文摘
Tetragonia tetragonioides,这是一个盐土植物和广泛生长于亚太地区,已被用于治疗消化疾病在东方传统医学。本研究调查了潜在的抗抑郁效果Tetragonia tetragonioides抑郁astroglial退化模型,建立了基于后期研究抑郁症患者的大脑呈现减少前额叶皮层星形胶质细胞。C57BL / 6雄性老鼠被暴露于神经胶质消融在前额叶皮层的管理胶霉毒素,L-alpha-aminoadipic酸(L-AAA)诱发抑郁症。Tetragonia tetragonioides剂量100毫克/公斤和300毫克/公斤,丙咪嗪剂量15毫克/公斤,和蒸馏水口头管理为18天的老鼠。行为测试包括开放的现场试验(OFT),蔗糖偏好试验(SPT),强迫游泳试验(置),和尾巴悬挂测试(TST)进行了2天后L-AAA注入。GFAP的表达水平和NeuN前额叶皮层是由免疫组织化学。老鼠受到胶质消融在前额叶皮层显示减少蔗糖SPT的消费和增加浮置板轨道和静止时间测试。与丙咪嗪治疗和Tetragonia tetragonioides显著改善行为绝望L-AAA引起的。此外,免疫组织化学分析显示治疗Tetragonia tetragonioides明显恢复了胶质损失的高架GFAP的表达水平。这些发现表明,Tetragonia tetragonioides会产生一个抗抑郁效应通过恢复神经胶质损失条件下的抑郁和可能是一个候选人的抗抑郁剂。
1。介绍
抑郁症被确定为特征的症状绝望,快感缺乏,食欲不振或睡眠障碍,减少能源和浓度,和罪责感和价值感,1- - - - - -5]。精神障碍的流行病学调查显示2011年在韩国,据报道,重度抑郁症的终生患病率是6.7% (6]。按照报告的死亡和死亡原因在韩国,2017年的自杀率是每100000人24.3 (7]。需要有效的治疗抑郁症的方法和直接用更少的不良事件逐渐增加,和各种当地的草药已经测试了这个目的(8- - - - - -10]。
在过去的几年中,神经胶质细胞的病理学研究重点理解大脑疾病背后的机制(11]。特别是减少胶质细胞密度在前额叶和扣带回区域一直在抑郁症患者(12]。在胶质细胞异常,特别是星形胶质细胞,调节中发挥重要作用主要抑郁障碍。之前的回顾总结,胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达和代表星形胶质细胞相关蛋白显著减少科目主要抑郁障碍患者(13,14]。在动物实验中,慢性和急性应激诱导则症状在星形胶质细胞在大脑行为和改变15]。
做了巨大的努力,产生抑郁症的有效和富有洞察力的模型,和慢性不可预知的压力模型是证据确凿的抑郁动物模型(16]。基于神经胶质的后期研究报告损失从抑郁症患者前额叶和扣带回区域17],Banasr Duman证明胶质消融在前额叶皮层诱发则行为(18]。作者引发的星形变性注入L-alpha-aminoadipic酸(L-AAA),胶霉毒素特定星形胶质细胞(19),前额叶皮层。注入L-AAA只导致神经胶质的损失而不是神经元。注入ibotenic酸,它是有毒的神经元,没有诱导则行为。
Tetragonia tetragonioides(幕)。Kuntze (TTK),通常称为新西兰菠菜,属于Aizoaceae家族,广泛生长在韩国,日本,东南亚,中国和新西兰20.,21]。在韩国,TTK大量生长在济州岛22]。在东方传统医学,TTK记载传授消化问题,环境的保护作用和antiulcerogenic活动也被报道(23]。提取TTK包括各种抗氧化化合物(24据报道,TTK抗氧化和抗炎作用25]。70%乙醇提取TTK展示了潜在的治疗menopause-associated症状和代谢障碍(26]。此外,TTK提取则症状改善和调节ovarietomized大鼠的血清素水平(27]。TTK在抑郁模型的抗抑郁效果还没有测试,和先前的研究表明TTK的可能性可能有效的治疗抑郁症。
为了解决这个话题,astroglial变性的抑郁症模型被用来调查改善TTK对抑郁症状的影响。此外,我们研究了背后的可能机制的抗抑郁效果TTK通过检查GFAP的表达在老鼠大脑前额叶区域。
