文摘

文珠兰属asiaticum林恩。已在泰国使用传统药物来缓解炎症症状和治疗骨关节炎。有报道称在其强大的抗炎特性但不同预处理的影响其化学性质和抗炎活性。中药原材料的预处理是一个重要的步骤,影响了泰国传统医药的总体质量。本研究的目的是调查不同的治疗方法c . asiaticum之前叶乙醇提取及其比较提取物的抗炎活性和化学性质。治疗包括烤箱的热风干燥、微波干燥、传统烧烤木炭炉子在烤箱干燥之前,和温度冲击在热水和冷水热风干燥。提取物的抗炎活性和化学性质使用既定的方法进行了分析。结果显示95% ethanolic提取的热风烘干的叶子有最高的抗炎活性和总酚和lycorine内容。我们建议热风干燥preextraction治疗c . asiaticum叶子为简单起见,最好的保留草药质量,适合扩大一个工业过程。

1。介绍

炎症组织的主要生理反应的病原体,细胞损伤和受损组织。促炎细胞因子、炎症介质如一氧化氮(NO)、前列腺素E₂(铂族元素₂)和肿瘤坏死因子-α(TNF -α)在炎症过程中产生造成损害的细胞,组织和器官(1,2]。关于炎性疾病的病理生理学、骨关节炎(OA)是最常见的慢性退行性疾病在老年人中。的炎症介质如一氧化氮、il - 1、TNF -α,cox - 2为软骨和关节退行性变3]。非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药)是常见的治疗OA疼痛和炎症。然而,负面影响被观察到在老年患者4]。

文珠兰属asiaticuml .(石蒜科家族)长期以来一直用于东南亚和泰国传统医学用于治疗炎症和缓解疼痛。根据民族药物学,东南亚国家使用c . asiaticum治疗的伤口,肿胀,疼痛损伤,关节发炎,和作为毒药的解药或毒素5- - - - - -7]。在泰国的传统医学,c . asiaticum叶是植物成分Phra-aung-kob-phra-sean弥补常用来治疗有害,发炎的关节(8),和脚踝疼痛和产后护理[9]。

当地从业者烧烤c . asiaticum叶子在炭炉直到他们软化和热之前覆盖局部疼痛。然而,这种传统的影响加热治疗炎症活动的树叶尚未阐明。

先前的研究已经报道的生物活性c . asiaticum叶子包括抗氧化作用[10)和抗炎通过抑制一氧化氮产量(11]。一个在活的有机体内叶提取物也表现出显著的抗炎效应研究[12]。植物化学的组件之一c . asiaticum,lycorine是最常见的文珠兰属生物碱,施加强有力的免疫、抗肿瘤和抗炎活动(13- - - - - -15),减少破骨细胞自噬在活的有机体内(16]。这些研究已经报道了强有力的抗炎效果c . asiaticum但到目前为止,没有研究已经完成不同preextraction治疗的影响其化学性质和抗炎活性。我们的研究旨在填补这一空缺的知识。

传统的泰国医生通常有他们自己的方法之前的准备应用的草药。这些可能包括加热、烤或者猛击新鲜草对于局部应用程序,或者煮水或酒精,如果是内部。这些预处理技术应用几个原因,例如,要长期储存,质量控制,提高疗效,降低毒性的草药8]。

Preextraction治疗的物理准备草药包括清洗、破碎、溶剂萃取前和干燥。Ethanolic与95%乙醇提取通常是一种提取方法的选择对于大多数草药材料科学研究为目的的对抗目标疾病的生物活性成分和功效。然而,草药提取物的质量通常是受到治疗的草药提取之前,尤其是干燥过程。干燥温度和时间和干燥过程是如何应用到新鲜草药可以产生深远影响的化学成分提取,因此药用功效[17,18]。

