考试的乳酸菌paracasei GKS6和双歧杆菌lactis GKK2隔绝婴儿粪便老年小鼠模型

文摘

补充可以维持正常的生理机制和功能老化而吸引了我们的注意力近年来由于人口老龄化。益生菌被认为具有理想特性的抗氧化和抗炎等延缓衰老过程。然而,与年龄相关的实验与益生菌几乎没有哺乳动物模型。在这项研究中,我们演示了政府的益生菌的影响乳酸菌paracaseiGKS6 (GKS6)和双歧杆菌lactisGKK2 (GKK2),分别在5.0×10的剂量⁹cfu /公斤体重/天,senescence-accelerated 14周的老鼠容易8 SAMP8小鼠。3个SAMP8小鼠被分为三组:控制,与GKS6老鼠,老鼠GKK2。每组有十个女性和10个男性。美联储SAMP8小鼠和益生菌GKS6 GKK2显示显著降低程度的老化随后武田的分级方法的第11周的实验。GKK2组显示显著增加前翼握力男性SAMP8小鼠和肌肉纤维数量在两性。控制相比,GKS6和GKK2呈现显著增加肝脏超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活动。此外,明显降低肝硫代巴比土acid-reactive物质水平的观察益生菌组。这些结果表明益生菌GKS6和GKK2可以作为抗氧化剂在延缓衰老的过程和预防老年性肌肉损失。

1。介绍

数量和60岁以上的人口比例在人口正在增加1]。根据世界卫生组织(世卫组织)报告,老年人的数量(> 60岁)被计算为十亿年的2019,到2050年预计为二十亿。随着年龄的增加,体内各种器官或组织的正常功能逐渐下降,导致流动性下降,抗氧化防御系统和免疫力2- - - - - -4]。此外,减少抗氧化物质在人体内很容易发展相对免疫障碍等疾病,心血管疾病,和弱点综合症(5- - - - - -7]。因此,吸引关注在老化过程中保持正常的生理机制和功能(8]。

与年龄相关的人物之一就是肌肉损失,包括肌肉和肌肉功能的丧失可能发展sarcopenia或dynapenia [9- - - - - -11]。据报道,超过30%的患病率在那些八十岁以上遭受sarcopenia [12]。尽管老年性肌肉衰退的原因尚未明确,一些科学家认为氧化应激,活性氧(ROS),例如,可能会影响细胞信号通路,促进蛋白水解作用,抑制蛋白质合成肌肉纤维(13,14]。另一种解释是由于炎症细胞因子il - 6和TNF -α例如,炎症标记物的引入可能导致肌肉分解,是进行15,16]。

益生菌已报告有抗氧化作用,抗炎和代谢调节17- - - - - -19]。尽管这些属性是高度与延缓老化过程,很少有报道关于抗衰老的哺乳动物模型。在先前的研究中,我们分离两个细菌菌株,乳酸菌paracaseiGKS6 (GKS6)和双歧杆菌lactisGKK2 (GKK2),从健康婴儿粪便。两株潜在性能与应用益生菌在酸和胆汁耐受性测试。益生菌l . paracaseiGKS6报道与酒精代谢调制饮食小鼠模型和antiosteoporosis在切除卵巢的老鼠20.,21]。b . lactisGKK2显示免疫增强OVA-induced小鼠模型(22]。这些证据提供的可能性导致推迟衰老的发展和提高了我们的兴趣23]。

senescence-accelerated鼠标容易8 (SAMP8)广泛用于年龄相关性研究[24]。这是一个自发age-accelerated AKR鼠模型/ J近交系培育Pf。武田(日本京都大学)在1980年代早期(25]。SAMP8的图包括相对旧的外表,器官功能的快速下降,短寿命。益生菌GKS6评估和GKK2推迟衰老,SAMP8是在这项研究中引入的。14周后GKS6 GKK2总局,SAMP8测量的与年龄有关的参数。

