文摘
心血管疾病(CVD)的发病率和死亡率都较高。研究表明,大多数患者有慢性肾脏疾病(CKD)死于心血管并发症。临床病理生理状态,心脏病和肾病是因果和相互影响叫做cardiorenal综合症(CRS)。心肌肥厚是心脏结构的关键阶段可逆和不可逆的变化。这是一个心力衰竭的重要病理生理基础。因此,本研究拟从CKD的终末期尿毒症阶段构造尿毒症的动物模型大鼠研究尿毒症的关系,TLR4 / MyD88信号通路和心肌肥大。结果表明,尿毒症的老鼠显示体重增加缓慢和稀释剂。在12周(w)、尿毒症大鼠血清肌酐和尿素氮的增加,以及全球肥大指数增加。检测toll样受体的表达4 (TLR4)和骨髓分化因子(MyD88)在大鼠的血液样本,我们发现TLR4的表达和MyD88增加12 w尿毒症组;病理观察显示,在4周的尿毒症模型大鼠肾组织代偿性肥大,肾纤维膜增生,肾实质萎缩,大量的间质纤维增生和炎症细胞浸润,和蛋白质在肾小管被观察到。 Myocardial cells were obviously hypertrophy and disordered. At 12 w, renal tubules were obviously expanded, the epithelium was flat, the brush border disappeared, and the interstitial fibrous connective tissue of the myocardial tissue was proliferated. The detection of TLR4 and MyD88 in kidney tissue and myocardial tissue revealed that the positive expression of TLR4 and MyD88 gradually increased over time. Therefore, the final result of the study is that uremia can gradually lead to myocardial hypertrophy and TLR4 and MyD88 are highly expressed in serum, kidney, and myocardial tissues of uremic rats, suggesting that TLR4 and MyD88 may be related to the degree of uremic disease and the myocardium caused by it. Hypertrophy is related.
1。介绍
目前,心血管疾病(CVD)的发病率和死亡率高,在上升,尤其是在慢性肾脏疾病(CKD)患者,其中大部分死于心血管并发症。晚期CKD患者死亡率的复杂化学汽相淀积10 ~ 30倍高于一般人群(1]。尿毒症患者死于心血管并发症占尿毒症死亡人数的50%以上。然而,直到现在,临床医生普遍认识到心血管事件在CKD患者死亡的主要原因。CKD患者往往有高血压和血脂异常2]。高血压和血脂异常是主要的危险因素为血管内皮细胞功能受损和动脉粥样硬化的进展。Upregulation炎性因子和激活肾素血管紧张素醛固酮系统(老城)在慢性肾病病人反过来增加活性氧的产生,加速动脉粥样硬化的进展,并导致冠状动脉粥样硬化性心脏病。心力衰竭的发生率、中风和外周动脉疾病增加了。简而言之,CKD会增加心血管疾病的发病率和死亡率,心血管疾病的预防和治疗在慢性肾病患者的管理尤为重要3]。
CKD促进血管内皮细胞功能的损伤和动脉粥样硬化的进展通过各种方式和增加心血管事件的发生。相反,肾血管内皮细胞功能受损和肾动脉粥样硬化的进展也会加速肾功能衰竭。临床病理生理状态,心脏病和肾病是因果和相互影响叫做cardiorenal综合症(CRS) [4]。CRS的概念有助于深入研究心血管疾病的病理生理机制的互动和CKD, CKD患者的诊断和治疗心血管疾病,并改善患者的预后。心肌肥厚是心脏功能的进化从代偿阶段到失代偿阶段的心脏疾病,如高血压、瓣膜病和心脏结构的改变的关键阶段可逆和不可逆。心力衰竭的重要病理生理基础,但到目前为止的分子机制和细胞信号转导机制引起的心肌肥大尿毒症还不是很清楚。
