文摘

类风湿性关节炎(RA)是一种障碍引发的自体免疫反应和相关的慢性炎症和严重残疾。骨骨髓来源间充质干细胞(BM-MSCs)展示了一个充满希望的免疫调节效应对软骨修复和恢复关节功能。此外,消炎痛(IMC),非甾体类化合物,被认为是一种有效的治疗剂显示出显著的解热属性和镇痛效果。目前研究的目标是评估的抗关节炎的疗效BM-MSCs (10⁶细胞/鼠1、6、12和18天)和IMC(2毫克/公斤体重/天3周)单独或同时服用对完全弗氏adjuvant-induced关节炎大鼠。爪子体积的变化,体重,病变,总值和抗氧化防御系统,以及氧化应激、评估。Th1细胞因子(il - 1β)的血清水平和Th2细胞因子(il - 4)和Nrf-2踝关节表达检测。与正常大鼠相比,这是发现CFA-induced关节炎大鼠白细胞增多,增加在爪子方面表现出显著的体积,法律外包水平,射频,il - 1β血清水平。并行,关节炎大鼠接受BM-MSCs和/或IMC有效表现出减少爪子水肿、白细胞增多,和增强抗氧化剂酶SOD、GPx,销售税,血清中谷胱甘肽除了upregulation Nrf-2和抗炎表达il - 4水平的脚踝关节关节。同样,这些分析组织病理学部分和组织学评分更证明了这一点。BM-MSC数据还显示,合并后的管理和IMC更有效的抑制炎症,增强抗炎通路比单独每个代理。因此,可以得出结论,结合疗法和BM-MSC IMC后可以作为一种很有前途的治疗选择评估人类患风湿性关节炎的疗效和安全性,通过调节和抗关节炎的影响可能是介导对Th1 / Th2细胞因子的影响,ozidative压力,Nrf-2。

1。介绍

类风湿性关节炎(RA)是一种主要的炎性疾病,是伴随着复发和不懈的关节炎症和滑膜炎,肿胀,自身抗体生产、骨功能障碍,和软骨退化(1]。RA是伴随着系统性和额外extraarticular一些器官的并发症包括肺和心脏。这样的系统性表现降低生活质量,负责残疾,早期死亡率,和社会经济成本(2]。风湿性关节炎的患病率在老年人更常见;大约有130万成年人患有风湿性关节炎据国家卫生研究院(3]。可能,1%以上在世界各地建立了与RA (4]。到目前为止,RA的发病机制是未知的;等病因引起有关的基因,以及环境因素,传染性病原体,热休克蛋白和性激素。尽管如此,这些原因,本身不足以解释病因(5]。在其他模型中,关节炎诱导啮齿动物通过注射完全弗氏佐剂(CFA)股票的大部分疾病与人类相似;因此,这使它最合适的模型诱导关节炎,并建议研究和测试各种治疗药物对类风湿性关节炎(6- - - - - -8]。目前还没有最优治疗RA除了系统性免疫抑制剂。使用最广泛的药物,如非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药)除了生物制剂(如抗肿瘤坏死-抗体)有助于缓解症状,但是严重的不良反应与扩展有关这些药物的使用。此外,这些药物是昂贵的,并不是所有的病人都反应到他们(9]。

因为这些限制,需要其他治疗方法已经出现,试图开发一种处理剂,与那些传统药物一样有效,但没有严重的副作用。这些最近尝试的方法之一是使用间充质干细胞(msc)。骨骨髓来源msc (BM-MSCs) nonhematopoietic multipotential祖细胞有积极影响宿主组织的重建和集成。他们能够区分成不同的间质组织,包括骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞,因此修复软骨和骨骼同时[10]。此外,BM-MSCs调节免疫细胞反应等自然杀手(NK),抗原呈递细胞,T淋巴细胞和B淋巴细胞(11,12]。BM-MSCs,因此,具有相当重要的炎症性自身免疫性疾病的诊断和识别。在骨关节炎,例如,正常BM-MSCs可以帮助恢复受损的软骨和最小化low-grade-related滑膜炎症最近被人类临床试验验证(13]。这种优势介绍它们作为小说的治疗选择和长期RA治疗的一个有前途的工具。

此外,消炎痛(IMC), l - (p-chlorobenzoyl) 5-methoxy-2 methylindol-3-acetic酸)是一种广泛使用的非甾体抗炎药在炎症和疼痛管理。它成立于1963年,是一个强大的代理在治疗许多炎症性疾病包括骨关节炎、强直性脊柱炎、痛风、急性肌肉骨骼疾病,退行性关节疾病、风湿性关节炎。IMC有著名的镇痛、抗炎和解热的属性通过抑制环氧酶的活性,从而抑制炎症介质的合成(14]。然而,治疗效果的IMC减少炎症和水肿是聪明的,而延长使用这些非甾体抗炎药可能导致严重的副作用,包括胃肠道损害和心血管毒性。因此,配置新的计量方法和减少非甾体抗炎药的副作用成为越来越重要的15]。因此,在我们的研究中,我们实施IMC在低剂量(0.2毫克/公斤体重(合著))日复一日地调整和控制这个限制。

