电针刺激机制调节IRS-1磷酸化在骨骼肌改善胰岛素敏感性

文摘

客观的。探讨电针刺激的可能机制改善2型糖尿病大鼠的胰岛素敏感性。方法。十四Zucker糖尿病脂肪(二台)大鼠随机分为两组:模型组和电针刺激组,每组7的老鼠。7 Zucker精益(ZL)大鼠作为对照组。所有大鼠喂养上贴# 5008 4周,和电针刺激组四周电针刺激干预,而对照组和模型组收到任何干预。我们测量空腹血糖(FBG)的第四个周末。干预4周后,胰岛素受体的表达水平底物(IRS-1)酪氨酸磷酸化,IRS-1丝氨酸/苏氨酸磷酸化,GLUT4在股四头肌肌肉被免疫印迹检测。结果。电针刺激组与模型组相比,较低水平的空腹血糖、血清胰岛素水平和胰岛素抵抗指数( )。电针刺激组IRS-1丝氨酸/苏氨酸磷酸化低于模型组,差异显示统计学意义( )。此外,对照组的平均得分(MS)显示最低的磷酸化表达,其次是电针刺激组,模型组磷酸化蛋白表达的最高水平。IRS-1酪氨酸磷酸化水平在Tyr895网站比较,结果表明,没有显著区别电针刺激组和对照组( ),和电针刺激组磷酸化表达高于模型组( )。与对照组和模型组相比,GLUT4蛋白的表达水平在电针刺激组显著增加( )。结论。电针刺激效果改善2型糖尿病患者的胰岛素敏感性ZDF老鼠通过降低空腹血糖、胰岛素水平和胰岛素抵抗指数,有效地调节GLUT4蛋白的表达在股四头肌肌肉。相关的机制是调节骨骼肌IRS-1丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸磷酸化水平。

1。背景

糖尿病是一种代谢疾病引起的内分泌系统相结合的遗传和环境因素(1]。2型糖尿病占超过90%的人口的影响。随着经济的发展,提高生活水平和生活方式的改变,糖尿病的患病率在肥胖的人显著增加。胰岛素抵抗、2型糖尿病的发病的一个重要机制,体现了周围组织和器官对胰岛素的敏感性下降(2]。骨骼肌是最重要的外围胰岛素的靶器官。这是一个重要的组织insulin-mediated葡萄糖的摄取和利用,80%的葡萄糖在血液中循环由骨骼肌吸收和代谢。因此,它尤其关键在骨骼肌胰岛素抵抗的机制研究。此外,当前的降糖药物都有一定的副作用和不良反应,而针灸已被大量研究证明有效干扰2型糖尿病。因此,探讨电针刺激机制降低血糖和改善骨骼肌胰岛素敏感性是2型糖尿病的治疗具有重要意义。

在生理条件下,血糖升高可引起胰岛B细胞分泌胰岛素。胰岛素受体(InR)被激活后骨骼肌细胞膜上胰岛素被运送到骨骼肌。IRS-1是骨骼肌的主要成分3),具有酪氨酸、丝氨酸激酶活性,酪氨酸磷酸化打开一系列下游通路,GLUT4搬到细胞膜进行主动运输的葡萄糖的生物活性4]。在胰岛素抵抗,反馈刺激导致多余的丝氨酸激酶活性,竞争性抑制酪氨酸激酶的磷酸化,阻碍正常IRS-1的磷酸化,并减少迁移的葡萄糖转运体GLUT4细胞膜,导致位移葡萄糖进入细胞(5]。

在这项研究中,我们调查了电针刺激对IRS-1的磷酸化水平的影响在ZDF老鼠和观察电针刺激是否能促进骨骼肌葡萄糖的吸收通过调节骨骼肌IRS-1的磷酸化,提供证据electro-acupuncture治疗2型糖尿病的机制。