toll样受体4 (TLR4)是研究最多的toll样受体;主配体脂多糖(LPS)、呼吸道合胞体病毒蛋白质,lipoteichoic酸(5]。TLR4可以激活炎症因子的转录和合成通过骨髓分化因子88 (MyD88)依赖的信号通路或non-MyD88-dependent信号通路和炎症的产生密切相关的因素。王等人。6)和其他的研究发现,高葡萄糖的增加可以刺激TLR4表达近曲肾小管上皮细胞在小鼠体内。在高糖环境下,MyD88-dependent TLR4信号通路被激活时,表明TLR4与糖尿病肾病炎症有关。Kaur et al。7]发现TLR4的表达和MyD88在小鼠肾小球系膜细胞刺激高葡萄糖增加,进一步促进了糖尿病肾病的发生。另一方面,在通常,心脏是最高的表达TLR4 [8]。研究发现,在TLR4基因敲除小鼠,心脏肥大的程度由压力引起过载是削弱9]。的TLR4-mediated MyD88-dependent核因子-κB (NF -κB)通路参与心脏肥大的规定(10]。阻塞MyD88可以减少心脏肥大的程度在活的有机体内(11]。
针对这一点,本研究拟从CKD的终末期尿毒症阶段,构造一个尿毒症的大鼠动物模型,并研究尿毒症的关系,TLR4 / MyD88信号通路和心肌肥大,这将有助于进一步阐明尿毒症引起的心肌。肥大的发病机制也有利于改善心肌肥厚的预防和治疗,从而有效地减少社会和家庭的负担。
2。材料和方法
2.1。材料和试剂
toll样受体4 (TLR4)检测设备(酶联免疫吸附试验(ELISA)), SEA753Ra,和骨髓分化因子(MyD88)检测设备(ELISA), SEB707Ra,从武汉购买一致;苏木精(σ,货号:H9627,批号:SLBN3249V);曙红(σ,货号:E6003,批号:62 r80915x);MyD88抗体(圣公司,产品编号:sc74532,批号:F2218);TLR4抗体(Abcam,产品编号:ab22048,批号:GR271814);二次抗体(兔子工具包,北京中山金桥生物技术有限公司有限公司产品目录号:pv - 6001,批号:K167722B;鼠标设备,北京中山金桥生物技术有限公司有限公司产品目录号:pv - 6002,批号:K1566171);自动生化分析仪(罗氏Cobas,模型:C501);吸管(北京大隆兴创实验仪器有限公司);整个波长标(SpectraMax + 384,美国医学博士); rotary microtome (RM2235, LEICA company, equipment number: HB215); pathological tissue bleaching and drying instrument (Tec 2500, Changzhou Haosilin Instrument Equipment Co., Ltd., equipment number: HB121); microscope (type BX43, Olympus company, equipment number: HB133); and water-proof constant temperature incubator (type PYX-DHS500BS-II, Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., Ltd., equipment number: HB123).
2.2。动物源
25雄性SD大鼠的SPF级,体重200 - 220克,购自上海松弛实验动物有限公司有限公司(许可证号码:SCXK(上海)2017 - 0012,证书号码:03726769)。是使用的饮用水消毒二级超纯水。饮用水的质量符合国家饮用水卫生标准的要求的中华人民共和国(gb5749 - 2006)。实验动物房的牌照号码SYXK(浙江)2015 - 0008。环境:温度范围是20∼25°C,和相对湿度范围是40∼70%。
2.3。动物模型(12]