2。材料和方法
2.1。动物
五十个雄性C57Bl / 6小鼠,七个星期岁从东方生物有限公司购买,韩国。被安置在丙烯酸的笼子里的老鼠(20厘米×27厘米×12厘米)在标准试验条件下在恒定温度下(22±2°C)、湿度(60±10%),光(12小时的光明与黑暗周期,灯在下午6点)。动物被允许免费的食物和水,以前一段时间的适应每个实验的开始。庆熙大学医学中心机构的动物保健和使用委员会批准了所有程序(KHMC-IACUC 16 - 033)。所有的努力都是减少动物痛苦的在实验的进展。
2.2。药品和试剂
TTK来自济州岛,韩国。整个干TTK(600克)与30%乙醇,煮两次提取是通过滤纸过滤。滤液集中使用旋转蒸发器和冻干生粉(91克)。粉储存在4°C到使用。鼠单克隆抗体β肌动蛋白和GFAP获得圣克鲁斯生物技术(美国CA)。Neuronal-specific核蛋白质(NeuN)从微孔购买公司(美国贝德福德,MA)。辣根peroxidase-conjugated antimouse二级抗体购自皮尔斯生物技术(美国罗克福德,IL)。乙腈和甲醇从霍尼韦尔购买Burdick和杰克逊(美国新泽西州莫里斯镇)和高效液相色谱的品位。分析纯甲酸(纯度99%)是获得Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。去离子水(> 18 mΩ)获得通过纯水净化系统(人类有限公司、韩国)。
2.3。LC-QTOF-MS分析
Isoferulic酸和4-hydroxybenzoic酸被选为参考标准基于以前的研究。大约50毫克的TTK粉1毫升的甲醇动摇了旋涡混合器,持续30秒。上层清液过滤0.2μm聚四氟乙烯注射器过滤器(热科学)。最后,滤液被转移到信用证样本瓶之前使用。
热的液体色谱-光谱法系统是由科学击败UHPLC系统(热费希尔科学、桑尼维尔,美国)好评RSLC 120 C18(2.1毫米×100毫米,1.7μm;美国安捷伦科技,Ca)和TripleTOF 5600 +质谱仪系统(TripleTOF女士;美国CA QTOF Sciex,福斯特城)。女士QTOF,配有DuoSprayTM离子源,是用来完成高分辨率的实验。LC梯度用流动相含有0.05%的甲酸、甲酸铵2.5毫米的水和乙腈的移动阶段B。流量保持不变在0.4 mL / min,和注射量是1μl .梯度洗脱系统开始在5% B 0.8分钟,5 - 20% B从0.8到2.5分钟,20 - 32% B从2.5到5.5分钟,32 - 38%从5.5到8,38 - 45% B为2分钟,2分钟45 - 60% B, B为4分钟60 - 95%,然后增加到100% B 20.0分钟,保持在100% B 3分钟,然后回到reequilibration的初始条件。
质量数据采集进行TripleTOF 5600 +在负离子模式下使用以下参数:源温度设定在450°C的窗帘气流25 L / min (GS1和GS2 50),离子喷雾−4500 V电压设置,declustering潜在30 V, V和碰撞能量是10。高纯氮气使用喷雾器/ DuoSprayTM和窗帘气体。QTOF和information-dependent收购(IDA)扫描操作的质量范围50 - 1500 m / z。前体离子校准和产品进行高灵敏度和高分辨率模式使用calibrant之前交付系统分析。数据采集和处理进行使用分析TF 1.7, PeakVeiw2.2, MasterView (Sciex,促进城市、钙、美国)。
2.4。插管注入
小鼠麻醉使用腹腔内注射氯胺酮+ 10毫克/公斤100毫克/公斤甲苯噻嗪,并引导插管(RWD生命科学有限公司,深圳,中国)是双边植入老鼠大脑的前额皮质区域使用立体定位器(游标立体定位仪器,徕卡生物系统、胡桃胡同、德国)由以下坐标:前后的1.7毫米,背外侧±0.25毫米,深度-2.5毫米前囱[28]。经过七天的恢复,我们注入L-AAA (100µ克/µl;σ)双边使用注射套管和microdriven泵(泵11精英Nanomite,哈佛装置Holliston,妈,美国)。我们管理输液两天每天一次0.1的速度µl / min 6分钟。
