免疫系统的调制。结果显示增加M1 / M2巨噬细胞比率在THP-1分化,有利于消除癌细胞的免疫系统。确保如果UMB IC5浓度改变肿瘤细胞的凋亡或坏死指数,衡量膜联蛋白V /π,没有任何明显的膜联蛋白V /π指数的变化。UMB-induced巨噬细胞功能变化与对照组相比,通过测量il - 10, IL12,一氧化氮含量的培养基。

胃腺癌被认为是高度侵略性的癌症。预计不到30%的患者存活5年(15]。癌症预后差(16,不幸的是,大多数情况下是在晚期诊断(1]。低生存是由于肿瘤浸润和转移的高17]。各种研究表明,UMB与香豆素化合物结构,对GL26 anticancerous属性(神经母细胞瘤),A172(胶质母细胞瘤),MCF-7和4 t1(乳腺导管癌),CT26和HT29(结直肠腺癌)12),A549肺腺癌,SK-MEL-28(恶性黑色素瘤),CH1(淋巴瘤),M4beu(转移性色素恶性黑色素瘤)18),海拉(宫颈腺癌)、K562(慢性粒细胞性白血病),和AGS细胞(胃腺癌)(19]。以前的研究已经表明UMB抑制胃肿瘤的生长和迁移通过抑制MMP2和MMP9。它还减少Wnt信号通路蛋白,包括Wnt-2,生存素,β连环蛋白,GSK-3β,p-GSK-3β和原癌基因10]。

这项研究的目的是考虑到M1和M2巨噬细胞之间的差异在抗肿瘤免疫反应20.]。用不同浓度的治疗UMB (0.5 -518µ米)每隔24小时显示低毒性THP-1细胞( = 75.79, = 23.26)相比AGS细胞( = 48.41, = 11.2)。因此AGS集成电路5(∼10μ米)被选为研究UMB THP-1细胞的增殖的影响及其后果。

为了确保UMB没有任何显著的毒性作用在IC5浓度、膜联蛋白V / PI染色是香水。没有观察到显著变化的膜联蛋白V /π在AGS细胞cocultured M0、M1和M2的细胞在任何阶段扩散后UMB治疗。

M1-like巨噬细胞抗原的特点是高演讲能力,促炎、杀菌剂的,杀肿瘤的性质。他们的一些功能是由于分泌活性氧(ROS), il - 6, IL12 IL-23, TNF -α(21]。M2-like巨噬细胞在抗炎功能,组织修复和重建,寄生虫间隙,肿瘤促进和免疫调节过程。他们支持癌细胞通过adrenomedullin进行血管生成和分泌血管上皮生长因子(vegf),而它的免疫抑制功能是介导的il - 10的表达,PD-L1(编程death-ligand 1),和TGFβ(22]。

肿瘤微环境(时差)改变巨噬细胞极化主要M2-like类型通过产生各种细胞因子、生长因子和其他分子(7),导致耐药性和放射防护效果和随后的治疗失败(23]。它也放大肿瘤侵犯通过入侵,进展和转移24]。更高密度的tam已观察到更高级的胃癌肿瘤阶段(25]。

先前的研究已经提到的生物相关性癌症预后的M1 / M2比例而不是总tam巨噬细胞(M1 + M2)。更高比例的癌症预后M1 / M2肿瘤与有利的生存结果,反之亦然(26- - - - - -28]。我们的结果显示一个轻微减少巨噬细胞UMB所致。然而,UMB THP-1扩散的影响分析表明,M1 / M2比的影响超过了M1 / M0和M2 / M0比率,这意味着一个更好的癌症的预后。

评估肿瘤细胞对巨噬细胞的增殖的影响,AGS细胞与THP-1 cocultured细胞。UMB同时添加的THP-1扩散阶段,包括PMA,有限合伙人+干扰素-γ、IL4 +使用IL13或coculture阶段。UMB添加在PMA-induced M0分化阶段,极化阶段(有限合伙人+干扰素-γ或IL4 +使用IL13)和偏振M1和M2 cocultured AGS细胞。图6表明UMB增加了M1 / M2比和最大比在第一阶段,PMA,和最低比率在最后阶段,cocultured。