2。实验材料

2.1。实验耗材

罗氏ACCU-CHEK血糖仪(很多:10129770)和罗氏血糖测试条(很多:24685431)从罗氏公司购买(瑞士巴塞尔)。针灸针(很多:212161123)从北京购买中研泰和医药有限公司有限公司(中国,北京)。EA设备(Yingdi kwd - 808)是购买从常州Yingdi电子医疗设备有限公司有限公司(杭州)。Phospho-IRS-1(酪氨酸895)抗体(很多:# 3070)和Phospho-IRS-1 (Ser 307)抗体(很多:# 2381)从细胞信号技术,购买公司(美国波士顿)。GLUT4多克隆抗体(很多:66846 - 1 - ig)和GAPDH兔多克隆抗体(很多:10494 - 1 - ap)从Proteintech购买集团公司(美国芝加哥)。

2.2。实验动物

实验动物7 SPF-level男性ZL (fa / +)大鼠体质量的140 - 160 g(2个月)和14 SPF-level男性ZDF (fa / fa)大鼠体质量的140 - 160 g的年龄相同。所有的动物(许可证号码SCXK(北京),2016 - 0006年)从北京购买Weitong利华国际实验动物科技有限公司有限公司动物被安置在一个动物设施在北京西苑医院23°C的环境控制与空气流通,相对湿度为60%,照明和12小时的日夜循环。实验开始后1周适应性喂养。适应后,所有的动物喂养上贴# 5008(成分:粗蛋白≥23.0%,粗脂肪≥6.5%,粗纤维≤4.0%,粗灰分≤10%,水分≤11.0%,≥0.65%,磷和钙0.75∼-1.25%;原料组成:玉米面粉,炮击大豆面粉、小麦面粉、鱼粉、麦麸,啤酒酵母,甘蔗糖蜜、麦芽、甜菜粉、燕麦面粉,面粉,大豆脱水苜蓿草粉、矿物质和维生素)。

2.3。模型制备

适应性喂养1周后上贴# 5008喂养4周,空腹血糖和OGTT 2 h血糖水平以上11.1更易/ L,二台(fa / fa)老鼠成为成功准备模型。总共14 ZDF老鼠作为模型动物。14 ZDF老鼠随机选择根据血糖水平由随机数字表法分为两组:模型组和electro-acupuncture组,每组7的老鼠。一个额外的7 zl (fa / +)大鼠作为对照组。

3所示。实验方法

3.1。干预

根据光纤光栅测量上贴# 5008喂养4周后,7 zl老鼠和14 ZDF模型大鼠随机分为3组,随机数字表法。他们是对照组(n= 7)、模型组(n= 7),电针刺激组(n= 7)。从分组的第一天,所有厂家不断给动物喂食# 5008。

3.1.1。对照组和模型组

动物被固定在松鼠标袋放置在手术台上,25分钟没有干预。

3.1.2。电针刺激组

动物被固定在松鼠标袋仍然允许四肢被扩展,5分钟。针灸针0.137毫米(无菌针灸针的中研泰和品牌)被用来针灸的双方Zusanli(圣36),Sanyinjiao (SP 6),脾俞(提单19),和Weiwanxiashu (B3)交货。针被插入的深度4 - 6毫米,连接到电针刺激仪器(一个电极连接到Weiwanxiashu (B3交货),而另一个电极连接到同侧Zusanli(圣36),形成一个循环),发射连续波15赫兹的频率和电流输出强度2马。它适用于大鼠肌肉稍微刺激老鼠吱吱叫。针保持20分钟,每周6次,4周。上述干预之间进行每日13:00和18:00为4周(周一到周六)。在第一周的干预,老鼠禁食20:00在周六夜间,然后老鼠测量的光纤光栅水平8:00在星期天的早上。

3.2。样品收集

干预后,所有的动物禁食22:00在晚上。第二天早上8:00,所有动物都麻醉45毫克/公斤剂量的2%戊巴比妥钠溶液之前被血液诱导法牺牲。5毫升的血液样本被从腹主动脉和收集在一个离心管,然后在室温下固化。血清是由离心分离在3000 r / min 15分钟4°C。液体上层清液是用来测试鳍与生化比色法。股四头肌肌肉的老鼠是收集在冰上,在液态氮冷冻,保存在冰箱里,为西方墨点法−80°C。