2。材料和方法

2.1。细菌的准备

这两个乳酸菌paracaseiGKS6 (BCRC 910788)和双歧杆菌lactisGKK2 (BCRC 910826)从台湾健康婴儿粪便被孤立。细菌菌株,分别培养在37°C和pH值6.0在厌氧条件下16 h和以下媒介:MgSO 5%葡萄糖,酵母提取物2%,0.05%₄,0.1% K₂HPO₄,0.1%的渐变- 80。收获,发酵细菌与保护剂离心机和混合,然后冷冻干燥48小时25°C。活细菌被板计数统计。

2.2。动物主题

3个senescence-accelerated老鼠容易P8 (SAMP8)被安置在25±2°C, 65±5% RH 12小时黑暗/光周期与食物和水随意。共有60 SAMP8小鼠被分为三组(n在每个性别= 10):控制(生理盐水),与益生菌GKS6老鼠,老鼠与益生菌GKK2。益生菌是不断给14周剂量为5.0×10⁹cfu /公斤体重/天。动物协议在本研究机构批准的动物保健和使用委员会(IACUC没有。20170629 - a02)。

2.3。分级评分的衰老

第11周的实验,衰老的程度上SAMP8被武田评估的方法25]。评估包括如下:(1)反应性的行为,(2)被动的行为,(3)光泽度,(4)粗糙,(5)脱发,皮肤溃疡(6),(7)眼periophthalmic病变和(8)脊柱lordokyphosis。有五个等级从0得分4分代表衰老的程度从轻微到每个类别。总分是总结。

2.4。握力测试

SAMP8小鼠的前肢握力是第十二周,握力测试仪表(47200 GSM,尤格Basile S.R.L.、VA、意大利)。被记录的最大力量。

2.5。生物化学分析

实验的第四周,SAMP8小鼠血液收集从轨道窦和离心机在4°C 6000 rpm, 5分钟,然后储存在−20°C。以下参数分析贝克曼800 D×C化学分析仪(美国贝克曼库尔特,CA):葡萄糖、总蛋白、白蛋白、甘油三酯、总胆固醇、高密度和低密度脂蛋白胆固醇(高密度脂蛋白胆固醇/密度),谷氨酸草酰乙酸转氨酶(得到),谷氨酸丙酮转氨酶(GPT)、血尿素氮(BUN)、肌酐。

2.6。测定氧化参数

与250年25 mg肝组织均质μl•瑞帕缓冲然后离心机1600×g和4°C 10分钟。浮在表面的收集和储存在−80°C使用。超氧化物歧化酶(SOD)活性在肝脏被草毒死化验分析工具包(猫。不。SD125、草毒死实验室、蚂蚁、英国)与吸光度在340海里。过氧化氢酶试验装备(猫。不。开曼化学,707002年美国MI)是使用540纳米吸附率在肝脏过氧化氢酶活性的检测。分析硫代巴比土酸活性物质的水平(TBARS)在小鼠肝脏,100μ与100年l肝上层清液均相混合μl十二烷基硫酸钠(SDS)解决方案和4毫升颜色试剂在开水一小时然后冰冷。混合物在1600×离心机在4°C下10分钟左右,然后吸光度值在535 nm spectrophotometrically读。数据被表示为等价的丙二醛(MDA)µM / g蛋白(26]。

2.7。肌肉细胞的免疫组织化学分析

牺牲后,小鼠肌肉组织用0.9%盐水和10%福尔马林固定。组织是嵌入在石蜡,切成4μ米厚片的形态和病理评估。免疫组织化学染色(包含IHC)组织涉及使用徕卡抗体快速肌凝蛋白重链(WB-MHCf)和肌凝蛋白重链缓慢(WB-MHCs)。通过使用自动化BondMax双染色,WB-MHCf WB-MHCs抗原决定基检索涉及使用ER2 (AR9640)检索解决方案30分钟一次,其次是孵化WB-MHCf WB-MHCs抗体和稀释剂100 x 30分钟。使用的检测工具是债券聚合物改进检测(DS9800)(孵化与初等后8分钟,聚合物为8分钟,和3′′-diaminobenzidine 5分钟)和债券聚合物提炼红色检测(DS9390)(孵化与初等后20分钟,30分钟聚合物,红色代表10分钟,和苏木素的5分钟)。最后,结果光显微镜下检查配备CCD相机(BX-51、奥林巴斯、东京)兽医病理学家。

