文摘

黄芪基数是一种常见的中药用于治疗糖尿病。然而,这种现象的潜在机制仍不完全清楚。黄酮是一类活性成分,据报道,发挥各种活动。现有证据表明,黄酮黄芪基数可能在调节糖尿病进展至关重要。在这项研究中,黄酮总量黄芪基数(组织)进行了研究,观察其对胆汁酸代谢的影响在活的有机体内和在体外。C57BL / 6 j小鼠服用STZ和高脂喂养建立糖尿病模型,和HepG2细胞线应用调查组织对肝细胞的影响。我们发现一个严重的干扰胆汁酸和脂质代谢的糖尿病小鼠,口服或细胞培养和组织显著降低总胆固醇(TCHO)的生产,总甘油三酸酯,谷氨酸的丁酮二氨基转移酶(AST)、glutamic-pyruvic转氨酶(ALT)和低密度脂蛋白(低密度),同时增加高密度脂蛋白(hdl - c)水平。葡萄糖转运体的表达2 (GLUT2)和胆固醇7α羟化酶(CYP7A1)显著调节组织治疗,和FXR TGR5在调节胆汁酸和脂质代谢方面起关键作用。这项研究提供了一个新颖的理解的机制黄芪基数控制糖尿病。

1。介绍

虽然已经取得了巨大飞跃的预防和治疗糖尿病(DM)患者的人数持续上升。国际糖尿病联合会估计,DM患者将会增加到7亿年的2045 (1]。

研究证明,胆汁酸DM和醣脂类代谢密切相关2]。肝脏是主要的器官分泌胆汁酸,胆汁酸和hepatoenteral循环中发挥着重要作用维持体内平衡体内糖脂(3,4]。它已经表明,胆汁酸代谢变化可能引起glycolipidemia通过FXR和TGR5通路(5,6]。另外,长期的高血糖会影响肝功能和胆汁酸的分泌7]。因此,调节胆汁酸代谢被认为是预防糖尿病的潜在目标。

研究有关的影响黄芪基数(黄琦在中国)DM非常丰富。的活性成分黄芪基数主要包括多糖,对黄芪黄酮(8,9]。以前,我们报道,黄酮calycosin和calycosin-7-O -β-D-glucopyranoside能改善血管内皮细胞功能障碍在糖尿病设置(10- - - - - -12];此外,calycosin也对肝细胞具有保护作用的功能(13]。除此之外,其他的研究小组也报道称,总类黄酮黄芪基数(组织)抗炎作用[14,15]。最近,据报道,黄芪基数煎煮监管影响胆汁酸(16]。然而,组织的作用和机制在胆汁酸的代谢仍需要阐明。对于这个目标,我们设计了这个研究。

2。材料和方法

2.1。材料

组织是由成都才提供生物技术有限公司(成都,四川,中国)。二甲双胍是购自GBCBIO技术(广州,广东省,中国)。胰岛素是由原液提供生物技术有限公司(上海,中国)。脂多糖(LPS)购买的σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。ELISA试剂盒测量总胆汁酸(稍后通知)、总胆固醇(TCHO)、甘油三酯(TG),总谷氨酸的丁酮二氨基转移酶(AST)、glutamic-pyruvic转氨酶(ALT)、高密度脂蛋白(hdl - c)、低密度脂蛋白(hdl - c)是购自建成(南京、江苏、中国)。主要抗体顶端sodium-dependent胆汁酸转运体(ASBT)购买的PL实验室(加拿大里士满)。CYP7A1和FXR购自圣克鲁斯(美国达拉斯,TX)。TGR5由Abcam提供(美国Cambridge, MA)。GLUT2源自bios(中国,北京)。其他试剂从商业来源。

2.2。动物

NIH(美国国立卫生研究院出版。85 - 23,1996年修订)指南的护理和使用实验动物后,和批准的这项研究是澳门科技大学。C57BL / 6 j小鼠从广东医学实验动物中心提供。所有老鼠都安置在一个动物的房子,有一个12 h日光周期25°C。药物干预之前,所有老鼠自适应了7天。动物被喂以高脂肪饮食(15%的蛋白质、43%的碳水化合物,42%脂肪;从广东医学实验动物中心)获得了8周,然后用链脲霉素治疗(每天50毫克/公斤)模型为4天。这些动物被随机分为组如下:(1)正常对照组(n= 6,动物喂养正常chow);(2)糖尿病模型组(n= 6),动物被给予链脲霉素;(3)干预组动物模型的DM与低组织(口服治疗L-TFA, 5毫克/公斤/天,n= 6)、媒介组织(M-TFA, 25毫克/公斤/天,n= 6),高组织(H-TFA, 50毫克/公斤/天,n= 6);(4)阳性对照组动物被口头管理二甲双胍(满足,每天0.15克/公斤,n= 6)。在实验的最后,收集肝组织学和生化研究。