电导与先前的文献,本研究旨在评估组合抗关节炎的功效BM-MSCs IMC,相比,每个单独的补充在Wistar鼠CFA-induced关节炎。这项研究还试图仔细观察il - 1的作用β(Th1细胞因子)、il - 4 (Th2细胞因子),氧化应激,抗氧化防御系统,和Nrf-2抗关节炎的影响。

2。材料和方法

2.1。动物

最近的实验是在2018年10月至2019年10月期间在埃及,Beni-Suef大学理学院。它包括50 Wistar鼠的男性性别(重量120 - 150克;10 - 12周大)。老鼠从埃及买来组织生物制品和疫苗(VACSERA),以往站,埃及开罗。前两周的动物被监督实验的开始排除任何并发感染。老鼠被安置在校准的笼子里的聚丙烯和保持在控制环境湿度(55±5%);同时,室温(22±2°C),和12小时光照,12小时黑暗周期。动物饮用水和美联储喂食老鼠饲料饮食随意。当前研究中使用的实验动物治疗按照加拿大委员会的原则和指导方针的动物保健和实验动物伦理区域委员会,理学院,Beni-Suef大学埃及,批准了实验工作。所有试图研究中苦苦挣扎的动物的数量降到最低。

2.2。诱导的关节炎

关节炎感应,动物被皮下注射接种的0.1毫升/鼠CFA的解决方案(σ化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)到正确的后爪的拦路贼被Snekhalatha et al。16)剂量的1毫克/公斤·合著。更广泛严重的关节炎,助推器剂量(0.1毫升)的乳液在第二天进行。

2.3。动物分组

实验设计包含五个小组,每个组成的十大鼠和描述为:组1(正常):它由健康的老鼠喂食相当于卷羧甲基纤维素(CMC)每日口服3周和杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)静脉注射1^圣6^th,12^th,18^th天。组2 (CFA):它由CFA-induced关节炎,口头上给了老鼠和等效体积CMC每日口服3周和DMEM静脉注射1^圣6^th,12^th,18^th天。组3 (CFA + BM-MSCs):这组由CFA-induced关节炎大鼠接受四个剂量的BM-MSCs (1×10⁶细胞/鼠/剂量)通过横向每鼠尾静脉(静脉注射17]。每剂悬浮在0.2毫升DMEM(杜尔贝科的修改鹰介质)。剂量是1^圣6^th,12^th,18^th天后CFA注入。组4 (CFA + IMC):这组由CFA-induced关节炎大鼠补充与IMC每日口服剂量的2毫克/公斤体重(合著)。IMC被溶解在刚做好的前政府5毫升的1% CMC三个星期。IMC收购从σ化学公司(σ化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)。组5(友邦保险+ BM-MSCs + IMC):这组由CFA-induced关节炎大鼠,同时补充BM-MSCs和IMC集团3和4中描述。

2.4。隔离和BM-MSCs文化

在当前的研究中,我们的方法隔离,BM-MSCs文化一样,是基于Chaudhary和早期的程序18和我们之前的2020年出版19]。

2.5。关节炎严重性评估(由爪子水肿)

关节炎发展的监测,爪爪水肿体积测量作为一个指针和肿胀率。测量了在不同时期在第七天,14日由CFA和21关节炎感应后,天0是第一个CFA注入。后爪体积计算根据水替代方法减去水量的不同应用之前和之后的爪子包含特定的校准气缸等渗盐水的体积。水肿或肿胀CFA老鼠相比nonarthritic正常组,而arthritic-treated老鼠相比,CFA组。老鼠被乙醚吸入麻醉前测量。

2.6。组织病理学研究

在研究结束时,在诱导关节炎后21天,老鼠被牺牲和右后腿的4大鼠踝关节每组分离并放置48小时在缓冲福尔马林10%。使用10%甲酸脱钙骨进行。这个解决方案是改变了两周,每周两次,和脱钙作用过程的身体被认为是用手术刀片。当脱钙作用完成,PBS的标本冲走,然后用一系列梯度乙醇脱水,嵌入在蜡块石蜡制成的。最后,5µ米厚度矢状部分准备然后用苏木精和伊红染色(H & E)。

组织学检查是盲目地由一个病理学家包括滑膜炎症、软骨和骨破坏。部分依法分级系统所描述的桑丘et al。20.]因为炎症(单核细胞浸润),滑膜肥厚(血管翳形成),以及侵蚀骨骼,软骨的破坏。0-3-point用于每个参数的范围(0级被认为是正常的,1级被认为是轻微的炎症,二年级是中度炎症,严重的炎症和三年级),和12是最大可能的得分。