在这个实验中,肾切除术是用于建立尿毒症的老鼠模型来评估对大鼠心脏的影响。25个老鼠分为3组:正常对照组(n= 6),模拟手术集团(n= 6),尿毒症组(n= 13)。正常对照组没有收到任何干预,和模拟手术集团只是削减。腹腔开放没有肾切除术;尿毒症组的老鼠受到5/6肾切除术的建模。每组测试后4周(w)和12 w。大鼠麻醉和固定在仰卧位。腹部是准备和消毒,减少中间的腹部。右肾血管分离,肾动脉和肾静脉结扎,右肾完全移除。左肾的上下两极都删除了1/3。止血后,腹部被关闭和100000单位的青霉素肌内注射预防感染。
2.4。把材料
三只老鼠在每次收集。血从老鼠麻醉后腹主动脉。血清分离在3500 rpm(8厘米)10分钟的内容来确定血清尿素氮和肌酐。TLR4的表达差异和MyD88血清ELISA检测。心很重,全球肥大指数计算,心脏肥大的程度进行评估。大鼠肾脏与4%甲醛固定他染色和免疫组织化学;心与4%甲醛固定他染色和免疫组织化学。
2.4.1。生化检测
大鼠麻醉后,血液从腹主动脉和血清分离在3500 rpm 10分钟。血清尿素氮和肌酐的变化每组大鼠用自动生化分析仪检测。
2.4.2。全球肥大指数的测定
老鼠的重量是指出,老鼠的胸腔很快打开获得心脏,心房组织被移除,地表水与生理盐水冲洗,地表水与滤纸吸收。电子天平称重全心来计算整个心脏重量/体重,记录整个心脏肥大指数。
2.4.3。ELISA实验
利用ELISA检测TLR4的表达和血清中MyD88。ELISA试剂盒的平衡被放置在室温下,融化在室温和血清样本,以避免反复冻融。50×用去离子水清洗解决方案准备1×清洗解决方案。1毫升标准稀释是添加到标准井,和标准稀释用于梯度稀释。示例添加和孵化37°C 1小时。液体被丢弃,旋干。增加100μL检测试剂的工作解决方案的每个(立即准备使用前)和孵化在37°C 1 h。丢弃的液体,加350μL 1×洗涤缓冲每个洗,浸泡1 - 2分钟,利用酶在吸水纸上。目标板是删除所有的液体,和重复板洗3次。洗涤缓冲倒洗后,剩余的液体被吸收。100年μL检测B工作方案(使用前准备立即)被添加到每个在37°C和孵化1 h。液体被丢弃,干,洗了5次。90年μL(三甲衬底的解决方案是添加到每个37°C,孵化出了30分钟(当第一个三个标准井有明显的渐变颜色,最后三个井不明显,反应可以终止)。确保没有气泡后,水滴在每个好,使用微型板块读者阅读统计在450海里。
2.4.4。他染色:肾组织和心肌组织的部分
被撤的组织固定剂解决方案和修剪一个适当的形状和厚度;组织块脱水80%,90%,95%,和100%乙醇、100%乙醇二世和100%乙醇三世。上面的试剂可以用于染色过程。然后,嵌入进行了组织是嵌入在石蜡根据材料的原则一面朝下。蜡块冷却和凝固后,它是存储在−20°C和冷藏。切片。厚度是4μm。这些部分分别在65°C温度6 - 12小时,脱蜡、水化,沉浸在5分钟在室温下的苏木精染色解决方案,并为1分钟沾自来水。沉浸在1%盐酸酒精的部分解决方案几秒钟和自来水,直到组织变成了蓝色。然后,部分被伊红染色法染色的解决方案。载玻片上的浮动的颜色被用自来水冲洗3 - 5分钟。上面的试剂可以用于染色过程。细胞核染色结果如下:蓝色或紫色蓝色,细胞质是粉红色,红细胞是鲜红色的。样品在显微镜下观察,和一个全面的病理描述样例的症状。
2.4.5。免疫组织化学
免疫组织化学是用来检测TLR4和MyD88在肾组织的积极表达和心肌组织。肾组织部分和心肌组织部分与二甲苯deparaffinized,水化与梯度酒精孵化H为3%2O2在37°C 15分钟,用PBS为3×5分钟块和内源性过氧化物酶的灭活。切片煮在0.01 M柠檬酸缓冲(pH值6.0)10分钟,冷却到室温,冲洗和PBS 3×5分钟。主抗体(TLR4(1: 200)和MyD88(1: 75)添加一滴一滴地,一夜之间在冰箱里孵化在4°C,平衡在室温下30分钟,冲洗3×5分钟。二级抗体添加一滴一滴地,孵化37°C 30分钟,用PBS 3×5分钟洗净(PBS代替主要的抗体是一种消极控制)。DAB染色,反应是在显微镜下观察到的进度,然后用自来水充分冲洗;苏木精是counter-stained,那么干,安装和拍照。MyD88和TLR4积极表达的光密度测量Image-Pro +。五个领域的观点为每个样品测量,最后的结果是用平均值±标准偏差表示。
2.5。统计数据
