文摘

软骨下骨损伤,加速软骨变性的重要诱因,被认为是启动因素和潜在治疗膝骨关节炎(高雅)的目标。Acupotomy,生物力学疗法在中医经络理论的指导下,减轻软骨退化,纠正异常的力学。这是否机械acupotomy抑制效果高雅软骨下骨损伤是模糊的。本研究旨在探讨acupotomy在抑制软骨下骨吸收的影响,定义immobilization-induced高雅兔子的可能机制。高雅建模后,8组兔子(4 w / 6 w acupotomy 4 w / 6 w电针刺激,4 w / 6 w模型,和4 w / 6 w对照组)收到表示干预3周。组织学和骨骼histomorphometry分析表明acupotomy阻止软骨表面侵蚀和软骨下骨质流失。进一步acupotomy抑制破骨细胞活动和增强的高雅软骨下骨的成骨细胞活动,显示出显著减少的表达tartrate-resistant酸性磷酸酶(陷阱),矩阵metalloproteinases-9 (MMP-9)和组织蛋白酶K (Ctsk)和骨钙素的表达明显增加(OCN);本条例可能由阻塞减少osteoprotegerin NF -(功能)和增加受体激活蛋白配体(RANKL)。这些发现表明acupotomy抑制破骨细胞活性,促进成骨细胞活动改善极度活跃的软骨下骨吸收和软骨变性immobilization-induced高雅的兔子,这可能是由功能/ RANKL信号通路。综上所述,我们的研究结果表明,acupotomy可能有治疗潜力高雅通过恢复之间的平衡骨形成和骨吸收减弱软骨下骨损伤。

1。介绍

虽然软骨变性是最典型的膝骨关节炎的病理特征(高雅)[1];软骨下骨损伤高雅的关键作用近年来已逐渐成为一个颇受关注的领域(2,3]。越来越多的证据表明软骨下骨损伤可能是高雅的启动因素(4,5]。软骨下骨损伤,伴随着减少缓冲机械应力的能力,诱导和加速异常机械应力下的覆盖软骨变性(6,7]。临床研究已经证实,抑制软骨下骨软骨病变可以有效地减轻侵蚀(8,9),这暗示软骨下骨是一个潜在的治疗目标为保护软骨和治疗高雅。

高雅,过程中持续异常负载联合导致软骨下骨内裂隙,而启动骨重塑(10]。骨重建是干扰的结果之间的平衡骨形成和骨吸收。在早期高雅,由于异常激活破骨细胞(11在软骨下骨,骨重塑主要特点是极度活跃的骨吸收(12]。Osteoprotegerin / NF -(功能)受体激活蛋白配体(RANKL)是调节骨重建的关键路径(13,14),这主要是通过调节破骨细胞活动实现的。RANKL结合等级加速破骨细胞前体分化,促进破骨细胞成熟(15]。功能可以抑制破骨细胞活动通过阻断绑定级别和RANKL [16]。研究证实,可以有效地缓解通过调节骨吸收功能/ RANKL途径[17,18]。

软骨下骨吸收抑制作为高雅的治疗目标进行了广泛。骨质疏松抑制剂,如磷酸盐、治疗可能有效形式高雅通过抑制软骨下骨吸收(19]。然而,最近的荟萃分析表明,磷酸盐治疗的临床疗效仍有待验证(20.]。因此,非药物疗法抑制软骨下骨吸收值得广泛调查。

Acupotomy生物力学疗法的指导下中国传统经络理论。Acupotome,也称为miniscalpel-needle针灸,针灸是一个相当实践的最新发展。Acupotome结合针灸针插入的特点和手术切口对高雅和有明确的临床效果。acupotomy的生物力学效应的独特优势,它有别于其他高雅疗法。初步研究[21- - - - - -24)已经证实acupotomy可以防止软骨变性和延迟高雅病理队伍通过纠正异常高雅关节的机械应力。acupotomy chondroprotective效应相关高雅软骨下骨吸收的抑制作用?它是由功能/ RANKL信号通路调节软骨下骨破骨细胞活动吗?