3.3。指标检测

IRS-1磷酸化的表达,在骨骼肌GLUT4蛋白免疫印迹检测。每组3样本选择随机根据光纤光栅取自−80°C冰箱,100毫克的股四头肌肌肉/样品。•瑞帕溶解产物以及蛋白酶抑制剂(磷酸酶抑制剂添加到磷酸化样本)被添加到样本,当时均质冰和左边站30分钟。在4°C和14000转离心后10分钟,上层清液中提取。然后加载缓冲区添加,煮10分钟,在冰和储存在冰箱里冷却−20°C。样本在sds - page凝胶电泳(100 V 75分钟),然后在100 V electrotransferred 75分钟,最后被稀释5%牛奶和在室温下的是90分钟。一夜之间主要抗体是孵化。第二天彩色膜,然后在二次抗体孵育,ECL(电化学发光)的解决方案是使用公开的抗体反应在黑暗的房间里。萤石化学软件被用来分析蛋白表达和磷酸化水平。使用GAPDH作为内部参考,GLUT4蛋白表达水平和IRS-1磷酸化的股四头肌。

3.4。统计分析

统计分析使用统计软件SAS 9.4,执行和结果表示为平均值±标准偏差(‾x±年代)。多个组之间的比较,如果它符合正态分布和方差是制服,然后使用方差分析。如果它不符合正态分布,Wilcoxon等级和测试使用。皮尔森相关测试被用来分析两个变量之间的统计相关性的样本属于正态分布。该数据具有统计上的显著差异。

(一)

(b)

(c)

(一)

(b)

4所示。实验结果

(1)结果显示变化的空腹血糖(FBG)、胰岛素(鳍)和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)在每个组。图1显示电针刺激组的空腹血糖水平高于对照组( );空腹血糖的电针刺激组低于模型组,差异显著( )。血清胰岛素水平的电针刺激组低于模型组,差异显著( )。胰岛素抵抗指数比较,可以看出,电针刺激的HOMA-IR组低于模型组,差异显著( )。胰岛素抵抗指数与血糖和胰岛素水平一致,从而表明电针刺激可以减轻骨骼肌胰岛素抵抗在2型糖尿病大鼠。(2)IRS-1酪氨酸、丝氨酸/苏氨酸磷酸化水平在每组:从数据可以看出2和3IRS-1丝氨酸/苏氨酸的磷酸化水平的模型组高于对照组,电针刺激组,差异具有统计学意义( )。之间没有显著差异控制组和电针刺激组( )。磷酸化表达的平均评分显示,对照组是最低的,电针刺激的是第二组,模型组表达最高。比较三组的磷酸化水平的网站IRS-1,酪氨酸895显示,模型组的磷酸化表达是最低的,并且与对照组相比差异显著,电针刺激组( )。之间没有显著差异控制组和电针刺激组( )。这些结果表明,电针刺激可以减少IRS-1磷酸化的丝氨酸/苏氨酸在大鼠骨骼肌,增加大鼠骨骼肌中酪氨酸磷酸化的表达。此外,从图可以看出4皮尔森相关分析表明,IRS-1酪氨酸、丝氨酸/苏氨酸是负相关(r=−0.951, )(3)GLUT4蛋白表达在每组大鼠:从数据可以看出3和5与对照组相比,模型组、电针刺激组的GLUT4蛋白的表达水平明显增加,和不同的是统计学意义( )。之间没有显著性差异,对照组和模型组( )。平均评分表明,电针刺激组蛋白蛋白质表达最高,其次是对照组,模型组最低表达式。这些数据表明,电针刺激对大鼠骨骼肌葡萄糖有一定积极影响交通。