实验数据被表示为均值±标准差、方差分析和统计检验中使用多组的分析意味着GraphPad棱镜统计软件。首先,数据方差的同质性测试;如果方差制服,采用单向方差分析。统计方法被用来比较意味着多个剂量组和对照组之间。nonnormality或凹凸不平的方差被用于统计数据而不是等级和测试。 意味着数据在统计上是不同的。
3所示。结果
3.1。一般的描述
共有13个尿毒症老鼠模型,其中5老鼠死了。死老鼠并不包括在统计,8大鼠模型组。尿毒症的老鼠显示体重增加缓慢和稀释剂。
3.2。小鼠血清尿素氮和肌酐的变化
结果表明,没有差别在大鼠血清肌酐和尿素氮水平在每组4 w 。12 w,血清肌酐和尿素氮的老鼠尿毒症组高于正常对照组和模拟外科组和高于4 w尿毒症组,差异具有统计学意义 ,如数据所示1(一)和1 (b)。
(一)
(b)
3.3。在大鼠心肌肥厚指数进行比较
结果表明,无统计差异在每组大鼠的心肌肥厚指数在4 w 。在12 w,尿毒症组大鼠的心肌肥厚指数高于正常对照组和模拟手术,和数据具有统计上的显著差异 ,如数据所示2(一个)和2 (b)。
(一)
(b)
3.4。观察病理的老鼠
结果表明,肾脏没有明显的病变组织和正常对照组心肌和模拟外科组,但4 w尿毒症组肾组织代偿性肥大,可见肾纤维膜增生,肾实质萎缩,大量的纤维间质。增生、炎症细胞浸润和蛋白质可以看到在肾小管。心肌细胞明显肥大,排列是无序的。12 w,尿毒症组肾小管明显扩张,上皮细胞扁平,刷状缘消失,间质纤维结缔组织的心肌组织。其余的病变是一样的在4 w尿毒症组,如图3。
3.5。TLR4的表达和MyD88鼠血清
结果表明,TLR4的表达水平和MyD88模拟外科组大鼠血清和尿毒症组高于正常对照组,差异具有统计学意义 。4 w,尿毒症组大鼠的血清TLR4水平高于虚假的操作 ,但是没有显著差异的变化MyD88水平 。在12 w, TLR4的表达水平和MyD88尿毒症老鼠高于模拟外科组和4 w尿毒症组。差异具有统计学意义 ,如数据所示4(一)和4 (b)。
(一)
(b)
3.6。TLR4的表达在大鼠肾组织和心肌组织
结果表明,肾脏组织TLR4的表达在尿毒症组高于正常对照组和模拟手术,和数据具有统计上的显著差异 。在心肌组织,TLR4的老鼠在模拟外科组和尿毒症组高于正常对照组。TLR4的尿毒症组水平高于模拟外科组和MyD88水平尿毒症组12 w组高于尿毒症组4 w组。差异具有统计学意义 ,如数据所示5(一)和5(b)。
3.7。MyD88在大鼠肾组织的表达和心肌组织
结果表明,肾脏组织的表达水平在老鼠MyD88模拟外科组和尿毒症组高于正常对照组,尿毒症组MyD88水平高于模拟外科组和TLR4的尿毒症组12 w组高于尿毒症组4 w组。差异具有统计学意义 。在心肌组织,MyD88模拟手术的老鼠水平组和尿毒症组高于正常对照组。MyD88级别12 w尿毒症组高于模拟外科组和4 w尿毒症组。差异具有统计学意义 ,如数据所示6(一)和6(b)。
4所示。讨论
尿毒症是一种发病率很高的疾病,肾脏疾病,国内外研究和丰富它的症状和治疗。然而,目前很少有研究心肌肥厚为尿毒症的分子机制。在尿毒症血浆儿茶酚胺浓度的增加,其增加程度与心力衰竭的发生密切相关。此外,高血压加速动脉粥样硬化的进展,促进心脏衰竭(13]。本研究探讨尿毒症的心肌肥大机制建立尿毒症模型大鼠。检测血清尿素氮和肌酐,尿素氮和肌酐的尿毒症模型大鼠显著增加12 w。在4 w,尿毒症模型大鼠,肾组织肥大,肾纤维膜增殖,肾实质萎缩,大量的间质纤维增生和炎症细胞浸润,和蛋白质在肾小管被观察到。在12周,小管明显扩张,上皮细胞是平的、刷状缘消失了。上述结果表明尿毒症的成功建立小鼠模型。我们观察模型大鼠的心脏,发现模型组大鼠的全球肥大指数高于虚假的操作和正常组大鼠。在12 w,显然心肌细胞肥大和无序排列。心肌组织间质纤维和结缔组织明显增生,指示尿毒症症状导致心肌肥厚的风险。心肌肥厚经常引起心血管疾病如心脏病,中风和外周动脉疾病和死亡率增加。 Therefore, the prevention and treatment of CVD are of great significance in the treatment of CKD patients.