在这个研究中,我们应用四预处理的方法c . asiaticum叶子准备乙醇提取及其评估什么影响他们每个人对化学和草的抗炎特性。第一个方法是烧烤木炭炉子,一个常见的做法在泰国传统医药。第二种方法是在烤箱中烘烤温度和时间可以方便地控制以减少损失的树叶。第三种方法是微波干燥采用直接电加热温度控制和更快的干燥的物质使缓解更好地保留草药品质。第四个方法在水温度骤变可能有助于保护叶子颜色和一些重要的物质。然后,我们比较了四个preextraction治疗的影响c . asiaticum叶的抗炎活性,抑制不确定,铂族元素₂和肿瘤坏死因子-α生产,其化学性质总酚类化合物和lycorine等内容。从结果,我们推荐最合适的治疗,最好的保存的质量c . asiaticum叶的抗炎产品发展的OA患者的疼痛缓解。

2。材料和方法

2.1。植物材料和Preextraction治疗方法

c . asiaticum从医学院收集树叶,法政大学、市郊,泰国。标本凭证(skp - 008 03 01 01)沉积在泰国南部中心药用植物的标本,制药科学教师王子Songkla大学的泰国。概念图的步骤实验如图1。

新鲜的叶子用水洗净,切成中型块之前进行以下四个不同的preextraction治疗:(1)热空气干燥在烤箱(CAA)烤箱设定在40^°C 10个小时。(2)微波功率的微波干燥(CAM) 80^°MhZ 20分钟。(3)传统烧烤木炭炉子在干燥之前烤箱(CAG):树叶放在木炭炉子的网格,轻轻烤15分钟前干燥热风烤箱40岁^°C 8个小时。(4)在热水和冷水温度骤变热风干燥(CAC):树叶浸在浴缸,享年100岁^°C 5秒钟,然后立即跳入冰水浴(0^°C)在热空气干燥炉前15秒40岁^°C 8个小时。

2.2。浸渍和提取方法

从每个preextraction干叶子治疗(40克)与95%乙醇浸渍三天,通过绘画纸1号滤纸过滤。浸渍是重复和提取总和的两倍。粗提取液是干在旋转蒸发器。

2.3。试剂和化学物质

标准lycorine(纯度> 98%)从化学面临购买(武汉,中国)。二甲亚砜(DMSO),磷酸,三乙胺,纯净水是由毫问®系统从微孔(贝德福德,妈,美国)。乙腈高效液相色谱级购买从RCI实验室扫描(泰国曼谷)。小鼠巨噬细胞白血病细胞系(原始264.7:写明ATCC®矿- 71™)从美国购买类型文化集合(美国弗吉尼亚州写明ATCC®)。胎牛血清(的边后卫)购买Gibco®(好吧,美国)。杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM),磷酸缓冲盐(PBS)和penicillin-streptomycin (P / S)买来Biochrom(马、德国)。(3)- 4 5-Dimethyl-2-thiazolyl 2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium溴化(MTT)购买的σ(美国密苏里州)。

2.4。仪器

高效液相色谱系统(安捷伦®1200;美国安捷伦科技)由溶剂脱气器(G1322A),一个autosampler (G1329A)第四纪溶剂泵(G1311A),光电二极管阵列检测器(G1315D)和柱温箱(G1316A)。的色谱数据处理Chemstation®软件版本B.04.01 SP1。

2.5。抗炎活性的抑制一氧化氮产量从原始264.7通过MTT测定细胞和细胞毒性

抗炎活性的抑制一氧化氮产量RAW264.7细胞决定根据Tewtrakul和Itharat的方法,用细微的修改(19]。简而言之,RAW264.7细胞在DMEM培养基培养10%胎牛血清的边后卫,青霉素(100单位/毫升),和链霉素(100µg / mL)和孵化37°C下5%的股份有限公司₂。细胞被播种到96孔板和孵化24小时。细胞治疗与有限合伙人(脂多糖)的最终浓度5 ng / mL。增加了样品溶液和孵化24小时。上层清液被转移到一个新的96孔板和格里斯试剂是补充道。板光密度(OD)测量标在波长为570 nm。MTT比色细胞治疗的可行性解决方案。OD以570海里。%和%抑制毒性计算。半抑制浓度(IC₅₀)是由回归分析使用GraphPad棱镜软件(美国CA)。