2.3。细胞系,细胞培养

HepG2细胞来源于美国类型文化集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。所有细胞都用MEM培养基培养(Gibco)补充10%胎牛血清,100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升37°C的5%股份2孵化器。

2.4。MTT测定细胞生存能力

HepG2细胞接种到96孔细胞培养板与1×105细胞每口井。不同浓度的组织(0-40μg / mL)被添加到细胞。24小时后,MTT (3 - (4, 5-dimethylth-iazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴))(0.5毫克/毫升)添加到文化体系和培养在黑暗4 h。甲状腺晶体溶解10% SDS(十二烷基硫酸钠)。在595纳米细胞活性进行了分析使用一个盘子读者(美国分子设备)。

2.5。组织学分析

肝脏切片观察hematoxylin-eosin())和周期性acid-schiff (PAS)染色。肝脏切片固定在4%多聚甲醛超过24小时;paraffinized后,部分(0.4μm))或染色的染色根据标准程序的解决方案。最后,遮满了片盖玻片和成像使用徕卡DM2500荧光显微镜成像系统(德国徕卡)。

2.6。免疫印迹分析

肝组织细胞溶解在1×里帕缓冲蛋白酶抑制剂的鸡尾酒和磷酸酶抑制剂。总蛋白质是由使用Bio-Rad量化分析(美国)。样本由10% SDS-polyacrylamide凝胶,然后转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)(美国马EMD微孔)。与5% BSA TBST缓冲区阻塞后,孕育了PVDF膜抗体主要包括anti-GAPDH抗体(1:1000),anti-CYP7A1抗体(1:800),anti-FXR抗体(1:800),anti-TGR5抗体(1:1000),或anti-GLUT2抗体(1:1000)在一夜之间在4°C。之后,膜与TBST缓冲洗了三遍,然后进一步孵化与二次抗体(美国英杰公司)在室温下1 h。蛋白质检测是由《奥德赛》CLx成像系统(Li-COR生物科学,贝尔法斯特,我,美国)。

2.7。免疫荧光分析

如前所述(执行免疫荧光试验17]。HepG2细胞对数生长期被播种在玻璃幻灯片,正常MEM使用在正常组,Ins +有限合伙人(胰岛素,10−7mol / L;有限合伙人:1μg / ml)添加在DM组,添加了Ins + LPS +组织在组织集团和二甲双胍(0.5毫米),添加在阳性对照组(18,19]。24小时后,细胞用4%多聚甲醛30分钟。与5% BSA被屏蔽后,细胞被孵化与抗体包括anti-GLUT2 (1: 200), anti-FXR (1: 200), anti-CYP7A1 (1: 200), anti-TGR5(1: 200),或anti-ASBT一夜之间(1:200)在4°C,然后进一步孵化与FITC -或CY3共轭二次抗体。细胞核与DAPI染色。最后,共焦激光扫描显微镜下观察到的细胞(德国徕卡TCS SP8)和荧光密度由Image-J软件决定。

2.8。统计分析

图准备和使用GraphPad Prism 7.00软件进行统计分析(美国CA GraphPad软件Inc .)。荧光图像处理Image-J开源软件。所有数据都来自超过三个独立重复实验。符合正态分布的数据都表示为平均值±标准偏差(SD)和组间的差异由单向方差分析方法进行了分析。意义是接受 或更少。

3所示。结果

3.1。组织改善糖尿病小鼠肝损伤和调节血糖

空腹血糖(FBG)的水平是一个敏感的参数,反映了控制糖尿病。如图1 (e)、组织管理明显降低糖尿病小鼠的光纤光栅,提出明确的组织对改善糖尿病进展的影响。

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图1
总额的影响黄芪黄酮(组织)在糖尿病小鼠血糖和肝组织学。他走时染色肝(放大:(a) 100 x 400 (b))。PAS染色肝(放大:100 (c)和(d) 400 x)。(e)空腹血糖(FBG)测试。(f)肝指数;肝脏指数=(肝脏重量/体重)%。(n= 6)。遇见:二甲双胍。 ; 与DM组。

肝脏在调节中起着关键作用的血糖水平。(数字)染色和PAS染色图像1(一)- - - - - -1 (d))表明,与正常组相比,脂肪变性明显观察到2型糖尿病小鼠;此外,肝细胞的糖原含量显著减少PAS染色观察到(数字1 (c)和1 (d))。另外,组织保存小叶结构,维持细胞形态,提高细胞内糖原水平。肝脏指数也减少小鼠组织处理(图1 (f))。这些结果表明,组织管理在2型糖尿病小鼠肝脏保存功能。