基于这个假设,我们建立了高雅与Videman兔子模型的扩展固定方法探索acupotomy干预能否缓解高雅软骨下骨损伤通过抑制骨吸收,观察破骨细胞的活性生物标志物的变化和评价功能的影响/ RANKL信号通路在软骨下骨。

2。方法

2.1。道德声明

动物实验是严格依照处理的建议指导建议的实验动物保健和使用北京中医药大学(中国,北京)。协议是经伦理委员会批准的北京中医药大学动物实验。所有操作在戊巴比妥麻醉下进行,以确保疼痛最小化。

2.2。试剂和材料

一次性针灸针(规格:0.25×25毫米)从北京购买研究泰和药业有限公司有限公司(中国,北京)。HZ系列一次性acupotome(规格:0.4×40毫米)购买从北京优秀华友医疗器械有限公司,有限公司(中国,北京)。树脂绷带(5 #:150 mm×1800 mm)从衡水Kangjie购买医疗器械有限公司,有限公司(河北,中国)。整形铸造磁带(160系列带:5.0厘米×360厘米)是从苏州连接购买医疗科技有限公司有限公司(江苏,中国)。汉斯穴位神经刺激器(LH202H)是购自北京华为工业发展有限公司有限公司(中国,北京)。

Anti-OCN、anti-MMP-9 anti-GAPDH抗体买来Abcam生物技术有限公司(美国)。Anti-OPG和anti-RANKL抗体购自bios生物技术有限公司(美国)。辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体是由北京中山金桥生物技术有限公司(中国,北京)。Bicinchoninic酸(BCA)所提供的蛋白质化验设备和化学发光ECL试剂Beyotime生物技术有限公司(上海,中国)。鼠标聚合物方法检测设备购买从北京中山金桥生物技术有限公司(中国,北京)。试剂盒试剂和逆转录工具包提供的热费希尔生物技术有限公司(美国)。PCR SYBR Promega提供的绿色主混合生物技术有限公司(美国)。提供的商业陷阱工具包σ生物技术有限公司(美国密苏里州)。

2.3。动物和研究设计

56雄性新西兰白兔(6个月)大约2.5公斤的实验动物中心提供的北京Keyu科技有限公司有限公司(中国,北京)。兔子适应实验开始前一周,有无限的食物和水。动物生长在单独的笼子里,温度和湿度保持在(22±2)°C和50% - -60%,分别。兔子被随机分为8组如下:高雅的固定与车辆4或6周治疗(4 w模型组,n= 7;6 w模型组,n= 7),空白对照组相比4 w或6 w模型组与车辆治疗(4 w对照组,n= 7;6 w对照组,n= 7)引起的洋槐固定4周或6周acupotomy治疗(4 w acupotomy集团n= 7;6 w acupotomy集团n= 7),和高雅的固定与电针刺激治疗4周和6周(4 w电针刺激组,n= 7;6 w电针刺激组,n= 7)。

2.4。感应的高雅的兔子

修改后的Videman方法进行诱导洋槐模型。在操作之前,每只兔子禁食和剥夺水10到16小时;然后,兔子被静脉注射3%戊巴比妥钠麻醉(30毫克/公斤)到耳朵边缘静脉。麻醉后完成,每只兔子提出仰卧地在手术台上左后腿暴露出来。左后腿与树脂固定绷带从腹股沟到脚趾保持膝关节的扩展位置,和额外的双层整形铸造磁带加强固定包裹着;然后antibiting绷带是应用于最外层。在固定时期,肢体肿胀和模具脱落观察,调整和重新装设必要的。洋槐模型建立了有效的固定4周后在4 w模型组,4 w acupotomy集团和4 w电针刺激组和6周6 w模型组,6 w acupotomy组和6 w电针刺激组。兔子在4 w / 6 w对照组不进行任何操作。

2.5。Acupotomy和电针刺激干预

把绷带后4 w / 6 w acupotomy组,acupotomy干预3周每周进行一次。我们选择了4个点的固定干预点,位于股内侧肌的肌腱,股外侧肌、股直肌和股二头肌。此外,1 - 2节节点的肌肉纤维在膝关节伸肌和屈肌组织选择根据个人条件。常规消毒后,acupotome穿释放这些点。每一个点上的具体操作如下。(1)acupotome被垂直插入到肌腱插入皮肤,和叶片acupotome是肌腱的纵轴平行。当地粘附公布了肌腱和骨连接的方向纵向疏浚和横向剥离,每点1 - 2罢工;然后,按下点了几分钟后,acupotome被撤回。(2)acupotome的结节点插入到肌肉纤维通过搜索和定位结节点通过触诊膝关节周围的肌肉纤维。acupotome垂直插入到皮肤,和叶片acupotome是肌肉纤维的纵轴平行。 The local adhesion was released by longitudinal dredging and transverse stripping, with 1-2 strikes per point; then, pressing the points for several minutes after the acupotome was withdrawn.