2.7。通过rt - pcr检测il - 4的

信使rna表达的il - 4水平关系到管家基因β肌动蛋白(β肌动蛋白)确定使用半定量逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr)。

2.7.1。核糖核酸(RNA)隔离

RNA提取完全从3踝关节的三个不同的老鼠在每组使用热科学GeneJET RNA提取设备购买的热水瓶费舍尔科学Inc .,罗切斯特,纽约,美国根据制造商的指示。在液态氮,样本均质和细胞溶解在含有硫氰酸胍裂解缓冲溶液,离液序列高的盐保护从内源性RNA RNA。获得的溶解产物与酒精混合,然后装上一个净化列。离液序列高的盐和酒精使RNA结合二氧化硅膜的溶解产物通过列旋转。杂质随后被删除从膜通过洗柱清洗缓冲溶液。然后,纯粹的RNA与nuclease-free低离子强度条件下筛选了水。同时,净化RNA的数量是量化使用紫外分光光度计按照下列公式:RNAμ克/μ介绍过o。d。邓肯l =260海里X(40μg RNA / 1000 /毫升)×稀释因素。确保高纯度的孤立的RNA,我们检查了纯洁的RNA,应该介于1.8和2.0之间。最后,0.5μ克净化RNA用于生产互补脱氧核糖核酸(互补)保持在−20°C,信使RNA的进一步分析。

2.7.2。逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr)分析

互补脱氧核糖核酸是由逆转录和放大通过使用热科学反面互译rt - pcr Reddy混合设备获得热科学公司,罗切斯特,纽约,美国。最终的反应体积是50μl。包括2的混合反应X互译PCR Reddy混合(25μl),反面酶混合(1μRT增强器(2.5 l)μl),底漆(10μ米)(1μl)、反义底漆(10μ米)(1μ(17.5 l), nuclease-free水μRNA (2 l)和模板μl)。PCR反应的管子是位于double-heated热循环,并发生一系列的反应包括封底失活在95°C 2分钟后跟35周期初始变性在95°C,持续20秒,然后在50 - 60°C,持续30秒,在72°C 1分钟,最后,其次是在72°C 1循环5分钟。之后,我们分开PCR产品在琼脂糖凝胶电泳(1.5%),和cDNA乐队观察使用紫外线透照器在一个黑暗的房间。通过扫描微凝胶图像进行了调查和分析(凝胶Doc。先进的版本3.0)。il - 4 mRNA的引物序列如下:转发:5′GGAACACCACGGAGAACG3′和反向:5′GCACGGAGGTACATCACG3′。的引物序列β肌动蛋白mRNA如下:转发:5′TCACCCTGAAGTACCCCATGGAG3′和反向:5′TTGGCCTTGGGGTTCAGGGGG3′。在这个实验中使用的引物都是合成了Sangon生物科技(上海)21]。

2.8。血液参数和血液中细胞因子分析

年底实验(21天),老鼠在轻度麻醉乙醚和血液经颈静脉。血液收集管的一部分含乙二胺四乙酸(EDTA)解决方案(50µL 15% EDTA 2.5毫升的血液)总和微分白细胞计数。白细胞总数(TLC)计算通过结晶溶液稀释样本在纽鲍尔hemaocytometer幻灯片加载计算,而微分白细胞计数(DLC)准备使用吉姆沙染色剂(9]。

尽管如此,其他剩余的血液收集直接在管道没有抗凝和离心机15分钟在3000 rpm。明确nonhemolyzed上层清液或血清不同的样品很快被删除并保持在−30°C。测定血清射频和1 l - 1β在正常执行和关节炎的控制水平,以及arthritic-treated老鼠,使用特定的酶联免疫吸附试验(ELISA)。包被购买的R & D系统(R & D系统,Inc .,明尼阿波利斯,锰、美国)按照标准程序。

2.9。氧化应激和抗氧化系统

丙二醛(MDA)水平作为指标的脂质过氧化物(法律流程外包)水平的组织22]。此外,谷胱甘肽(GSH)含量测定血清中的根据布鲁斯等的方法。23]。此外,抗氧化酶包括谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD), glutathione-S-transferase(销售税)血清中的活动评估基于以前的出版物报道的方法(24- - - - - -26]。

2.10。免疫印迹分析

免疫印迹技术被用来确定Nrf-2蛋白质的数量。简而言之,蛋白质提取从3右后腿的踝关节每组三只老鼠用冰冷的radioimmunoprecipitation化验(里帕)缓冲区(Beyotime生物技术、中国)含0.1% phenylmethylsulfonyl氟化物。蛋白质含量(30μg) /使用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)。接下来,蛋白质的凝胶被转移到膜上加载聚偏二氟乙烯(PVDF)。然后,一夜之间,细胞膜是探索在4°C Nrf-2-specific主要抗体(猫。不。68817;热费希尔科学)。洗后与tris-buffered盐水渐变20 (TBST)三次,这些墨迹准备孵化与辣根peroxidase-conjugated二级抗体(1:5000,圣克鲁斯生物技术,CA)在室温25°C 30分钟。这些墨迹又洗了,然后,化学发光信号的可视化与x射线胶片(27]。