2.6。抗炎活性的抑制TNF -α264.7生产从原始细胞

对肿瘤坏死因子-抑制的影响α264.7生产从原始细胞被评估使用Quantikine®鼠标TNF -αELISA检测组件(达姆施塔特,德国)根据Makchuchit等的方法。20.用细微的修改。总之,细胞被播种在96 -孔板的密度1×10⁵细胞/孵化24小时。之后,介质被新的取代介质包含5 ng / mL的有限合伙人和测试样品在不同浓度和培养24小时。上层清液转移到96 - ELISA。OD以450海里。抑制TNF -百分比α生产计算和棱镜程序用于计算IC₅₀值。

2.7。抗炎活性的抑制前列腺素E2 (PGE2)从原始264.7细胞线

RAW264.7细胞巨噬细胞被播种在96 - 1×10孔板⁵细胞/ 18 - 20小时孵化。之后,中包含0.08新媒介所代替μ克/毫升的有限合伙人与不同浓度的样品和孵化24小时。上层清液转移到96 -铂族元素₂ELISA板(开曼化学公司)。吸光度测量420海里。抑制百分比的铂族元素₂生产计算和棱镜程序用于计算IC₅₀值。

2.8。总酚含量测定

提取物的总酚含量由修改Folin-Ciocalteu方法(21]。一个20μ与100年L整除提取的混合μL Folin-Ciocalteu试剂和80μL碳酸钠。板混合好,被允许站在室温下开发颜色30分钟。吸光度测量765海里。总酚含量被表示为毫克没食子酸等价物(GAE) / g。这是计算从校准曲线的没食子酸标准解决方案(从2.5到100μg / mL)。所有的测试进行了一式三份。

2.9。通过高效液相色谱法测定Lycorine内容

2.9.1。标准样品溶液的制备

股票的标准溶液lycorine准备在DMSO溶液的浓度为0.5毫克/毫升。校准曲线是由使用连续稀释标准溶液浓度的50,100,150,200,300,500µ克/毫升。每个样品的解决方案,c . asiaticum提取获得各种preextraction治疗是溶解在DMSO溶液生产样品溶液含有10毫克/毫升的提取。

2.9.2。色谱条件

化学成分的粗提取液沿着C18反相柱分离(Zorbax®C18, 4.6×250毫米,5微米)。0.1%的流动相由v / v三乙胺与磷酸水pH值调整到3.0 (A)和乙腈(B),梯度洗脱程序如下:0 - 5分钟,5% B;25分钟,30% b;25.1 -30分钟,80% b;30.1 -35分钟,5% b。流量被设定为1毫升/分钟。样品(10µL)被注入到高效液相色谱系统和使用二极管阵列检测器检测到的波长290 nm。

2.9.3。验证的高效液相色谱方法

验证的高效液相色谱法是根据指导进行国际协调会议(我2005)(22]。验证参数包括选择性、线性、准确性、精密度、检测极限(LOD),并限制的定量(定量限)。

2.10。统计分析

抗炎活动的评估进行了一式三份,结果被表示为±SEM。的集成电路₅₀值计算通过使用Prism项目。数据分析使用单向方差分析和图基的多重比较测试。高效液相色谱分析的结果用平均数±标准差表示。统计学意义是在水平 。

3所示。结果

3.1。提取的干叶子c . asiaticum

ethanolic提取物的收益率(%)c . asiaticum叶子从不同preextraction治疗如表所示1。从烧烤方法获得最高产量(CAG;25.75%)。其他方法、凸轮、创新艺人经纪公司,CAC,收益率为24.23%,22.88%,和21.53%,分别。