2.8。统计分析

提出了数据均值±SEM (n在每个性别= 10),用SPSS 19.0分析了单向方差分析(美国纽约SPSS)。各组之间比较的统计学意义,邓肯的多个范围测试使用。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。SAMP8小鼠的体重和一般特征有或没有益生菌

没有显著差异,分组后的第一周所有SAMP8小鼠。食物摄入量和用水量在实验中没有显著差异(数据没有显示)。图1显示了体重变化在14周的益生菌消费。男性SAMP8小鼠平均体重大约2 - 3克的实验各组之间无显著差异(图1(一))。也没有显著差异在体重变化的治疗女性性别(图1 (b))。相对正常器官重量提出在两性与对照组相比(表1)。此外,益生菌GKS6和GKK2并不影响生化参数。

(一)

(b)


	男性			女
集团	控制	GKS6	GKK2	控制	GKS6	GKK2

相对重量(克/ 100克体重)
大脑	1.440±0.038^一个	1.535±0.012^一个	1.524±0.017^一个	1.736±0.043^一个	1.782±0.049^一个	1.769±0.061^一个
心	0.662±0.025^一个	0.651±0.023^一个	0.673±0.018^一个	0.564±0.017^一个	0.597±0.025^一个	0.556±0.026^一个
肝	4.853±0.282^一个	4.829±0.235^一个	4.369±0.174^一个	4.651±0.201^一个	4.442±0.115^一个	4.768±0.288^一个
脾	0.352±0.037^一个	0.294±0.015^一个	0.264±0.018^一个	0.431±0.037^一个	0.444±0.023^一个	0.458±0.033^一个
肺	0.720±0.030^一个	0.805±0.033^一个	0.798±0.045^一个	0.836±0.045^一个	0.772±0.020^一个	0.860±0.033^一个
肾脏	1.710±0.064^一个	1.713±0.046^一个	1.663±0.074^一个	1.264±0.020^一个	1.264±0.021^一个	1.273±0.044^一个
等离子体生化参数
白蛋白(g / d)	2.92±0.09^一个	3.11±0.07^一个	3.14±0.06^一个	3.45±0.07^一个	3.50±0.09^一个	3.50±0.11^一个
葡萄糖(mg / dl)	154.5±5.47^一个	159.90±4.14^一个	159.10±5.34^一个	162.60±5.66^一个	155.30±5.81^一个	161.10±3.57^一个
总胆固醇(mg / dl)	138.10±6.81^一个	145.30±4.71^一个	144.20±4.58^一个	99.50±2.98^一个	100.90±2.18^一个	101.90±2.61^一个
甘油三酸酯(mg / dl)	97.30±3.36^一个	99.30±3.16^一个	101.30±4.35^一个	98.90±3.05^一个	100.60±4.11^一个	99.60±1.10^一个
高密度脂蛋白(mg / dl)	109.81±5.14^一个	108.73±2.71^一个	112.84±4.58^一个	61.01±4.88^一个	53.57±5.70^一个	46.25±6.12^一个
总蛋白(mg / dl)	5.94±0.15^一个	6.32±0.22^一个	6.44±0.22^一个	6.06±0.10^一个	6.04±0.07^一个	5.89±0.11^一个
低密度脂蛋白(mg / dl)	18.70±2.65^一个	18.20±1.73^一个	22.10±1.42^一个	9.17±0.96^一个	7.88±0.10^一个	18.87±5.73^一个
GPT (U / L)	47.40±5.53^一个	45.80±3.85^一个	46.30±3.80^一个	61.30±5.36^一个	63.70±5.43^一个	64.10±4.47^一个
有(U / L)	181.80±17.01^一个	179.20±9.53^一个	173.40±10.99^一个	178.80±9.40^一个	172.70±11.22^一个	177.70±12.70^一个
包子(mg / dl)	27.19±1.96^一个	26.95±0.73^一个	29.27±2.34^一个	25.93±2.00^一个	23.54±0.72^一个	25.78±2.21^一个
肌酐(mg / dl)	0.31±0.02^一个	0.33±0.02^一个	0.30±0.22^一个	0.32±0.02^一个	0.35±0.01^一个	0.37±0.02^一个