2.11。统计分析

进行了统计研究社会科学版的包统计22 (SPSS,芝加哥,IL)统计程序。比较在不同组的均值进行了根据单向方差分析(方差分析)其次是图基postmultiple比较测试。值表示为均值的平均值±标准误差(平均±SE)。< 0.05被认为一个具有统计学意义的结果。

3所示。结果

3.1。爪子卷上治疗效果

开发的所有关节炎组大鼠关节炎后CFA归纳。CFA-induced关节炎大鼠表现出显著(< 0.05)增加爪子卷(水肿)维持21天与正常组相比(图1)。相反,在实验的最后,BM-MSCs -和/或IMC-treated关节炎大鼠明显减少了爪子水肿抑制百分比为36.97,40.20和57.98%,分别比CFA-induced关节炎组(图1)。

3.2。治疗对严重病变的爪子和脚踝关节

水肿和发红的后爪和踝关节充当外部措施确定关节炎炎症的严重程度模型。CFA-induced关节炎对照组显示逐渐减少他们两人后BM-MSCs和/或IMC治疗(图2)。

3.3。组织病理学变化和关节炎的分数

3.3.1。组织病理学变化

苏木精和伊红(H & E)彩色部分的右后腿踝关节从正常控制老鼠没有炎症。相比之下,CFA-induced关节炎大鼠表现出显著的组织病理学改变的形式增生的滑膜大量炎性细胞浸润,血管翳形成严重,和广泛的软骨破坏。另一方面,CFA-induced关节炎大鼠治疗IMC显示那么严重关节炎病理与适度的炎症,而老鼠BM-MSCs处理和并发管理集团(BM-MSCs加上IMC)显示轻微程度的关节炎(图3)。

显微镜下,CFA-induced关节炎大鼠显示滑膜炎表现为滑膜增生,安排在2 - 3细胞衬里层除了扩散下血管的血液与血管周围水肿和单核细胞的扩散渗透。在许多样品,炎症细胞的渗出液扩散到涉及整个periarticular软组织的结缔组织和肌肉。在一些地区有超然的滑膜和轻度增生性病变的纤维母细胞。同时,血管翳发展形式的一个或多个包含炎症细胞增生肉芽组织和增生的滑膜炎在关节软骨边界和cartilage-bone级别。许多关节炎大鼠的关节软骨不规则的关节面并显示表面的纤维性颤动之后,细胞死亡或扩散,而在某些情况下,扩散到关节软骨的温和的组成部分。此外,破骨细胞活动和纤维素增生可视化联合骨损伤。相比之下,关节炎大鼠BM-MSCs处理,以及并发管理组BM-MSCs + IMC,显示上述组织病理学关节炎病变,但有轻度度,而关节炎大鼠治疗IMC显示中等程度的病变(图3)。

3.3.2。关节炎的病理评分

组织病理分析包括滑膜炎(滑膜增生),血管翳形成,软骨破坏和骨侵蚀被蒙蔽了观察者规模0 - 3 H & E-stained部分。目前的数据显示,arthritic-treated老鼠明显表现出减少总组织病理学评分相比在关节炎的控制;BM-MSCs + IMC的治疗是最有效的(图4)。在细节中,所有治疗滑膜炎明显减少,血管翳形成,降低和减少软骨退化相比CFA老鼠。然而,在治疗大鼠骨侵蚀显示一个无意义的变化(> 0.05)相比,CFA动物组(图4)。

对于每一个分数,意味着,不同的符号,是明显不同的< 0.05。

3.4。评估和微分白细胞(TLC和DLC)总数

TLC显著(< 0.05)增加CFA-induced关节炎组改变比例的212.07%相比,正常对照组。然而,CFA-induced关节炎大鼠补充BM-MSCs和/或IMC显示白细胞增多明显下降的接近正常水平,和BM-MSCs + IMC-treated组是最有效的克服白细胞总数(图的标高5)。此外,白细胞分化显示淋巴细胞明显升高,以及中性粒细胞计数CFA-rats两倍比正常老鼠。然而,BM-MSCs单独或BM-MSCs加上IMC关节炎大鼠显著提高白细胞的计数(淋巴细胞、中性粒细胞和其他人)附近的正常范围,而IMC补充独自拒绝淋巴细胞,中性粒细胞,嗜酸性粒细胞计数明显和不明显影响单核细胞和嗜碱数量相比,CFA-indued关节炎组(表1)。BM-MSCs + IMC的治疗是最有效的减少淋巴细胞和中性粒细胞计数升高。