3.2。抗炎活性的抑制一氧化氮产量264.7从原始细胞

如表所示2创新艺人经纪公司显示,最高抑制活动与IC₅₀值为16.66±1.42µ克/毫升。凸轮、CAG和CAC施加与集成电路抗炎活性₅₀值为20.42±0.57,21.35±0.56,22.48±1.09µ分别g / mL。他们都表现出抗炎活性明显低于积极的控制,强的松(IC₅₀= 1.05±0.13μg / mL)。Lycorine,一个主要的组成部分c . asiaticum与集成电路,施加有效的活动₅₀值为0.40±0.01μ克/毫升。相反,双氯芬酸不活跃在这个途径。结果表明,创新艺人经纪公司可能影响生产的含量明显低于与CAG和CAC相比(表1)。

3.3。抗炎活性的抑制TNF -α264.7生产从原始细胞

结果在表1表明,创新艺人经纪公司施加最高的活动与IC₅₀值为25.21±1.11µ克/毫升。凸轮、CAG和CAC显示抗炎活动与IC₅₀值为37.60±0.58,46.36±0.48,45.63±1.54µ分别g / mL。然而,他们都有显著减少( )抗炎活性比强的松(IC₅₀= 0.07±0.00μg / mL)。Lycorine显示抑制14.0%浓度的0.8μ克/毫升。高lycorine浓度显示细胞毒性264.7原始细胞> 30%。相反,双氯芬酸不活跃在这个途径。结果表明:CAA可以显著降低TNF水平α生产与凸轮相比,CAG和CAC ( )。

3.4。抗炎活性的抑制产生PGE2 264.7从原始细胞

如表所示1,所有提取的c . asiaticum在这个途径并不活跃。然而,强的松,积极控制,与集成电路显示强大的抗炎活性₅₀值为0.07±0.00μ克/毫升。所有提取明显不同于强的松( )在这方面。双氯芬酸与集成电路显示有效的抑制₅₀值为0.004±0.001μg / mL, lycorine不活跃在这个途径。

3.5。264.7细胞毒性的提取原始细胞MTT试验

264.7原始细胞的细胞毒性ethanolic提取物不同preextraction治疗的c . asiaticumMTT比色叶是化验。如表所示2浓度,提取都是无毒的。Lycorine显示细胞毒性浓度大于1μ克/毫升。

3.6。总酚含量

如表所示1创新艺人经纪公司,总酚含量最高的价值为23.20±1.36毫克GAE / g。凸轮、CAG和CAC显示总酚含量为14.53±0.63,13.10±1.02,12.01±0.84毫克GAE / g,分别。

3.7。高效液相色谱法(HPLC)分析和验证方法

高效液相色谱系统显示良好的lycorine与其他物质的分离提取、lycorine匹配标准峰的峰值在RT = 5.8,和空白(DMSO)没有显示出峰值在同一RT标准(图2)。粗提取物的色谱图和标准解决方案平行lycorine的紫外光谱的峰值。峰纯度的lycorine样品色谱被比较评估紫外光谱,顶点和最终lycorine峰值的标准。结果表明,每个样品的紫外光谱(CAA,凸轮、CAG和CAC)相似的lycorine标准(图3)。

高效液相色谱系统lycorine分析显示通过确定系数线性度好(r²= 1)50 - 500的范围内μ克/毫升(表3)。LOD和定量限lycorine 1和3.25μ分别为g / mL(表3)。方法的准确性提出了盘中%复苏和interday在99.76 -101.96%和99.07 -100.62%,分别为(表4)。精密度RSD %值低于2%,表现出一个伟大的(表精度的方法4)。良好的线性、准确度和精度测定的高效液相色谱方法表示其适用性lycorine ethanolic提取的c . asiaticum叶子后不同preextraction治疗。lycorine内容的比较值c . asiaticum叶提取物在不同preextraction治疗图所示4。创新艺人经纪公司,凸轮、CAG和CAC显示内容为34.40±0.41,21.05±0.28,17.71±0.13,17.48±0.24毫克/克,分别。