3.2。组织对血清血脂的影响

调查组织的影响肝功能,血清血脂测量。如数据所示2(一个)- - - - - -2 (c)和数字2 (e)- - - - - -2 (g)公司的血清TG, TC,低密度ALT, AST,糖尿病小鼠与正常相比显著增加控制,而高密度脂蛋白胆固醇水平降低糖尿病小鼠,但没有发现统计学意义与正常控制(图2 (d))。最少、管理与组织明显改善脂质代谢损伤和恢复肝功能与糖尿病的老鼠。最显著的影响是在媒介组织(M-TFA)组。这些结果表明,组织不仅可以减少糖尿病小鼠的胆固醇水平也逆转糖尿病大鼠血清胆汁酸水平升高。

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图2
总黄芪黄酮(组织)改善小鼠脂质代谢。血清总胆汁酸水平的(a)(稍后通知),(b)总胆固醇(TCHO), (c)总甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(hdl - c) (d), (e)低密度脂蛋白(低密度),(f) glutamic-pyruvic转氨酶(ALT)和(g)谷氨酸的丁酮二氨基转移酶(AST)测定试剂盒(n= 6)。遇见:二甲双胍。 ; 与DM组。
3.3。组织改善糖尿病小鼠的肝脏中葡萄糖和脂质代谢

现有的研究发现,蛋白质调节脂质和葡萄糖代谢明显抑制糖尿病设置,如葡萄糖转运蛋白2 (GLUT2),胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1) G-protein-coupled胆汁受体(TGR5),通过X受体(FXR) [20.,21]。研究胆汁酸代谢机制的组织,他们的蛋白表达是由蛋白质印迹。如图3TFA显著增加GLUT2(图的表达式3 (b)),CYP7A1(图3 (c)),和TGR5(图3 (e)与糖尿病模型组相比,FXR也增加了政府的组织,但没有统计学意义(图3 (d))。

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图3
组织增加葡萄糖和脂类代谢相关蛋白的表达在糖尿病的设置。(一)世行检测蛋白表达。定量分析的(b) GLUT2, (c) CYP7A1, (d) FXR, TGR5 (e)。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)作为内部控制(n= 3)。 ; 与DM组。
3.4。在HepG2细胞组织改善脂质代谢

来验证上述发现,组织对HepG2细胞的影响进一步研究。MTT法用于初步检测组织细胞生存能力的影响。如图4(一),低浓度的组织HepG2细胞的生存能力略有增加,但细胞生存能力一旦浓度超过10毒性观察μg / ml;因此,我们应用“10μg / ml”在以下研究。

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图4
总黄芪黄酮在HepG2细胞(组织)调节脂类代谢。(a) MTT试验被用来评估组织对细胞活力的影响。组织的影响等生化指标(b)总甘油三酯(TG)、总胆固醇(c) (TCHO), (d)谷氨酸的丁酮二氨基转移酶(AST)、(e) glutamic-pyruvic转氨酶(ALT)、(f)高密度脂蛋白(hdl - c)和低密度脂蛋白(g)(低密度)检测到的工具根据制造商的协议(n= 6)。遇见:二甲双胍。 ; ; 与DM组。

HepG2细胞脂质代谢是由包。符合发现动物,TG, TCHO, AST、ALT、和低密度显著增加,高密度脂蛋白胆固醇降低糖尿病小鼠,而组织孵化显著增加高密度脂蛋白胆固醇和降低其他参数(数字4 (b)- - - - - -4 (g))。

3.5。组织调制GLUT2和蛋白质的表达调节胆酸代谢HepG2细胞

葡萄糖转运蛋白调节肝细胞葡萄糖摄取中扮演关键的角色。通过免疫荧光试验,我们发现GLUT2的表达显著降低DM模型,而组织抑制这种递减(数字5(一个)和5 (g))。

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图5
总额的影响黄芪黄酮(组织)在HepG2细胞脂质代谢相关的蛋白。GLUT2,表达(a) (b) CYP7A1, (c) ASBT, FXR (d)和(e) TGR5由激光扫描共焦显微镜下免疫荧光试验(放大:800 x)和相对荧光强度(f)的GLUT2, (g) CYP7A1 ASBT (h),(我)FXR, (j) TGR5由Image-J软件。DAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylindole)是用于染色细胞核(n= 3)。遇见:二甲双胍。 ; 与DM组。