2.5。药品监督管理局
小鼠随机分为5组:对照组与蒸馏水(DW),阴性对照组L-AAA输液和DW,阳性对照组L-AAA输液和15毫克/公斤丙咪嗪,和两个实验小组L-AAA注入和100毫克/公斤TTK或300毫克/公斤。适应阶段后,口服直到动物被牺牲了。实验过程时间后如图1。
2.6。行为测试
开放的现场试验(OFT)进行了评估运动活动(29日]。短暂,老鼠被放置在一个白色的中心,压克力,塑料方箱(50厘米×50厘米),允许自由探索器10分钟。总路程,被摄像机记录下来,是评估使用计算机辅助控制系统(智能3.0,Panlab哈佛装置)。
蔗糖偏好试验(SPT),尾部测试(TST)和强迫游泳试验(置)进行测量抑郁行为的老鼠。SPT,老鼠习惯蔗糖1%,48小时,4小时后不足时期,偏爱蔗糖或水决心1小时。蔗糖和水的瓶子是相同的(30.]。结核菌素,老鼠暂停50厘米以上地板胶带放置1厘米的尾巴的尖端6分钟。静止时间定义2分钟马克后,随着时间的持续时间的动物被挂被动和剩下的4分钟期间完全不动31日]。置,老鼠被放置在一个不可避免的开放的圆柱形容器(直径20厘米,高35厘米),15厘米的水保持在25°C总共6分钟。静止时间被定义为鼠标停止了挣扎和漂浮不动在最后4分钟6分钟的测试,初始2分钟后活动(32]。
2.7。免疫组织化学
老鼠迅速与乙醚麻醉,然后灌注与磷酸盐(PBS),其次是4%多聚甲醛溶液。大脑在4%多聚甲醛固定24小时,其次是PBS含20%蔗糖24 h。通常,10μ米厚的日冕部分每个大脑嵌入在最佳切削温度(10月)复合,减少低温恒温器。在PBS洗涤后,部分被孵化1 h在室温下以1%正常马血清在PBS和孵化一夜之间在4°C的主要抗体GFAP和NeuN 1: 500稀释在PBS,含2.5%普通马血清。在PBS洗涤后,部分被孵化1 h在室温下与生物素化的二次抗体(1:50)PBS含2%普通马血清,随后孵化与ABC试剂(向量实验室、CA、美国)在PBS。在PBS再次清洗后,部分被孵化3,3 ' -diaminobenzidine tetrahydrochloride(轻拍;Dako, CA)和安装在permount安装介质(费舍尔科学国际,美国)。GFAP和NeuN-positive细胞被发现使用奥林巴斯BX51显微镜(奥林巴斯、东京、日本)
2.8。酶联免疫吸附试验(ELISA)
前额叶皮层的一些小鼠解剖和储存在ELISA−80°C。组织溶解产物是量化根据鼠标酶联免疫试剂盒(ThermoFisher沃尔瑟姆,马萨诸塞州,U。年代,中科院:BMS607-3)制造商的用户指南。蛋白质水平的肿瘤坏死因子-α(TNF -α)测定的吸光度450海里(pg / ml)通过一个微型板块读者。
2.9。统计分析
的统计差异意味着检查使用单向方差分析(方差分析),其次是Dunnett测试的组间比较。所有的分析,被认为具有统计显著性值小于0.05。使用SPSS 22.0进行分析(美国纽约阿蒙克的IBM Inc .)。
3所示。结果
3.1。色谱TTK提取和参考标准
提取离子色谱4-hydroxybenzoic酸和isoferulic酸的参考标准和TTK粉图所示2。的峰值4-hydroxybenzoic酸在isoferulic酸的2.71分钟,在4.10分钟。TTK权力,4-hydroxybenzoic酸(RT: 2.71)和isoferulic酸(RT: 4.17)被证实存在从MS / MS谱和峰值3.93预计将阿魏酸。
(一)
(b)
3.2。TTK对行为的影响测试L-AAA注入老鼠
测定小鼠的运动活动在一个开放的领域测试(图3(一个))。没有显著差异中观察组的总距离移动(F(42)= 1.627,P= 0.185)。因此,很明显,L-AAA输液,丙咪嗪的政府,TTK并不影响小鼠的运动活动。
(一)
(b)
(c)
(d)