把绷带后4 w / 6 w电针刺激组,电针刺激干预进行每隔一天3周。我们选择了四个穴位针插入点,也就是说,学海(SP10), Liangqiu (ST34) Neixiyan (EX-LE4)和Waixiyan (EX-LE5)。常规消毒后,针插入四个穴位。与韩寒的穴位电针刺激干预进行神经刺激器,连接SP10和ST34 EX-LE4 EX-LE5,分别。波形的频率密度和密度波:2/100 Hz,强度3 mA,每15分钟。在4 w / 6 w对照组和4 w / 6 w模型组,只有抓住和修复。动物人道牺牲后表示干预。

2.6。软骨组织学和Mankin得分

cartilage-subchondral骨中央股骨的负重区域复杂样品固定在4%多聚甲醛(武汉博士德,中国)24小时在4°C。所有的样品都在中性10% EDTA脱钙(武汉博士德,中国)4周。所有样品都是嵌入在石蜡与梯度酒精脱水后和浸没在二甲苯和石蜡。石蜡包埋的样本从矢状位置切割成5μ米厚的部分。软骨组织学分析,部分被沾染了红色染料O和快速绿色(Solarbio,北京)。病理学的部分进行评估的软骨变性修改Mankin评分系统(25双盲),独立的病理学家。

2.7。软骨下骨的形态学参数计算

软骨下骨的形态学参数的分析,部分被苏木精和伊红染色(他)(Solarbio,北京)使用标准的协议。五个领域被从每个部分和光学显微镜下拍照。骨组织静态参数包括组织区(T.Ar),小梁面积(Tb.Ar)和骨小梁周长(Tb.Pm)进行使用图像专业+ 6.0 (IPP)软件。根据T。基于“增大化现实”技术,结核病。基于“增大化现实”技术,和结核病。点数据,以下参数量化来表示骨骼结构:小梁面积百分比(BV /电视),小梁数目(Tb.N),并使用骨小梁分离(Tb.Sp) histomorphometry [26]。

2.8。Tartrate-Resistant酸性磷酸酶染色(陷阱)

破骨细胞生物标志物陷阱被应用到可视化破骨细胞的活性。部分都沾一个商业陷阱设备根据标准协议。一般来说,与梯度乙醇与二甲苯脱蜡和重组后,部分与陷阱固定剂固定解决方案在4°C 90秒然后孵化是双缓冲,GBC染色液、混合和陷阱缓冲区在37°C 60分钟。原子核在苏木精复染色2分钟解决方案。三个连续的部分从一个样本被染色,五个字段随机选择从每个部分。在软骨下骨地区TRAP-positive染色细胞被量化。

2.9。免疫印迹分析功能和RANKL

胫骨的软组织都剥夺了。胫骨的负重区,中部圆柱cartilage-subchondral骨复杂的组织(= 8毫米,高度= 10毫米)与圆钻被截获。软骨很快低温分离软骨下骨骨咬骨钳,然后样品很快被放置在液态氮。总蛋白提取的软骨下骨中使用超声破碎法里帕裂解缓冲含有1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Beyotime生物技术,中国上海),然后是蛋白质浓度计算bicinchoninic酸(BCA)蛋白试验设备(Beyotime生物科技、上海、中国)。相等的数量(50μg)电泳分离蛋白质的使用12%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide电泳(sds - page) (Solarbio,北京)凝胶,然后转移到0.45μ美国m PVDF膜(微孔)。随后,膜被封锁的5%脱脂牛奶在室温下2小时(RT)然后孵化功能主要抗体(1:500),RANKL(1: 500),和GAPDH(1: 1000)在一夜之间在4°C瓶。在TBST洗涤后,膜被孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体1小时在rt,最后,乐队的出现与化学发光ECL试剂。蛋白质分析了乐队使用的灰度值图像J软件(美国罗克维尔市)。

2.10。实时PCR分析功能,RANKL和Ctsk

的方法获得软骨下骨样本上面描述的一样。软骨下骨的总RNA提取使用试剂盒试剂。RNA是reverse-transcribed cDNA使用逆转录工具包。实时PCR, cDNA放大处理使用qPCR SYBR绿色主人混合。根据公布的序列,特定功能的PCR引物,RANKL和组织蛋白酶K (Ctsk)构造。目标基因的相对表达计算的方法和规范化GAPDH mRNA表达的。引物对5′-ATCATTGAATGGACAACCCAGG-3′, 5′-TGCGTGGCTTCTCTGTTTCC-3功能′,5′-GGTTCCCATAAAGTGAGTCTGT-3′, 5′-TTAAAAGCCCCAAAGTATG-3 RANKL′, 5′-CTTCCAATACGTGCAGCAGA-3′, 5′-TCTTCAGGGCTTTCT-CGTTC-3 Ctsk′, 5′-CCACTTTGTGAAGCTCATTTCCT-3′, 5′-TCGTCCTCCTCTGGTGCTCT-3 GAPDH′,分别。