值提出了均值±SEM (n= 10)(单向方差分析)。字母“a”代表通过邓肯的多个范围检验无显著差异。SAMP8小鼠给予生理盐水或益生菌剂量为5.0×10⁹CFU /公斤体重/天。GKS6:l . paracaseiGKS6;GKK2:b . lactisGKK2。

3.2。益生菌的影响l . paracaseiGKS6和b . lactisGKK2衰老的分数

衰老的程度三个月大SAMP8小鼠得分在第11周的实验。SAMP8小鼠显示出现老龄化的特点包括钝或粗糙的头发,脱发,浑浊的眼睛,lordokyphosis。控制雄性和雌性SAMP8小鼠均呈现严重衰老外观总评分分数为3.0±0.33,4.9±0.23,分别(图2)。益生菌GKS6显著降低衰老的程度的皮肤,眼睛,老化和脊柱,这提出了一个总在男女双方得分为1.0±0.33。与SAMP8补充益生菌GKK2,雄性和雌性老鼠也显示出显著降低衰老( )。这些结果表明,益生菌GKS6 GKK2总局提供对延缓衰老的过程的影响。

图2

老化的三个月大SAMP8小鼠在11周。数据被表示为±SEM手段和分析单向方差分析(n= 10)。一个值< 0.05被认为是一个显著差异图中标志。SAMP8小鼠给予生理盐水或益生菌剂量为5.0×10⁹CFU /公斤体重/天。控制:SAMP8小鼠用生理盐水;GKS6: SAMP8小鼠喂食了l . paracaseiGKS6;GKK2: SAMP8小鼠喂食了b . lactisGKK2。

3.3。益生菌的影响l . paracaseiGKS6和b . lactisGKK2在握力

在握力测试、控制雄性老鼠了握力比雌性老鼠的控制。益生菌GKS6和GKK2没有影响最大峰值力由女性SAMP8小鼠与女性比较控制(图3)。管理l . paracaseiGKS6显示趋势的强度增加男性SAMP8相比,男性控制,尽管它还没有达到统计学意义。男性SAMP8小鼠喂食了b . lactisGKK2呈现显著的握力比控制雄性老鼠( )。这是证明,益生菌GKS6和GKK2补充可以缓解衰老引起的强度损失在雄性动物模型。

图3

握力的分析三个月大SAMP8小鼠12日一周。数据被表示为±SEM手段和分析单向方差分析(n= 10)。一个值< 0.05被认为是一个显著差异图中标志。SAMP8小鼠给予生理盐水或益生菌剂量为5.0×10⁹CFU /公斤体重/天。控制:SAMP8小鼠用生理盐水;GKS6: SAMP8小鼠喂食了l . paracaseiGKS6;GKK2: SAMP8小鼠喂食了b . lactisGKK2。

3.4。益生菌效果GKS6和GKK2 SAMP8小鼠肌肉细胞

组织学结果显示没有明显区别SAMP8小鼠纤维排列,以及I型和II型纤维的比例(图4(一))。GKS6和GKK2 SAMP8小鼠并不影响纤维的大小,不论性别。的益生菌GKS6显示趋势增加肌肉细胞计数的男性SAMP8(图4 (b))。观察显著增加肌肉纤维GKK2组时,分别控制相比男性和女性组( )。建议益生菌GKK2可能有助于缓解肌肉纤维的损失与肌肉老化有关。