CYP7A1是一种酶,这种酶在调节胆固醇代谢起着重要的作用。在目前的研究中,我们观察到CYP7A1也位于HepG2细胞膜(图5 (b));此外,DM显著抑制其表达( 与正常),减少被逆转组织管理局( 与DM)(图5 (f))。

顶端sodium-dependent胆汁酸转运体(ASBT)在小肠上皮细胞吸收到回肠细胞(22],FXR TGR5胆固醇平衡上发挥了关键作用,脂肪吸收,胆汁酸合成。在这项研究中,我们发现ASBT表达降低,FXR, TGR5显著逆转糖尿病模型的组织(数字5 (c)- - - - - -5 (e)和5 (h)- - - - - -5 (j))。

4所示。讨论

胆汁酸合成由肝细胞和消化吸收中发挥关键作用的脂质(23]。最近的研究表明它在调节葡萄糖代谢中的作用和控制糖尿病的发展。黄芪基数是一种常见的中药用于治疗糖尿病(26证明,一份报告黄芪基数可以调节血脂和血糖水平在HFD-fed老鼠27]。以前,我们发现活性黄酮类成分黄芪基数对糖尿病损伤有保护效应在体外(10- - - - - -13),但其影响胆汁酸代谢研究。在目前的研究中,我们发现组织可以调节胆汁酸代谢在活的有机体内和在体外,潜在的机制也进行了研究。

肝脏在调节代谢中起着举足轻重的作用。二型糖尿病的机理认识的提高,胆汁酸的作用在疾病进展引起了学者的兴趣。在生物体中,胆汁酸想起在小肠ASBT回到肝脏,这一过程称为胆汁酸的hepatointestinal循环。几种类型的胆汁酸受体被发现,其中一个是核受体,FXR的代表(24];另一组是g-protein-coupled膜受体,代表的是TGR5 [25]。因此,FXR表达和激活和TGR5将大大影响胆汁酸代谢。

糖尿病的胆汁酸在发展中的作用已经越来越认可。发现激活TGR5能促进胰岛素的分泌GLP-1,改善胰腺组织的功能,促进胰岛素敏感性(28),和抑制炎症29日]。增加体内胆酸可以激活TGR5,和绑定胆汁酸和TGR5之间将进一步激活腺苷酸环化酶途径和增加AMP含量(30.]。FXR受体是第一个被发现的胆汁酸受体。据报道,肝脏内胆固醇消化CYP7A1成为胆汁酸,而后者将被重吸收ASBT回肠。绑定和激活FXR-FGF19将进一步抑制CYP7A1的活动通过激活MAP激酶通路,从而抑制胆汁酸合成(31日,32]。因此,TGR5 FXR是调制的关键成因和胆汁酸的代谢。在目前的研究中,我们发现CYP7A1的表情,ASBT, TGR5,和FXR下显著降低糖尿病的设置,显示胆汁酸代谢抑制在整个生产过程中,与组织和管理极大地提高了它的生成和代谢。

胆汁酸的负面反馈hepatointestinal循环是由小分子异质二聚体合作伙伴(SHP),这是FXR的下游目标(34]。发现FXR的激活将导致SHP-inhibited表达CYP7A1 ASBT肝细胞(35,36]。绑定轴马力和转录因子之间LRH-1将规范的表达在LRH-1 CYP7A1抑制将导致减少的表达CYP7A1 [37]。研究已经证明,FXR能促进脂蛋白代谢的激活(38),降低血浆甘油三酯和胆固醇水平(39]。此外,FXR受体激动剂的也显示抑制肝gluconeogenic基因如glucose-6-phosphatase和增加肝糖原合成(40]。我们目前的研究结果与以往报道,严重干扰脂质和胆汁酸代谢在糖尿病老鼠,和政府组织显著增加FXR表达和脂质代谢恢复。它已经认识到TCHO升高,TG, AST、ALT和低密度脂蛋白水平和高密度脂蛋白胆固醇水平降低肝细胞损伤的表现(41,42]。显然我们目前的研究结果表明,组织有保护作用对糖尿病的进展。

总之,我们在目前的研究中发现,组织改善脂质和胆汁酸代谢在糖尿病设置,FXR的监管和TGR5应该为其影响。我们目前发现的机制提供了新的理解黄芪基数对糖尿病的发展。

数据可用性

数据用于支持这项研究的结果包括在手稿和可以从相应的作者获得合理的请求。

的利益冲突

所有的作者宣称他们没有利益冲突。

确认

这项工作是由澳门科学技术发展基金支持,澳门特别行政区,中国(0006/2019 / A)。