意味着,不同的符号,是明显不同的< 0.05。

3.5。影响法律流程外包和抗氧化状态

表2显示BM-MSCs和/或IMC治疗的效果在氧化应激和抗氧化防御系统标记CFA-induced关节炎大鼠的血清样本。

MDA水平(989.52%)会增加十倍CFA-induced大鼠与正常大鼠相比。另一方面,与BM-MSCs关节炎大鼠的治疗和/或IMC治疗降低(< 0.05)的法律流程外包所有治疗组的血压水平显著升高变化百分比−72.99%,−61.06%,BM-MSCs−46.37% + IMC - BM-MSCs孤单,和IMC alone-treated组,分别。因此,BM-MSCs + IMC紧随其后BM-MSCs似乎更有效改善关节炎动物的法律流程外包水平。

管理的CFA Wistar鼠显著(< 0.01),降低血清谷胱甘肽含量(−19.75%)。同时与IMC CFA-induced关节炎大鼠的治疗并不显著(> 0.05)影响谷胱甘肽水平(6.18%),治疗与BM-MSCs单独或结合IMC产生显著(< 0.05)增加谷胱甘肽水平降低。BM-MSCs的组合效应是最有效的提高谷胱甘肽的水平。

抗氧化酶的活动包括SOD、GPx和销售税活动表现出显著降低CFA-induced关节炎大鼠;记录的百分比变化−54.19%,−58%,和−34.71%,分别比正常的动物。

SOD活性显著增加(< 0.01)在CFA-induced关节炎大鼠治疗BM-MSCs + IMC(112.68%),而不显著(> 0.05)减少由于治疗与BM-MSCs(49.30%)或IMC (64.79%)。

GPx活性表现出显著增加(< 0.01)与BM-MSCs CFA-induced关节炎大鼠治疗,IMC,和BM-MSCs + IMC记录百分比下降为69.00,66.00和121.00%,分别比CFA-induced关节炎的控制。

的降低血清中GST活性CFA-induced关节炎大鼠显示由于BM-MSCs治疗增加,IMC, BM-MSCs + IMC。但是,由于治疗效果是很有意义的只有BM-MSCs和IMC的结合。

总的来说,BM-MSCs + IMC是最有效的抑制法律流程外包水平和提高抗氧化防御系统。

3.6。治疗对il - 1的影响β和RF表达水平

il - 1β在血清和射频浓度估计使用一个标准的ELISA和代表人物6和7。CFA-induced关节炎大鼠有显著(< 0.05)il - 1升高β和射频级记录变化的289.67%和419.74%,分别比正常对照组。另一方面,政府的msc和/或IMC导致显著的减少il - 1β和射频的水平。并发管理是最有效的药物比BM-MSC IMC il - 1β和射频的浓度水平。

3.7。评价il - 4的蛋白质表达水平和蛋白质的Nrf-2脚踝关节

il - 4 mRNA表达确定关节踝关节的PCR在图表示8。数据(差别表现出显著的对这些< 0.05)il - 4水平的CFA动物(−33%)与正常相比。否则,关节炎大鼠il - 4水平管理与BM-MSCS + IMC, BM-MSCS孤独,独自和IMC显著调节58的百分比变化记录,100年,和108%,分别与关节炎相比控制老鼠。

Nrf-2蛋白水平在踝关节的免疫印迹技术显示显著下降(−63%)CFA-induced关节炎大鼠与正常大鼠相比,而BM-MSCS + IMC的补充,BM-MSCS孤独,独自和IMC明显缓解Nrf-2水平的这些组的百分比增加249,127年,和149%,分别与关节炎相比控制老鼠(图9)。

4所示。讨论

类风湿性关节炎是一种自身免疫性炎症综合征引起滑膜增生,逐渐侵蚀骨骼,关节软骨的破坏。疾病影响生活质量和有显著影响的社会和经济成本和被认为是导致过早死亡的一个重要原因(28,29日]。如今,用干细胞治疗被认为是最有前途的一个近似的未来迹象。这种形式的治疗可以提高甚至扭转某些退行性疾病和可能应用在替代和再生医学19,30.]。msc是一位卓越的骨头和软骨组织修复和有效的工具,因为他们可以分化成几个结缔组织包括脂肪、软骨和骨。此外,他们有免疫调节和抗炎作用,自我更新能力,阻止维护和可塑性紧密相联的,异种器官移植应用程序(31日]。此外,IMC治疗RA的使用已经吸引了许多研究者由于镇痛,抗炎,治疗风湿病的影响炎症性疾病。这指示我们评估的有用性的结合BM-MSCs + IMC代理CFA-induced关节炎作为方便、简单,可复制的模型实验的持续时间较短。