2.11。免疫组织化学的分析功能,RANKL、OCN MMP-9

石蜡包埋标本准备检测功能的分布,RANKL、骨钙素(OCN)和矩阵metalloproteinases-9 (MMP-9)软骨下骨。免疫组织化学染色使用标准协议进行。短暂,部分持续燥热引起抗原检索柠檬酸缓冲(Solarbio,北京)15分钟,孵化与anti-OPG anti-RANKL, anti-OCN,或者一夜之间anti-MMP-9主要抗体,与HRP-conjugated二级抗体孵化20分钟,用显色反应(布朗)开发轻拍(Solarbio,北京)在黑暗中5 - 8分钟。五个字段被随机选中的每个部分。彩色的部分功能和RANKL被数确定积极染色细胞的数量,OCN的平均光密度和MMP-9计算。

2.12。统计分析

与SPSS统计分析软件(版本20.0,SPSS, Inc .)、芝加哥,美国),提出了均值±SD。多个比较组之间的差异通过最少的显著差异(LSD)测试,和那些在多个组织评估通过执行单向方差分析。被视为具有统计学意义的差异< 0.05和< 0.01。

3所示。结果

3.1。Acupotomy干预缓解高雅软骨损伤

番红精O-Fast绿色染色检测到没有病理侵蚀表面的软骨在4 w / 6 w对照组(数字1(A1)和1(B1))。4 w模型组软骨蛋白多糖的含量降低,体现了红色染料O染色的部分删除。明显的裂缝,纤维化,软骨细胞排列紊乱的表面被检测出软骨(图1(A2))。6 w模型组与广泛剥离,软骨细胞显著减少,骨折的不断延伸,和软骨细胞的萎缩和坏死,大规模删除红色染料O染色中检测出表面的软骨(图1(B2))。的删除红色染料染色,救援的软骨细胞排列紊乱,和一些裂缝和纤维化在表面的软骨观察4 w / 6 w acupotomy与相应的4 w / 6 w模型组(数字1(A3)和1(B3))。没有显著变化的删除红色染料染色,减轻软骨细胞排列紊乱,减少软骨细胞丧失、萎缩性软骨细胞和裂缝在表面的软骨观察4 w / 6 w电针刺激与相应的4 w / 6 w模型组(数字1(A4)和1(B4))。然而,删除红色染料O染色显著降低4 w / 6 w acupotomy组与相应的4 w / 6 w电针刺激组。此外,Mankin评分结果显示,显著增加4 w / 6 w模型组(< 0.01)与相应的4 w / 6 w相比对照组,虽然明显下降(< 0.01)在4 w / 6 w acupotomy和电针刺激与相应的(图4 w / 6 w模型组1 (c))。此外,它显著减少(< 0.01)在4 w / 6 w acupotomy相比(图4 w / 6 w电针刺激组1 (c))。这些结果表明acupotomy和电针刺激干预措施减轻软骨损伤高雅的兔子。早期干预,效果就越好。此外,acupotomy高雅软骨上的保护作用优于电针刺激。

3.2。Acupotomy干预抑制软骨下骨质流失在高雅的兔子

软骨下骨的形态学参数由他彩色部分介绍了数字计算2(一个)和2 (b)。结核病。基于“增大化现实”技术,结核病。点,结核病。N, BV /电视明显减少,和结核病。Sp显著增加4 w / 6 w模型组(< 0.01)与相应的4 w / 6 w相比对照组,而结核病。基于“增大化现实”技术,结核病。点,结核病。N, BV /电视显著增加(< 0.01)和结核病。Sp显著减少4 w / 6 w acupotomy和电针刺激与相应的4 w / 6 w模型组。此外,除了结核。6 w acupotomy组Ar,结核病。基于“增大化现实”技术,结核病。点,结核病。N, BV /电视明显增加和结核病。4 w / 6 w Sp明显减少acupotomy集团(< 0.01)与相应的4 w / 6 w电针刺激组(数据2 (c),2 (d),2 (f)- - - - - -2 (h))。这些数据表明,在高雅兔子固定4周,引起的病变开始出现在软骨下骨的微观结构,主要表现为小梁破坏和骨量减少,并逐渐加剧,直到模型建立了6个星期。acupotomy或电针刺激干预后,软骨下骨的相关参数结构明显改变,表明这两种干预措施能有效地抑制软骨下骨吸收的高雅的兔子。显然,acupotomy可以更好地抑制活跃在高雅软骨下骨骨吸收。