(一)

(b)

图4

免疫组织化学鉴定的肌肉细胞计数在200 x。SAMP8的肌肉组织是通过免疫组织化学方法观察(a) (b)和细胞计数检查。I型和II型纤维染色纤维红色和橙色,分别。肌肉细胞计数的值显示为意味着±S.E.米用单向方差分析(n= 10)。提出了显著差异。控制:SAMP8小鼠用生理盐水;GKS6: SAMP8小鼠喂食了l . paracaseiGKS6;GKK2: SAMP8小鼠喂食了b . lactisGKK2。

3.5。益生菌GKS6和GKK2 SAMP8小鼠氧化参数

超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的酶参与活性氧(ROS)清除。SAMP8小鼠肝脏SOD的活性也显著大于益生菌GKS6和GKK2,分别与控制(图5(一个))。类似的结果与过氧化氢酶活性观察SAMP8小鼠肝脏,如图5 (b)。指出GKS6管理局和GKK2可以改善老年小鼠模型中的抗氧化剂活性。此外,MDA对TBARS少发现GKS6和GKK2组的肝组织 (图5 (c))。此外,TBARS 8-hydoxy-2-deoxyguanosine (8-OHdG)老鼠大脑中也检测到较低的水平在两个益生菌组相比,控制(图S1)。益生菌GKS6和GKK2脂质氧化的影响在老化过程中被发现。

(一)

(b)

(c)

图5

SAMP8小鼠肝脏氧化应激参数。超氧化物歧化酶的活动(a),过氧化氢酶(b)和(c)硫代巴比土酸活性物质的浓度在SAMP8小鼠肝脏测定。的值都显示为±SEM手段与单向方差分析(n= 10)。提出了显著差异。控制:SAMP8小鼠用生理盐水;GKS6: SAMP8小鼠喂食了l . paracaseiGKS6;GKK2: SAMP8小鼠喂食了b . lactisGKK2。

4所示。讨论

在目前的研究中,益生菌GKS6和老龄GKK2表现出延迟效应。然而,这两个菌株的机制应该是不同的根据我们先前的实验和部分未揭露的数据。有一个可能性的影响b . lactisGKK2贡献了抗衰老的线粒体抗氧化作用;而的影响l . paracaseiGKS6可以解释抗炎。

的CDGSH iron-sulfur域2 (Cisd2) redox-sensitive基因,据报道有至关重要的作用在寿命和衰老相关疾病的发展27]。在我们的初步测试,增强Cisd2 HEK293T细胞基因表达在GKK2治疗但不是GKS6组(图S2)。持久Cisd2保护线粒体水平失调,减少氧化应激引起DNA损伤;此外,Cisd2参与钙内稳态的调节钙通道位于内质网和线粒体外膜28- - - - - -30.]。这些感情维持更好的物理功能在骨骼肌、肝脏和心脏(31日,32]。Cisd2营销的老鼠表现出类似的模式自然老化小鼠在腓肠肌肌肉的减少(33]。它解释说,GKK2 aged-accelerated老鼠模型中增加握力和肌肉参与cisd2基因的调控。

尽管GKS6老化的分数低于GKK2评分系统(图2),似乎年龄相关性肌肉参数被比GKK2 GKS6影响不是很多。因此,它给我们的线索,益生菌的抗衰老的影响不同应变应变。我们也调查了骨体积/组织体积的比值(BV /电视),小梁厚度(结核病。Th),小梁数(结核病。N),小梁分离(结核病。Sp)和骨矿物质密度(BMD)在女性SAMP8小鼠喂食了GKS6(表S1)。虽然结果尚不具备统计学意义,结核病的减少的趋势。Sp和增加BMD是类似于我们之前的研究在一个切除卵巢的老鼠模型21]。有趣的是,GKS6相对保持更高的BV /电视(%)和结核病。N(不/毫米)SAMP8女性在过去并没有观察到。一般来说,骨质流失由于老化被认为是一种慢性炎症状态涉及增加促炎细胞因子如il - 6、il - 1,和核转录因子-受体激活κB配体(RANKL) (34,35]。根据GKS6的抑制效果与RANKL治疗,GKS6的功能在本研究通过抗炎通路可能是老年性骨质疏松猜测(21]。