5。讨论

针灸的功效在2型糖尿病的治疗中已经被大量的证实临床和动物实验以及记录在中国古代文学6- - - - - -8]。这个实验结合现代电针刺激治疗技术和多年的临床观察,成功地研究2型糖尿病大鼠模型。我们遵循相关性的理论在神经网络提供了一个依据穴位的选择在这个实验中(9]。相信back-shu点包括脾俞(提单19)和Weiwanxiashu (B3)交货的影响调节相应的内脏功能之间的密切关系的深层脊神经和自己的器官10,11]。Weiwanxiashu (EX B3)可以有效地改善胰脾功能。此外,Zusanli(圣36)和Sanyinjiao (SP 6)是最常用的穴位治疗2型糖尿病的临床试验和动物实验研究在中国12]。

这项研究的结果表明,空腹血糖、血清胰岛素水平和胰岛素抵抗指数的电针刺激组高于对照组,具有统计学差异( )。此外,对照组ZL老鼠基因型(fa / +)是不同于ZDF老鼠基因(fa / fa)模型组和电针刺激组和基因被认为是大差别的主要原因(13]。电针刺激组降低了导致上述三个指标与模型组相比(图1)。对照组表明电针刺激可以降低2型糖尿病大鼠的血糖和减轻骨骼肌胰岛素抵抗。当外围血糖升高,胰岛素与细胞膜表面受体结合,传输GLUT4外层细胞膜,与葡萄糖结合发挥其生物活性(14]。从数据3和5可以看出,GLUT4蛋白的表达水平在电针刺激组显著增加( ),表明电针刺激有影响血糖、改善胰岛素敏感性降低移植GLUT4的活动。作为一个内分泌激素,胰岛素介导的代谢调节主要通过激活磷脂酰肌醇3-kinase (PI3K)通路的胰岛素受体底物蛋白(15]。IRS-1磷酸化直接影响PI3K途径活性(16]。IRS-1有两种类型的磷酸化,包括酪氨酸、丝氨酸/苏氨酸。在胰岛素抵抗的情况下,抑制酪氨酸磷酸化丝氨酸/苏氨酸有竞争力,丝氨酸/苏氨酸307有一个重要的负监管影响胰岛素通路(17]。IRS-1酪氨酸、丝氨酸/苏氨酸是负相关的皮尔森相关分析(图4)。与此同时,从数据2和3可以看出,丝氨酸/苏氨酸307磷酸化水平的电针刺激组低于模型组( ),和895年IRS-1酪氨酸磷酸化水平的电针刺激组显示明显高于模型组( )。电针刺激的IRS-1丝氨酸/苏氨酸磷酸化水平降低2型糖尿病大鼠的骨骼肌和IRS-1酪氨酸磷酸化的表达增加大鼠骨骼肌。因此,表明的减轻骨骼肌胰岛素抵抗主要是通过调节IRS-1磷酸化之间的平衡,从而减少对下游通路的影响。

6。结论

电针刺激具有显著改善2型糖尿病的影响ZDF老鼠的胰岛素敏感性,有效地移植在骨骼肌GLUT4蛋白的表达。相关的机制是调节骨骼肌IRS-1丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸磷酸化水平。

缩写

光纤光栅:	空腹血糖
红外光谱:	胰岛素抵抗
印度卢比:	胰岛素受体
IRS-1:	胰岛素受体底物
女士:	平均评分
2型糖尿病:	2型糖尿病
二台:	Zucker糖尿病脂肪
ZL:	Zucker精益。

数据可用性

用来支持研究的数据可在补充文件。

伦理批准

研究协议是西苑医院医学伦理委员会批准,中国中医科学院,2018 xlc006-2。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

RL BYC构思和设计研究。SSS、JYZ YCK BGK, XY进行了实验。SSS写的手稿。RL BYC审查和编辑了手稿。所有作者阅读和批准了手稿。

确认

作者要感谢中国国家自然科学基金青年项目(批准号81704192)。

补充材料

补充材料包括光纤光栅的原始数据,鳍,HOMA-IR在“表1”,免疫印迹在世行的原始数据。(补充材料)

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