老鼠的蔗糖的则行为偏好测试,尾部测试和强迫游泳测试。蔗糖偏好测验的结果呈现在图3 (b)。蔗糖的百分比的偏好在L-AAA + DW组显著降低,与对照组相比 )。TTK在剂量为100毫克/公斤( )和300毫克/公斤( )和丙咪嗪剂量的15毫克/公斤( )有显著提高蔗糖的偏好与L-AAA + DW组。
数据3 (c)和3 (d)显示L-AAA灌注的影响在老鼠的静止时间置和结核菌素,分别。L-AAA + DW组显示显著增加浮置板轨道(静止时间与对照组相比 )和结核菌素( )。TTK在剂量为100毫克/公斤( )和300毫克/公斤( )和丙咪嗪剂量的15毫克/公斤( )显示明显降低在静止时期相比L-AAA浮置板轨道(图+ DW集团3 (c))。TTK在剂量为100毫克/公斤( )和300毫克/公斤( )显著下降的持续时间静止时间,而丙咪嗪剂量15毫克/公斤( )没有显示明显降低L-AAA + DW组相比结核菌素(图3 (d))。
3.3。TTK对GFAP和NeuN表达式L-AAA注入老鼠
GFAP免疫反应性的前额叶区域的结果显示在图4。从控制幻灯片的老鼠显示中度GFAP免疫反应性在前额叶区域(图4(一)),而从L-AAA + DW组幻灯片显示降低免疫反应性(图模式4 (b))。值得注意的是,幻灯片从小鼠接受TTK和丙咪嗪也显示适度GFAP免疫反应性的前额叶区域(数据4 (c)- - - - - -4 (e)),类似于幻灯片准备从控制老鼠。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
免疫反应性的NeuN前额叶区域的结果如图所示5。幻灯片的老鼠显示中度NeuN前额叶区域的免疫反应性。没有显著差异观察NeuN表达式的组。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.4。TTK对肿瘤坏死因子的影响α在L-AAA注入老鼠
肿瘤坏死因子-的蛋白质水平α由ELISA图所示6。肿瘤坏死因子-的蛋白质水平α在前额叶皮层显著增加L-AAA + DW组相对于对照组。相比之下,TNF -的蛋白质水平α前额叶皮层的老鼠接受低剂量和高剂量的TTK丙咪嗪显著低于老鼠DW处理。
4所示。讨论
我们研究的主要发现是TTK可以缓解抑郁症状astroglial变性引起的小鼠抑郁模型。老鼠接受TTK显示增加活动和蔗糖偏好行为的测试,与DW对待。TTK似乎保护GFAP表达的减少引起L-AAA注入在前额叶皮层。因此,我们的结果表明,TTK可能提供一个潜在的替代治疗治疗抑郁症。
增加浮置板轨道L-AAA-infused小鼠不动次TST和反映出的绝望中观察到抑郁状态。他们减少蔗糖的偏好也反映了利益的损失。在目前的研究中,TTK传授保护蔗糖偏好SPT和降低浮置板轨道和固定次结核菌素不影响鼠标运动活动。病理学的星形胶质细胞明显有助于重度抑郁障碍(33,34]。在前额叶皮层星形胶质细胞调节谷氨酸水平,和病患的封锁谷氨酸摄取与快感缺乏的症状(35]。发布的同时,低三磷酸腺苷丰富星形胶质细胞在大脑中调节绝望的症状提出的增加不动时间36]。L-AAA注入小鼠的前额叶皮层中也报道减少大脑的水平诱导谷氨酸和谷氨酰胺(37不仅病患诱导视网膜变性。
这些从这个研究结果表明TTK astroglial产生的减毒则症状抑郁症的退化模型。后抑郁症的神经胶质消融模型开发(18)受体拮抗剂的抗抑郁效果MTEP [38),前额叶皮层脑深部电刺激(39],陆Y5受体拮抗剂AA33810 [40],骆驼蓬碱[41],ZL006 [42),和人参皂苷射频43)进行了测试。在某种程度上类似于先前的研究中,注入L-AAA诱导则行为,管理丙咪嗪(38)逆转抑郁行为并导致GFAP-positive细胞的数量减少。在这项研究中,我们表明,L-AAA灌注诱导前额区GFAP的表达减少,这与TTK管理的改善。TTK GFAP表达的的保护作用对减少L-AAA输液引起的。大量的证据表明,神经胶质细胞的数量减少前额叶区域反映抑郁症的病理,和令人鼓舞的是要注意,立即与TTK恢复神经胶质消融治疗。