可以预期的组合GKS6 GKK2有潜在的协同效应提高与年龄相关的症状,因为他们可能在生理功能不同的工作。福等人发现了一个类似的结果用口服抗衰老的效果乳酸菌种虫害和双歧杆菌属C57BL / 6小鼠分别spp。;然而,小鼠的肠道微生物群的组成是非常不同的在这两个治疗(36]。抗衰老的不同作用的益生菌可能提供生理调节的复杂性,建立多个防御系统,也就是说,提供更合适的解决方案和更少的不良影响的担忧。在这项研究中,我们为提供两种不同的益生菌菌株具有不同的抗衰老的作用机制。

5。结论

在这项研究中,我们表明,膳食补充剂l . paracaseiGKS6和b . lactisGKK2 SAMP8小鼠是安全的。此外,益生菌GKS6和GKK2大大延缓了衰老过程通过增强抗氧化剂活性,导致较低的氧化损伤。此外,b . lactisGKK2表现出显著的影响在前肢力量加强和肌肉纤维发育过度。这两个l。paracaseiGKS6和b . lactisGKK2可以作为候选人的延缓衰老的功能性食品。b . lactisGKK2可能会进一步成为一个潜在的补充肌肉生长作为老年人的饮食。

数据可用性

所有的数据用于支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

s . w .林进行了动物实验和m . f .王帮助数据分析。托尼·j·方和w·h·林监督实验。c·c·陈和y l .陈对这项研究的基本原理提出了建议。s . w .林和y s蔡导致了论文写作。所有作者都阅读和批准了手稿。

补充材料

图S1:氧化应激参数SAMP8小鼠大脑。硫代巴比土酸活性物质的浓度(a)和8-hydoxy-2-deoxyguanosine SAMP8小鼠大脑中(b)测量。的值都显示为±SEM手段与单向方差分析(n= 10)。提出了显著差异。控制:SAMP8小鼠用生理盐水;GKS6: SAMP8小鼠喂食了l . paracaseiGKS6;GKK2: SAMP8小鼠喂食了b . lactisGKK2。图S2: Cisd2表达式与益生菌治疗HEK 293 t细胞系。从人类胚胎肾293 t筛选试验(HEK 293 t)细胞株揭示了免疫印迹(图S2a)和Cisd2表达决心的相对比例控制(图开通。GKS6:l . paracaseiGKS6;GKK2:b . lactisGKK2;Cisd2: CDGSH iron-sulfur域2;GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶。表S1:益生菌对骨的影响参数SAMP8雌性老鼠。(补充材料)

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以证据为基础的补充和替代医学

考试的乳酸菌paracaseiGKS6和双歧杆菌lactisGKK2岁从婴儿粪便分离的小鼠模型

文摘

1。介绍

2。材料和方法

2.1。细菌的准备

2.2。动物主题

2.3。分级评分的衰老

2.4。握力测试

2.5。生物化学分析

2.6。测定氧化参数

2.7。肌肉细胞的免疫组织化学分析

2.8。统计分析

3所示。结果

3.1。SAMP8小鼠的体重和一般特征有或没有益生菌

3.2。益生菌的影响l . paracaseiGKS6和b . lactisGKK2衰老的分数

3.3。益生菌的影响l . paracaseiGKS6和b . lactisGKK2在握力

3.4。益生菌效果GKS6和GKK2 SAMP8小鼠肌肉细胞

3.5。益生菌GKS6和GKK2 SAMP8小鼠氧化参数

4所示。讨论

5。结论

数据可用性

的利益冲突

作者的贡献

补充材料

引用

版权

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