严重爪肿胀(水肿),滑膜增生,中性粒细胞,积累和骨,软骨,损害CFA-induced关节炎模型的显著特点(32]。在这里,正确的后爪体积估计每周,和CFA-induced关节炎大鼠表现出增加动物爪与正常相比体积和肿胀。目前的数据显示,与BM-MSCs关节炎大鼠的补充和/或IMC单独或联合成功后爪体积减少了实验的最后与关节炎大鼠;因此,测试人员有效地抑制炎症组织内部。同样,先前出版的研究(33)表明,治疗IMC减少注入的爪子和侧爪子水肿35%和30%,分别。这样的宏观调查进一步阐明通过显微镜检查的爪子部分和组织学得分。组织病理学,CFA-arthritic控制组的老鼠表现出严重的炎症阶段描述为入侵白细胞,滑膜增生,软骨退化,骨吸收。相反,动物辅以IMC大大缓解这些病变的关节损伤并显示适度的阶段。此外,BM-MSCs-treated关节炎组和BM-MSCs + IMC-treated关节炎组提供一个重要的保护这些改变,表现出轻微的阶段的病变,正常关节空间,减少白细胞的浸润,和一个完整的软骨被检测到。这样的观察更阐明的组织学得分表现出显著减少的总分治疗在这个顺序:BM-MSCs + IMC > BM-MSCs > IMC相比CFA-induced关节炎大鼠的控制。特别是BM-MSCs + IMC治疗滑膜炎明显下降,抑制血管翳形成,和减少退化软骨的控制关节炎大鼠相比,虽然骨吸收没有明显改变。因此,显然这些发现证明效力测试代理的内部组织和抑制炎症反应说明了抑制炎症反应和爪肿胀引起的关节炎。

同样,体重的变化是一个有价值的指数来评估疾病过程和响应下一种抗炎药物的研究。在目前的研究中,经过两个星期的辅助注入,CFA-induced关节炎大鼠显示可见的损失相比,体重正常的动物。这一发现与Da Silva在协议et al。33老鼠)报道,辅助管理了一个庞大的身体注入后8天减肥与健康对照组相比。这可能归因于食欲不振和重量损失由于CFA注入和扩张的关节炎为研究Da Silva et al。33]。BM-MSCs老鼠的另一方面,补充和/或IMC治疗单独或同时导致显著降低减肥方面的关节炎组。BM-MSCs + IMC比IMC更有效率(44.53%)(36.97%)和BM-MSCs (34.45%)。研究的结果完全是由恐鸟Ghaffary和阿布34)报告的平均体重显著减少风湿性关节炎大鼠与正常相比控制老鼠但减肥的程度明显限制在RA老鼠收到咖啡因脉冲msc和unpulsed msc治疗,相比vehicle-treated RA动物。同时,Da Silva et al。33)表示,IMC-treated关节炎大鼠的体重高于治疗关节炎的老鼠,但仍低于正常大鼠。整体宏观检查,如抑制爪子体积和减轻体重,以及微观结果,提出保护和抗炎作用的第一个迹象BM-MSC和/或IMC治疗作为RA的治疗靶点。

在同一条线上,白细胞通过炎症网站针对趋化现象的刺激,导致组织肿胀和水肿,从而发挥重要作用在急性和慢性炎症性疾病的发病机理35]。与薄层色谱以及DLC,我们的数据显示,友邦保险的动物表现出切断与伴随增加的淋巴细胞,白细胞增多以及中性粒细胞比较正常的动物。这些结果符合Pinal et al。36)建立标记白细胞增多后21天在大鼠关节炎感应和法语等的研究。37)探讨白细胞增多数量和比例较高的中性粒细胞和淋巴细胞adjuvant-induced对正常大鼠。肩并肩,Pinal et al。36)告知,白细胞增多和嗜中性检测由于CFA注入。这样的白细胞的波动很可能由于关节炎炎症过程存在涉及微脉管系统的开窗法、元素泄漏到间隙空间,白细胞的转移到发炎组织(38]。在这项研究中,我们的数据显示,这些变化是附近回到正常水平相比,在动物身上测试药物治疗关节炎大鼠。BM-MSCs + IMC和BM-MSCs老鼠有效逆转他们缓解计数正常范围而IMC显著提高中性粒细胞、淋巴细胞,和esinophils但单核细胞减少,以及嗜碱粒细胞,略与正常组相比。这些结果推荐潜在的抗炎和抗风湿效果对疾病的发展和进步。