一氧化氮中起关键作用的发展和抑制肿瘤发生。性能和结果不相关的浓度和来源。在低到中等水平不得激活血管生成,因此积极的表型,更高的水平,这可能是源于M1巨噬细胞,可能有抗肿瘤效应(29日]。

巨噬细胞代谢通路精氨酸是一种关键的促进或抑制癌细胞。精氨酸的代谢鸟氨酸和尿素M2巨噬细胞激活和鸟氨酸可用于细胞修复过程。另一方面,没有生产在M1激活巨噬细胞诱导合酶诱导(间接宾语)。这个细胞毒性代谢物对M1的杀伤力巨噬细胞(30.]。先前的研究在spleen-separated单核细胞与LPS刺激表示伊诺和一氧化氮产量下降时处理超过10µM UMB [31日]。然而,没有显著的影响在生产被认为在这个浓度RAW264.7细胞在另一项研究[32]。在目前的研究中,治疗M0巨噬细胞cocultured AGS细胞在10μM UMB显示下降在M2没有生产无显著差异。然而,M1 cocultured巨噬细胞显示没有产量的增加,这可能是因为增加M1的出现。

细胞因子参与调节免疫反应。白介素称为促炎细胞因子,它充当一个先天和适应性免疫系统之间的联系,诱导干扰素的生产γ和偏振天真的CD4 T细胞Th1 (33]。相反,il - 10是一种抗炎细胞因子,限制过度的炎症和CD8 T细胞成熟过程中起着重要的作用。事实上,il - 10、il - 12平衡免疫系统对肿瘤和自身免疫性条件反应得罪对方(34]。

治疗M1和M2 cocultured巨噬细胞与10µM UMB显示而显著增加的il - 12在M1 cocultured介质,这是减少M2 cocultured介质;然而,il - 10含量显著减少M1和M2 cocultured媒体。因此,UMB诱导巨噬细胞极化转移到M1亚型和增加抗肿瘤功能导致我们的发现在这个研究。

尽管一些研究,umbelliprenin对癌症和免疫系统的影响仍然是未知的,需要进一步的研究。作者建议调查的影响umbelliprenin macrophage-cancer细胞直接coculture是否有不同的治疗在直接接触肿瘤细胞巨噬细胞的功能。

5。结论

,总之,我们的数据表明,umbelliprenin对单核细胞的细胞毒性低于AGS细胞,促进巨噬细胞的极化M1杀手类型而不是M2的支持类型,增加了M1 / M2比,因此在对抗胃腺癌增强免疫系统功能。此外,UMB影响一氧化氮和M1巨噬细胞il - 12的分泌。因此,似乎UMB支持M1巨噬细胞和变弱M2巨噬细胞功能;因此,它可能是一个不错的候选人为新辅助治疗的代理。然而,需要进一步的调查。

数据可用性

使用的实验数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

信息披露

本文从一个博士论文写的穆罕默德塔巴拉米Shahid Beheshti医学医学院(登记号:7)。

的利益冲突

本文从一个博士论文写的穆罕默德塔巴拉米Shahid Beheshti医学医学院(登记号:7)。

作者的贡献

MTB SAZ负责实际和技术研究阶段;快艇,SAZ先生负责收购数据;MTB和SAZ负责数据的分析和解释;MTB负责起草的手稿;快艇,SAZ先生参加了起草的手稿和修改它至关重要的逻辑内容;SAZ和MHMH负责这项研究的概念和设计。作者同意负责所有方面的相关工作,确保问题的质量和信誉的任何部分工作充分调查和解决。

确认

这项研究由Shahid Beheshti医疗批准号24833年。