3.3。Acupotomy干预成骨细胞活动增强,高雅软骨下骨

免疫组织化学分析检测的低表达在软骨下骨OCN 4 w / 6 w对照组(数字3(A1)和3(B1))。两个4 w和6 w模型组显示更高的OCN表达式(< 0.01)较对照组4 w和6 w(数字3(A2)和3(B2))。正如预期的那样,OCN的表达在4 w / 6 w acupotomy和电针刺激组显著提高(< 0.01)比在相应的4 w / 6 w模型组,虽然它是显著增加(< 0.01,< 0.05)4 w / 6 w acupotomy组与4 w / 6 w电针刺激组(数据3(A3) -3(A4)和3(B3) -3(B4))。这些结果表明,OCN补偿激活在高雅受损的软骨下骨。针灸或电针刺激干预后的upregulation OCN表示,延迟骨吸收增强成骨细胞活动的洋槐软骨下骨。Acupotomy干预可以明显提高成骨细胞活动移植OCN表达高雅软骨下骨。

3.4。Acupotomy干预抑制破骨细胞的活性在高雅软骨下骨

MMP-9免疫组织化学染色结果与陷阱染色结果一致。TRAP-positive和MMP-9-positive细胞偶尔观察到在软骨下骨4 w / 6 w对照组(数字4(A1) -4(D1))。TRAP-positive的数量在软骨下骨细胞和MMP-9-positive细胞显著增加4 w / 6 w模型组(< 0.01)与相应的对照组4 w / 6 w。很明显的结果TRAP-positive和MMP-9-positive细胞数量的增加更明显的方式在6 w模型组,表明更健壮的软骨下骨吸收的发生(数字4(A2) -4(D2))。4 w / 6 w acupotomy和电针刺激组显著降低(< 0.01)表达的陷阱和MMP-9与相应的4 w / 6 w模型组。此外,陷阱的表达和MMP-9 4 w / 6 w acupotomy组明显降低(< 0.01)比在相应的4 w / 6 w电针刺激组(数据4(A3) -4(D3)和4(A4) -4(D4))。Ctsk mRNA的表达进一步确认结果。然而,没有差别(> 0.05)在Ctsk mRNA的表达4 w / 6 w acupotomy和电针刺激组(图4 (g))。这些结果表明陷阱,MMP-9 Ctsk的软骨下骨在immobilization-induced高雅兔子所指,破骨细胞是高度活跃,骨重建发生主要与骨吸收。通过下调表达的陷阱,MMP-9 Ctsk, acupotomy或电针刺激干预抑制破骨细胞的活性,抑制软骨下骨吸收。

3.5。Acupotomy干预调节功能/ RANKL通路高雅软骨下骨

功能和RANKL的表达变化量化使用实时PCR,免疫印迹和免疫组织化学。实时PCR试验的结果表明,mRNA的表达功能显著下降(< 0.01,< 0.05)4 w / 6 w模型组与对照组相应的4 w / 6 w,虽然它是显著增加(< 0.01)在4 w / 6 w acupotomy和电针刺激组与4 w / 6 w模型组。然而,acupotomy干预进一步有效地促进了mRNA的表达功能(< 0.01)相比,电针刺激干预(图5(一个))。正如所料,RANKL的mRNA表达4 w / 6 w模型组显著增加(< 0.01)与相应的4 w / 6 w相比对照组,虽然明显下降(< 0.01)在4 w / 6 w acupotomy和电针刺激组与4 w / 6 w模型组。Acupotomy干预进一步有效地抑制RANKL的mRNA表达(< 0.01,< 0.05)相比,电针刺激干预(图5 (b))。功能的免疫组织化学染色和RANKL进一步确认结果(图6)。功能和RANKL蛋白质的表达水平之间的信使rna的结果是一致的与4 w / 6 w模型和对照组。只有功能蛋白表达显著调节(< 0.05)之间的4 w acupotomy和4 w模型组,虽然没有差别(> 0.05)之间的6 w acupotomy组和6 w模型组。(没有区别> 0.05)在功能蛋白表达之间的4 w / 6 w电针刺激组和4 w / 6 w模型组。功能蛋白表达也没有显著差异(> 0.05)在4 w / 6 w acupotomy和电针刺激组(数字5 (c)- - - - - -5 (e))。RANKL蛋白表达显著下降(< 0.01)在4 w / 6 w acupotomy和6 w电针刺激组与4 w / 6 w模型组。只有RANKL蛋白表达显著下降(< 0.05)6 w acupotomy组与6 w电针刺激组(数字5 (c),5 (d),5 (f))。免疫组织化学和免疫印迹结果还显示,功能/ RANKL的比例显著下降4 w / 6 w模型组较对照组4 w / 6 w(数字5 (g)和6 (g)),表示高雅软骨下骨高度活跃的破骨细胞和骨吸收。功能/ RANKL的比例也显著增加4 w / 6 w acupotomy比4 w / 6 w模型组。这些结果表明acupotomy软骨下骨吸收抑制可能产生减少破骨细胞的活性功能通过/ RANKL通路在高雅的兔子。