RA发病机制,这些问题也不能忽视的另一个因素是氧化应激。前的研究华立和Cheeseman [39和阿里et al。40说明积累的巨噬细胞和粒细胞炎症地区促进活性氧簇(ROS)的形成和自由基物种(FR),如过氧化物(O⁻²)和过氧化氢自由基(H₂O₂)。活性氧化剂在许多隔间细胞内形成,通常从内部代谢或由于外部接触有毒或病态的侮辱41,42]。在正常情况下,ROS产生限制,和一些有用的目的作为重要的监管机构等生理和病理生理学的结果(43]。他们正在开发的生理指标来控制反应过程,如细胞的分裂,自我吞噬,压力,免疫功能反应,炎症作为重要的信号分子(42]。相反,不受控制的氧化剂生产导致氧化应激也会损害细胞功能和导致癌症、慢性病、毒性发展(44,45]。毫不奇怪,氧化应激的作用或关节炎ROS作为中介在软骨破坏和组织损伤的发病机制。一个共同特征,定义了氧化应激在大鼠脂质过氧化作用或法律流程外包生产。MDA是一个prooxidant组件和用于确定法律流程外包。产生ROS / RNS通常是稳定的内源性抗氧化剂包括SOD、谷胱甘肽,GPx和销售税。第一行的抗氧化剂,谷胱甘肽和SOD,催化地清除自由基(O₂⁻和H₂O₂)。SOD转换啊₂⁻到H₂O₂和广泛应用在O的毒性作用₂⁻保护细胞损伤。内源性抗氧化剂GPx减少了H₂O₂形成氧化谷胱甘肽和水的谷胱甘肽(39]。不平衡在这个过程加剧了细胞反应导致细胞功能障碍和过度病理情况下包括骨头和软骨退化(46,47]。此外,CFA注入大鼠诱发大量释放活性氧和FR的炎症48]。我们发现这些研究提供良好的支持,因为我们观察到显著增加的MDA水平显著减少谷胱甘肽的抗氧化水平的同时,GPx,销售税,SOD在关节炎控制动物的血清样本与正常相比动物。海拔MDA水平可能是由于极端积累血液中的白细胞和发炎的地区提高法律事务外包生产速度,抑制抗氧化保护系统。这些观察结果也符合我们的组织学分析显示损坏的组织和强烈的免疫细胞浸润。

对于治疗组,补充BM-MSCs和/或IMC通过抑制氧化损伤明显降低法律外包水平在所有治疗的动物。这是完全赞同的案例研究Nejad-Moghaddam et al。49)治疗肺的主题之前暴露于硫芥子气利用msc和报道,有利结果归因于msc的抗氧化性能,这是证明的法律流程外包水平降低痰。此外,BM-MSCs和/或IMC的抗氧化防御机制主要是通过实现了治疗的抗氧化应激激活的酶GPx起到了至关重要的作用在减少氧化应激的消除H₂O₂用作细胞死亡诱导氧化刺激。这一发现是在符合张等的研究。50)表明,MSC治疗调节GPx表达式在小肠缺血/再灌注(I / R)损伤、感染性肺损伤,严重的急性胰腺炎,弗里德希氏共济失调。

此外,避免和Nurgali [51和金等。52)透露,MSC还可以促进成纤维细胞在氧化刺激GPx活性。此外,黄等。53]证明了IMC药物高效提高GPx活性的AIA动物模型。然而,SOD以及消费税活动略有增加,但没有显著的改善GPx酶抗氧化过程。在当前的研究中,得出BM-MSCs + IMC比BM-MSCs或IMC是最有效的提高抗氧化防御系统的费用在组织氧化应激,从而抑制随后的炎症过程。

此外,体内氧化损伤的另一个指标是核红色的两个相关因素(Nrf-2)蛋白在踝关节在当前的研究中发现关节组织。前数据明显显示出明显的改善氧化应激生物标志物,以及测试药物的能力清除FR和中和活性氧。Nrf-2细胞回复的主要监管机构反对环境障碍,并可能Nrf-2激活可以预防因素引发自身免疫发病机制。激活信号通路,有助于排毒和保护方式,促使大量的研究的潜在的健康益处和治疗应用Nrf-2 [54]。

Nrf-2是一个关键的转录因子,调节细胞内的氧化还原平衡。后者作为传感器的氧化应激主要存在于细胞质中;当活性氧水平升高,SOD等抗氧化应激蛋白的转录⁻¹,NQO⁻¹,何⁻1,增强。这些基因发挥至关重要的作用,防止氧化应激和组织损伤38,55]。Nrf-2-targeted基因包括基因参与谷胱甘肽的合成和接合,代谢血红素铁,和药物代谢和运输,以及抗氧化蛋白质、酶和转录因子。

Nrf-2的差别我们当前的研究发现明显对这些基因的表达水平在踝关节的关节组织CFA-induced关节炎大鼠与正常大鼠相比,从而提升这个组织的氧化损伤。相反,管理BM-MSCs和IMC单独或组合在一起的关节炎大鼠产生明显调节表达水平在踝关节组织Nrf-2关节炎相比控制。这一发现支持了我们的假设当前的抗氧化作用进行治疗。在另一方面,Yoshinaga et al。56)表示,IMC可能是一个适当的治疗脉络膜新生血管(CNV)的策略,因为其抗血管新生的影响和Nrf-2信号是造成潜在的机制。此外,王et al。57]发现BM-MSCs移植在脊髓损伤(SCI)在大鼠显著增加Nrf-2蛋白的表达,从而抑制氧化应激引发的SCI和促进脊髓修复。总的来说,这些结果验证我们的选择使用BM-MSCs或IMC单独或结合在炎症条件参考药物通过上调Nrf-2通路的能力,因此,抑制氧化压力发生疾病的结果(图发展10)。