4所示。讨论

骨关节炎是一种常见的疾病老年人在泰国和其他国家。没有生产过剩,TNF -α和铂族元素₂在发炎的关节组织和人类软骨细胞在OA患者(23,24]。此外,氧化会导致组织损伤、软骨和关节变性(25]。

c . asiaticumPhra-aung-kob-phra-sean补救的药用植物,长期以来一直用于治疗损伤和关节炎症。泰国传统/民间医药使用烤草的叶子。民间医学认证指南描述,新鲜的叶子被火烤轻轻从木炭炉子然后压和缠绕在疼痛区域(26]。

以前的植物化学的研究c . asiaticum报道,生物碱类、香豆素苷、三萜烯酚醛树脂和类黄酮成分c . asiaticum叶(27,28]。Lycorine是主要之一文珠兰属生物碱(14,28]。一项研究报道,ethanolic提取的树叶产生在体外抗炎活性的抑制一氧化氮产量(11]。叶提取物也表现出显著的抗炎效应在活的有机体内(12,29日]。另一项研究报道,甲醇和氯仿提取物的热脱水的叶子c . asiaticum施加antinociceptive效应(27]。到目前为止,还没有报告的影响不同preextraction治疗其化学性质和抗炎活性。我们的研究解决这一差距的知识通过比较四叶的preextraction治疗的影响其抗炎活性和化学性质。

所有不同提取物由preextraction治疗显示抑制没有生产。提取得到热风烘干的叶子(CAA)施加最高的活动与IC₅₀值为16.66±1.42µ克/毫升。这个比较结果从先前的研究表明IC₅₀值为9.99±0.00µ克/毫升(11]。所有提取比积极的控制,表现出更少的抑制活性强的松。从创新艺人经纪公司也产生TNF -最高的活动α生产与集成电路₅₀值为25.21±1.11µ克/毫升。提取从其他preextraction治疗与IC产生更少的活动₅₀高于35µ克/毫升。所有提取物对抑制肿瘤坏死因子-少α生产比强的松。双氯芬酸在TNF -并不活跃α途径。没有一个提取抑制铂族元素₂生产。我们的研究表明,lycorine施加强大的抗炎活动通过抑制没有生产,但稍微抑制TNF -α和铂族元素₂生产RAW264.7细胞。一项研究报道,从ethanolic lycorine提取的文珠兰属yemense抑制LPS-induced伊诺但不是cox - 2基因表达(30.]。从另一个先前的研究(31日),lycorine抑制没有与IC生产生264个细胞₅₀值为1.2±0.4µ与我们的结果0.4 M相比µ1.43 g / mL或µm .结果的差异可能是由于不同的试验程序,如种子细胞的浓度在96 -孔板和LPS诱导的浓度一氧化氮产量RAW264.7细胞。

在植物化学的研究中,我们研究了各种preextraction治疗的效果c . asiaticum叶总酚和lycorine内容。创新艺人经纪公司提取显示总酚含量最高(23.20±1.36毫克GAE / g),而导致先前的研究60.28±0.38 TAE / g (10]。这种差异可能是由于因素如季节,温度,对植物生长和土壤成分以及处理方法。

酚类化合物有助于抗氧化活性(32,33]。氧化应激激活炎症介质与生产过剩的活性氧参与一些慢性炎性疾病(34]。因此,酚类化合物可能有助于抗炎活动通过其抗氧化作用。最近的一项研究报告ethanolic提取物的抗氧化活性c . asiaticum叶和散装35]。