4所示。讨论

软骨下骨损伤的洋槐过程中发挥着不可或缺的作用,这对加速软骨退化被认为是至关重要的。在生理条件下,软骨下骨作为关节软骨的机械支撑,可缓冲和分散机械应力的联合预防软骨损伤,局部应力集中(27]。持续异常引起的机械负荷高雅膝关节软骨下骨质病变是最常见的引发剂(10]。当这种不正常的机械负荷超过软骨下骨的生理疲劳,它最终将导致软骨下骨微裂缝和启动骨重建28]。软骨下骨损伤将削弱其机械强度和相应的缓冲机械应力的能力(29日),增加软骨损伤的风险,加快了高雅的过程。先前的研究已经发现,增加了软骨下骨质流失的软骨侵蚀水平呈正相关,高雅(30.,31日]。

促进受损的软骨的修复仍然高雅疗法的核心。策略提出了缓解高雅软骨退化通过抑制软骨下骨改建,包括雌激素,磷酸盐,锶ranelate,组织蛋白酶K抑制剂。然而,目前的骨代谢疗法临床疗效仍有一定的局限性。当前可用anti-osteoporotic药物可以改善软骨下骨通过抑制骨吸收的射线结构在某种程度上,但没有人可以阻碍高雅在临床实践的进步12]。机械载荷作用的软骨下骨重建和损伤修复已逐渐关注的。研究表明,一个合适的机械负荷可以有效地抑制KOA-induced软骨下骨骨质疏松和骨量减少(32- - - - - -34),从而阻碍高雅队伍。基于证据表明,机械载荷参与骨骼和调节骨重塑的发病机理(35,36),生物力学疗法已成为一个新兴的高雅治疗方法影响软骨下骨。然而,acupotomy生物力学疗法是否足以防止或逆转KOA-induced软骨下骨损伤没有被直接调查。的生物力学影响acupotomy已在我们的初步研究21- - - - - -24]。众所周知,肌肉功能障碍,表现为肌肉力量减弱,减少肌肉组织的协调,是高雅膝盖机械不平衡的一个至关重要的原因37]。我们选择在膝盖肌腱acupotomy干预点纠正异常膝关节的力学环境通过调节muscle-tendons的机械功能,其次是有效地激活整合素β1 (22)、软骨细胞的关键机械感受器和下游FAK-PI3K机械信号通路(21),抑制软骨细胞细胞外基质的降解,促进软骨细胞增殖在高雅的兔子24]。这种关节内的良性的机械负荷改善高雅软骨下骨损伤通过功能/ RANKL acupotomy干预后机械信号通路?良性的抑制机械负荷对软骨下骨重塑有助于chondroprotective acupotomy的影响?

固定膝关节的高雅模型归纳是一种广泛使用的方法(38),已应用于研究针灸治疗的高雅。在先前的研究中,我们发现,固定膝关节的兔子诱发关节刚度,以被动的活动范围(舞会),和软骨侵蚀与广泛的软骨下骨骨髓水肿整体观察到核磁共振(24),伴随着COL-II的表达式和Aggrecan软骨(21]。此外,软骨寡聚基质蛋白(COMP),高雅软骨降解的生物标志物,明显增加血清的兔子(24),这是符合浆液COMP高雅的患者中观察到的变化(39]。在这项研究中,明显的软骨侵蚀,重要的删除红色染料染色,观察和软骨下骨破坏后4到6周的固定。这些指标表明,OA-like软骨病变和软骨下骨的破坏可以复制在兔子固定膝关节类似于人类的临床病例观察到的现象(图1)。