此外,类风湿性关节炎是一种自身免疫性疾病,是众所周知的血清自身抗体形成,以及滑液(SF),在50 - 80%的RA患者的样本。射频是第一个描述自身抗体系统在RA和关注人类免疫球蛋白的Fc。尽管次优的特异性,RF发生被认为是代表RA和包括1987年在ACR的标准分类(58]。然后,它已经包含在2010年的美国大学对风湿病风湿病学欧洲联赛(ACREULA)分类标准。然而,射频已经研究了几十年,其作用在RA的发病机制仍不完全清楚。射频可能发挥其致病特性通过免疫复合物的创建。然后,促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-和il - 1β刺激和贡献在慢性炎症和骨破坏59]。

此外,细胞因子在疾病的发病机制中起关键作用。RA是众所周知的不断涌入的免疫细胞(单核细胞和淋巴细胞)的关节(60]。经常发炎的过程是严格控制,利用介质,从而诱导和维持炎症,炎性细胞因子(TNF - ,il - 1 ,和il - 6)和介质,关闭过程,称为抗炎细胞因子(il - 10、il - 4)。在慢性炎症、两个介质之间的不平等导致细胞损伤,软骨和骨的破坏,和炎症(61年]。

il - 1β最重要的细胞因子,在致病性关节炎进展,据报道与疾病相关的行为,如早上刚度时期(62年]。这Th1细胞因子主要由巨噬细胞分泌和扮演着主导的角色在炎症细胞的浸润,以及骨骼和软骨的破坏。它也刺激巨噬细胞分化成核因子b配体受体激活破骨细胞骨再吸收和损害。此外,il - 1β提示诱导一氧化氮的产生(间接宾语),前列腺素(PGE-2)和基质金属蛋白酶(MMP),从而诱导软骨的退化(图10)[63年,64年]。相比之下,il - 4是一种抗炎细胞因子产生的Th2辅助,降低il - 1、TNF -生产和抑制软骨损伤。同样,报告的数据Chomarat et al。65年]表明,il - 4抑制il - 1的发展和其受体的表达增加对抗,和两个行动将降低滑膜的炎症文化RA患者样本。因此,il - 4可以被视为一个潜在的工具用于治疗自身免疫性疾病是它的保护作用在RA的小鼠模型66年,67年]。

之前与我们所有的结果,关节炎的对照组的数据显示射频水平显著升高血清中检测到与一个了不起的upregulation il - 1βil - 4的差别,对这些基因的蛋白表达水平在关节关节组织与正常相比。这些发现强烈的炎症通路的重要性指标在抗炎的费用一个CFA管理的结果。然而,老鼠补充BM-MSC和IMC单独或同时表现出明显转向抗炎通路和Th2优势Th1就是明证明显调节il - 4和il - 1使之抑制β表达水平在关节伴随着大幅下滑的射频治疗大鼠的血清水平与CFA关节炎大鼠相比。根据我们的研究,Hoogduijn et al。68年补充说,msc可以改变细胞因子分泌的免疫细胞,如提高抑制分泌细胞因子(il - 4和il - 10)和肿瘤坏死因子的分泌减少和干扰素-(IFN - )分泌。此外,据报道,Selleri et al。69年和Zhang et al。70年],与msc诱导巨噬细胞生产的coculture M2巨噬细胞的吞噬活性和分泌的移植Th2细胞因子和会使Th1细胞因子的水平,如il - 1β干扰素- ,肿瘤坏死因子- ,和il - 12。这种调制Th2免疫反应表明他们的增强的信号直接抑制Th1通过抑制炎症级联反应传播(图10)。Nrf-2,增强效应的抑制BM-MSCs IMC,能够抑制氧化应激和炎症和激活抗氧化防御系统(图10)。这些结果代表介绍清楚地解释BM-MSC的效率和/或IMC抗关节炎药和抗炎药物克服RA的进程。

5。结论

综上所述,本研究证明,随之而来的治疗与BM-MSCs IMC政府更有效的生产抗炎和抗关节炎的效果除了使用过程中每个单独的RA CFA-induced关节炎Wistar鼠。这个建议支持的明显抑制炎症迹象如后爪肿胀、体重减轻、氧化应激(法律流程外包),和炎性细胞因子(RF和il - 1β)。此外,这种测试组合成功监测疾病进展通过减轻抗氧化酶水平(GPx, SOD、谷胱甘肽和销售税)和upregulation Th2抗炎细胞因子(IL4)和Nrf-2在关节关节组织。同样,结合治疗减轻滑膜炎,血管翳形成,软骨破坏发生疾病的结果。最终,BM-MSCs并发管理与IMC RA可以提供额外的有前途的治疗策略。然而,进一步的研究应进行明确的治疗风湿病的活动的机制BM-MSCs + IMC专门克服RA。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者承认塔伊夫大学,塔伊夫,沙特阿拉伯,支持本研究(塔伊夫大学的研究人员支持项目数量:TURSP-2020/127)。