TTK的抗抑郁作用可能与抑制神经炎症有关。在这项研究中,TTK降低TNF -水平α,类似于以前的报告在estrogen-deficient TTK的影响大鼠(26]。肿瘤坏死因子-α是一个关键的促炎细胞因子,与抑郁症的发病机理(44,45通过激活hypothalamopituitary-adrenocortical (HPA)轴。肿瘤坏死因子-管理α据报道,诱导小鼠则行为,减少的治疗等典型的抗抑郁药氟西汀和丙咪嗪(46]。丙咪嗪和氟西汀也降低TNF -的生产α在人类患者和抑郁症的动物模型(47- - - - - -49]。astroglial退化模型的同时,抑郁,L-AAA-injected老鼠高架TNF -α(50]。肿瘤坏死因子-的逆转α由TTK表明TTK可能引起抗抑郁效应通过参与抗炎活性。
在先前的研究中,1%和2% TTK 70%乙醇提取的静止时间减少切除卵巢的老鼠(27]。在这项研究中,口服100毫克/公斤和300毫克/公斤30%乙醇提取物的抗抑郁效果L-AAA诱发抑郁模型。通常,300毫克/公斤TTK似乎比缓解抑郁行为相比,100毫克/公斤TTK行为测试,表明反应存在剂量依赖的相关性。阿魏酸是一种活性成分的提取TTK [51]。最近,阿魏酸的抗抑郁效应已报告在抑郁症的各种模型41,52- - - - - -55]。潜在机制被认为是,活动和神经炎症反应在脑额叶前部皮层53和海拔的前额叶皮层和海马的神经营养因子41已报告。在这项研究中,TTK逆转类似抑郁的行为和保护神经胶质消融。阿魏酸可能是主要组成部分TTK负责施加一种抗抑郁的效果,和定量比较单一的化合物和提取的影响TTK需要进一步调查。
对我们的研究有几个局限性。首先,新的天然产物的抗抑郁效果只有在抑郁症的astroglial退化模型进行测试。暂时的胶质烧蚀效应L-AAA持续三天的18,56),抑郁症的神经胶质消融模型被用来测试药物的急性效应。在这项研究中,L-AAA注入后,药品管理局执行行为的传导测试之前的两倍。我们设计了本研究测试TTK的预防和急性效应。还需要进一步的研究来探索TTK长期影响的另一个抑郁模型如慢性不可预知的应力模型。其次,背后的机制的抗抑郁的作用TTK不够了。考虑到先前的研究的抗氧化和抗炎作用TTK, TTK在另一种抗抑郁药物的作用机制与抑郁症相关的前额叶皮层也预期。第三,TTK是天然产品,其中包含各种化合物,所涉及的活性化合物表现出抗抑郁的效果应该进一步研究证明。
5。结论
目前的研究表明潜在的TTK治疗抑郁症状的改变大脑抑郁症的动物模型。TTK保护老鼠大脑胶质胶霉毒素,引起的损失在前额叶皮层L-AAA。建议TTK可能是一个潜在的候选治疗抑郁症。进一步的研究需要了解TTK对抑郁障碍的影响。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Yujin崔和云南金同样导致了这项工作。Yujin崔: Conceptualization, Investigation, Data curation, Formal analysis, Writing original draft; Yunna Kim: Conceptualization, Investigation, Data curation, Formal analysis, Writing review & editing; Hwa-young Lee: Conceptualization, Investigation, Writing review & editing; Seung-Hun Cho: Conceptualization, Supervision, Writing review & editing.
确认
这项研究受到了基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由教育部(NRF - 2018 r1d1a1b07050445)。作者感谢韩医学临床试验中心(K-CTC),韩国庆熙大学医学医院,定性分析的提取和标准。