证据表明,软骨表面缺陷,删除红色染料染色,和软骨细胞排列紊乱,由形态学观察,逐渐恶化高雅软骨诱导固定4和6周;这些症状都伴随着一个连续增加Mankin得分,表明高雅的快速发展。我们发现acupotomy和电针刺激干预成功防止软骨变性和有效地减少Mankin得分。然而,纠正异常力学的增强acupotomy似乎更有效地减缓软骨侵蚀,也不干预可能完全扭转软骨的病理变化。这些数据进一步支持直接影响acupotomy和电针刺激促进高雅软骨修复(图1)。

以前在大量研究报道,增强骨吸收是最高雅软骨下骨的典型病理特征(40],它体现了显著降低结核病。N和BV /电视和显著增加结核病。周效磺胺-乙胺嘧啶(34,41]。软骨下骨结构的研究澄清,改善高雅通过抑制减少结核病。N和BV /电视和结核病的增加。Sp是一种有效的方法来缓解高雅软骨变性(42,43]。他染色是用来调查acupotomy干预对骨骼结构的影响(43]。明显的软骨下骨破坏模型组表明结核病。基于“增大化现实”技术,结核病。点,结核病。N, BV /电视明显减少和结核病。Sp显著增加。此外,通过观察软骨下骨的改变高雅模型由4或6周的固定,骨破坏逐渐增加。骨结构属性的进一步的研究证明acupotomy或electroacupuncture-treated兔子已经显著地提高BV /电视和结核病。N和降低结核病。Sp与兔子模型组相比。然而,无论是在4 -或前六周的组中,对软骨下骨破坏acupotomy抑制的影响是优越的。据我们所知,这是第一个研究表明acupotomy干预immobilization-induced高雅兔子改善软骨下骨的形态学参数,表明acupotomy可以抑制高雅软骨下骨质流失。根据每组软骨的病理Mankin得分,软骨下骨质流失的减少伴随着软骨损伤的改善,表明acupotomy干预缓解高雅软骨退化通过抑制软骨下骨损伤。与电针刺激相比,在抑制acupotomy显示了优越的效果高雅软骨下骨重塑纠正异常机械负荷的联合(图2)。

的潜在机制acupotomy干预抑制软骨下骨损伤?高雅软骨下骨重塑的起始是加上混乱的骨吸收和骨形成之间的平衡44]。破骨细胞第一次激活增强骨吸收破坏骨区域(3,45]。软骨下骨质流失,降低结核病。N和BV /电视和增加结核病。Sp,活跃的破骨细胞骨吸收的二次结果早期亚(46]。激活破骨细胞是一个中心事件和驱动力在软骨下骨损伤的发病机制,而抑制破骨细胞活动有助于防止骨吸收和高雅队伍(40,47]。结合,RANKL促进破骨细胞的成熟和分化,激活osteoclastogenesis相关信号通路,从而促进osteoclast-specific基因的表达包括陷阱,MMP-9, Ctsk [48]。研究表明,通过下调MMP9的表达,陷阱(49],Ctsk [50),osteoclastogenesis可以抑制破骨细胞活动局限于减少高雅软骨下骨吸收。在我们的研究中,破骨细胞通常被激活,表明陷阱和MMP-9-positive细胞和Ctsk mRNA的表达显著增加在软骨下骨的高雅的兔子。此外,破骨细胞活动继续增加固定的扩展,这是符合软骨下骨的形态学参数的变化。破骨细胞活动的进一步分析表明,acupotomy或electroacupuncture-treated兔子有显著减少的陷阱和MMP-9-positive细胞和Ctsk mRNA的表达。在四周和六周immobilization-induced高雅兔子acupotomy在围比电针刺激破骨细胞活动更有利。我们的研究结果进一步证实了这一发现,acupotomy干预是足以抑制高雅软骨下骨损伤通过下调MMP9的表达,陷阱,Ctsk抑制破骨细胞活动(图4)。

为了进一步确认acupotomy抑制骨吸收,osteoblast-specific基因的表达OCN检查。成骨细胞是骨形成的必要条件,为成骨细胞分化(OCN是必不可少的51]。OCN的内容直接回应成骨细胞活动和骨形成率。虽然在高雅软骨下骨成骨细胞是补偿性激活,它完全不足以扭转连续增加活跃的破骨细胞。此外,与固定的延伸,成骨细胞活动持续减少,减少反射的OCN表达式,表明骨吸收之间的平衡的破骨细胞和成骨细胞的骨形成破碎immobilization-induced高雅的兔子。一项研究表明,低表达OCN观察到高雅软骨下骨严重骨质疏松,导致骨形成减少[52),同时增加的内容受损的骨头(OCN可以有效地促进成骨细胞活动53]。我们的研究表明,acupotomy和电针刺激有效地促进骨形成通过激活OCN表达式。为期6个月的四周和immobilization-induced高雅中兔子,acupotomy比电针刺激更有利促进成骨细胞活动。我们的研究结果进一步证实了这一发现,acupotomy干预是优越的动态平衡的恢复监测骨吸收和成骨细胞的骨形成高雅软骨下骨(图所示3)。