近年来,通常在肾脏疾病的发病机制中的作用受到越来越多的关注。其中,TLR4是I型跨膜受体编码的内毒素,主要表达于内皮细胞、上皮细胞、巨噬细胞和中性粒细胞。研究报告(14,15]表明TLR4有两个信号通路:MyD88-dependent信号通路和non-MyD88-dependent信号通路。TLR4和MyD88是最早的事件发生在MyD88-dependent信号通路的激活。Trentin-Sonoda et al。16]发现TLR4 / MyD88信号通路中发挥了关键作用,肾缺血再灌注损伤的演化从急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭。
在我们的研究中,检测TLR4的表达和MyD88鼠血液样本发现TLR4的表达和MyD88尿毒症组显著增加12 w。检测TLR4和MyD88在肾组织和心肌组织显示的积极表达TLR4和MyD88逐渐增加。这可能是因为在进行性肾纤维化的过程中,由于矩阵的增加,TLR4在巨噬细胞内源性配体接触的增加,如热休克蛋白60、纤维蛋白原、肝素硫酸,纤连蛋白EDA和透明质酸。内源性配体可以激活TLR4。激活TLR4和相关配体诱导NF -κ激活,启动interleukin-1的转录,白细胞介素- 6,interleukin-8 interleukin-12,肿瘤坏死因子-α,CD80和CD86基因和调节各种病原体的识别和免疫激活,导致肾脏损害(17- - - - - -19]。MyD88-dependent信号通路,TLR4承认后,结合其分子模式(PAMP时),它结合MyD88通过其行动地区(人数/ il - 1受体域)和激活受体相关的激酶(伊拉克共和国)、肿瘤坏死因子受体相关因子6 (TRAF6),复杂的膜蛋白转化生长因子相关激酶1 (TAK1)我κB激酶(IKK)和一系列的蛋白酶,导致NF -的激活κB易位细胞核和肿瘤坏死因子(TNF)——开始α和其他炎症因子基因表达(20.- - - - - -22]。这项研究还发现,与正常对照组相比,TLR4的水平和MyD88虚假的操作组的增加,这可能与炎症因子的转录,等在虚假的操作组,如上所述。虚假的操作组的老鼠接受开放手术。有可能是体内炎症因子的水平调节,导致增加TLR4和MyD88的水平。
5。结论
总之,这项研究的最终结果显示,尿毒症能逐渐导致心肌肥厚和TLR4和MyD88血清中高度表达,肾、尿毒症大鼠心肌组织,这表明TLR4和MyD88可能与尿毒症的程度和疾病造成的程度。心肌肥厚是相关的。本研究可以提供实验依据的理论研究体系的分子机制uremia-induced心肌肥大。然而,由于时间和资金问题,TLR4的具体调控机制和MyD88尚未研究。因此,深入研究特定监管或监管机制的TLR4 / MyD88信号通路在尿毒症心肌肥厚的发展能进一步探讨尿毒症及其并发症的诊断和治疗水平和理论研究水平。
数据可用性
在当前的研究中使用的数据可从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突,财务或其他。
确认
这项研究受到了温岭市科技计划项目(2017号c311067),浙江省医学会临床研究基金项目(2017号zyc-a123)和台州科技(20 ywb141)。