Lycorine ethanolic提取的内容c . asiaticum叶子从各种preextraction获得治疗决定使用高效液相色谱法进行验证。方法显示良好的特异性、准确度和精度。创新艺人经纪公司提取显示lycorine含量最高(34.40±0.41毫克/克)显著高于凸轮,CAG和CAC提取物( )。我们的结果显示CAA提取施加最高抑制活动没有生产从有限合伙人- - - - - -264.7诱导原始细胞。Lycorine已被证明有一个强有力的抑制活动没有生产。这表明lycorine可能是负责任的标志c . asiaticum叶子抑制活动没有生产。不,炎症介质的重要炎症过程中对关节软骨有破坏性的影响,有助于带来骨关节炎是最常见的慢性退行性疾病。此外,lycorine强有力的免疫,抗肿瘤和抗炎活动(14,15),已经被证明可以减少体内自噬在破骨细胞(16]。因此,lycorine最有可能负责任的活性化合物c . asiaticum提取从而支持传统的使用c . asiaticum缓解关节疼痛。

由于lycorine RAW264.7细胞毒性,其抑制肿瘤坏死因子-活动α和铂族元素₂生产不能证明,尽管它对抑制浓度高于0.8μ克/毫升。然而,lycorine不是唯一活跃的化合物c . asiaticum;还有其他的化合物(36,37),但他们没有被调查,这应该是未来研究的课题。

这项研究的结果证实了我们的假设,不同preextraction治疗抗炎活动和化学性质的影响c . asiaticum叶子。提取后获得的热空气(40°C)烘箱干燥(CAA)显示,最高抑制活动没有和TNF -α生产、总酚和lycorine内容。摘录其它preextraction治疗显著降低,尤其是传统烧烤木炭炉子(CAG)和温度冲击在热水和冷水热风干燥(CAC)。似乎在木炭火炉,高温等因素,形成烟雾,灰烬叶表面可能导致活性化合物的降解。炭烤的叶子可以吸附化学成分导致总酚含量下降和其它生物活性成分(38]。CAC的方法,树叶直接浸入沸水(约。100°C)然后冰水(约。0°C)。这个过程可能引起的退化和浸出具有生物活性的化合物。CAC的提取方法显示最低lycorine内容。微波干燥方法(CAM)的技术将电磁能转化为热能。电磁能量可能会影响一些化合物在分子水平上和材料的快速加热可能引起热敏性组件的热降解。之前的报告显示,总酚含量是减少了微波加热39,40]。此外,另一项研究发现,lycorine不稳定,氧气和热量。自环C的生物碱含有双键和至少一个羟基、氨基功能和芳构化的这枚戒指出现在不同的反应条件下(41]。因此,我们的研究结果表明,不同preextraction治疗抗炎活性和化学性质的影响c . asiaticum叶子不同,其中一些是相当不利的。

本研究的结果支持使用c . asiaticum在泰国传统医药在骨关节炎疼痛。在烤箱烘烤40°C 10小时应该推荐preextraction治疗c . asiaticum离开它的简单性和最佳保留草药的质量。它也可以很容易地扩大工业水平的进一步发展c . asiaticum作为药物治疗骨关节炎的关节疼痛。然而,可能需要更多的研究来调查其他生物活性化合物的提取和机制,减轻疼痛。

5。结论

我们的研究表明,风干在40°C是最好的preextraction治疗c . asiaticum离开之前ethanolic提取95%。它产生最高的提取物抗炎活动如图所示,其抑制一氧化氮和肿瘤坏死因子的能力α生产RAW264.7细胞和细胞没有毒性。提取也有最高的总酚和lycorine内容是影响其抗炎活性的抗氧化剂。因此,本研究支持传统的使用c . asiaticum缓解关节疼痛和热风干燥应该用作preextraction治疗。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢泰国通过皇家金禧博士。项目研究基金(批准号博士/ 0078/2558)来支持这项工作。他们也要感谢应用泰国传统医药研究的卓越中心(CEATMR)和Bualuang东盟讲座教授、医学院、法政大学,金融支持和实验室设备的使用。