如何acupotomy干预调节破骨细胞活动仍有待确定。成熟,分化和破骨细胞活动的功能/ RANKL通路。的行为功能和RANKL在受损的软骨下骨以来一直密切调查高RANKL的表达和功能的表达的下降已观察到高雅(54]。研究表明,封锁RANKL的上升和下降功能防止过度活跃的破骨细胞和抑制骨吸收55,56]。此外,功能/ RANKL比率是一个最好的生物标记与骨破坏相关的病理特征(57]。以前在大量研究报道,功能/ RANKL机械敏感信号通路(58,59]。良性的机械刺激可增加高雅软骨下骨的功能/ RANKL比率,这有效地抑制破骨细胞活性和骨吸收(60]。我们先前的研究[21)已经证实acupotomy干预激活FAK-PI3K机械途径来缓解高雅软骨退化,纠正异常的机械应力。然而,这是否良性机械刺激能促进软骨下骨康复KOA-induced骨吸收的功能/ RANKL途径还有待探索。在我们的研究中,增加RANKL信使rna和蛋白质的表达和功能mRNA和蛋白表达降低以高雅软骨下骨。固定6周显示高RANKL和低功能表达式,提出一个改进的破骨细胞骨吸收活动和强大。获得的结果与实时PCR和免疫组织化学染色显示,acupotomy或electroacupuncture-treated兔子RANKL的表达明显减少,显著增加功能的表达。然而,免疫印迹结果表明acupotomy干预调节功能的减少蛋白质和蛋白质表达下调RANKL的增加,而电针刺激干预效果很差。正如所料,功能/ RANKL比率由免疫印迹和免疫组织化学基本一致的表达osteoclast-specific基因陷阱,MMP-9, Ctsk。这些数据证实,良好的机械应力后acupotomy干预有效地抑制功能的增加在RANKL和减少高雅软骨下骨。Acupotomy,生物力学疗法,可以通过功能/广泛限制过度活跃的破骨细胞RANKL机械信号通路抑制骨吸收的高雅软骨下骨(数字5和6)。

本研究具有以下限制。首先,积极的药物组不是acupotomy设置为对照组,而是电针刺激组。基于许多报道(12,20.),骨代谢监管机构由磷酸盐治疗只能抑制软骨下骨吸收的高雅动物模型和临床疗效一直令人失望。考虑使用高雅的软骨下骨为切入点,来探讨acupotomy治疗高雅的机制从生物力学的角度,全面评估可操作性在这项研究中,电针刺激可能是目前最合适的对照组。电针刺激,通常有效的疗法,也是一种非手术和非药物干预治疗高雅。此外,电针刺激的介入点的位置和acupotomy关闭。如果有一个更可行的生物力学疗法可以用作对照组在未来,我们将继续进行深入研究。第二,我们成功建立了六周的高雅模型固定在前面的研究中,这与早期和中期发展阶段高雅病变是相一致的。在当前的研究中,针对软骨下骨的动态病理变化发展的高雅,我们建立了immobilization-induced高雅模型4和6周评价疗效的acupotomy软骨下骨损伤发病的高雅早期和中期发展阶段高雅。在后续研究中,我们应该继续延长膝关节固定的时间到8甚至12周动态观察监管acupotomy对软骨下骨重塑的影响在整个发病机制的高雅。

5。结论

总之,我们发现acupotomy抑制破骨细胞活性,促进成骨细胞活动改善极度活跃的软骨下骨吸收,减轻软骨变性immobilization-induced高雅兔子,这可能是由功能/ RANKL信号通路。acupotomy产生chondroprotective效应的机械效应减轻高雅软骨下骨损伤,这可能提供原始见解的治疗高雅acupotomy和小说在高雅的生物力学治疗治疗方法。

数据可用性

数据支持本研究的结论可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

通王,郭岩贡献了同样的工作。

确认

这项工作是支持的研究经费来自中国国家自然科学基金(批准号81874504)和北京自然科学基金(批准号7192110)。