文摘
背景。糖尿病(DM)被氧化应激、炎症和血管功能障碍,导致糖尿病肾病导致终末期肾病(ESRD)。血管功能障碍的特点是血管收缩剂的不平衡和血管舒张剂在DM背后血管损伤的机理。此外,减少足细胞与肾损伤的严重程度。Podocyturia往往先于蛋白尿在几个肾脏疾病,包括糖尿病肾病。积雪草的(CeA)被称为一个抗炎和抗氧化剂,具有神经保护作用。本研究旨在调查东航的潜在影响在DM抑制肾小球损伤和血管重建。方法。DM大鼠模型是通过腹腔注射链脲霉素诱导60毫克/公斤体重(BW),然后月DM大鼠分为(DM1,n= 5),两个月的DM (DM2n= 5),早期DM并发与东航治疗2个月(二代,n= 5),月DM处理月CeA (DM1C1,n= 5)。CeA(400毫克/公斤体重)是每日通过口服填喂法。对照组(控制,n= 5)维持两个月。最后,老鼠被安乐死和肾脏收获评估血管重建使用小天狼星红染色和超氧化物歧化酶的mRNA表达,足细胞标记,ACE2,以挪士,ppET-1使用rt - pcr。结果。DM组表现出显著的高程的葡萄糖水平,肾小球硬化症和蛋白尿。显著减少SOD1和SOD3 nephrin和差别促进对这些upregulation TRPC6 mRNA表达的大鼠肾小球肾脏。除此之外,这个条件增强ppET-1和抑制以挪士和ACE2 mRNA表达导致血管重建的发展增加壁厚,腔壁面积比(LWAR)。东航的治疗,尤其是三代集团减毒肾小球损伤,诱导条件的逆转。结论。积雪草的治疗糖尿病的早期阶段改善肾小球硬化症通过提高抗氧化酶和血管损伤。
1。介绍
糖尿病肾病(DN)是晚期并发症的糖尿病(DM)和导致终末期肾病(ESRD) [1,2]。众所周知,不受控制的慢性高血糖扰乱线粒体电子传递链产生超氧化物。过多的过氧化物等提高了各种途径的改变蛋白激酶c (PKC)通路,先进的糖化结束(年龄)产品,己醣胺、多元醇通路(3]。过氧化物的形成导致增加活性氧(ROS)导致氧化应激,炎症和血管并发症(4,5]。广泛报道,等离子体水平的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)在糖尿病状态(低6,7)会增加心血管疾病的风险。超氧化物歧化酶催化超氧阴离子(O2−)过氧化氢;然而,细胞内的高葡萄糖水平促进活性氧的生产。有三种类型的草皮:(1)SOD1(铜/锌SOD)或细胞内SOD存在于细胞质和细胞核,(2)SOD2 (MnSOD)本地化在线粒体基质中,和(3)SOD3 (ZnSOD)或细胞外的草地中血管细胞外空间和高度血管和心脏中表达(8,9]。
足突细胞损失是DN的早期损伤,导致降低足突细胞密度和增加蛋白尿(10,11]。足突细胞损伤发生早期以来DM和它与糖尿病的累进税大幅恶化。足细胞足突细胞蛋白质的差别也引发对这些损失,如WT-1经历将定位从细胞核转移到胞质(12),和脚之间的粘附蛋白nephrin足细胞的过程。在肾小球损伤的早期阶段,尿的表达nephrin蛋白尿(之前可以检测到13,14]。此外,在糖尿病患者的肾小球,nephrin的蛋白表达降低与对照组(15,16]。高血糖的本身可能诱导激活的瞬时受体电位规范渠道C6 (TRPC6) receptor-operated阳离子通道,表现在足细胞、系膜细胞和内皮细胞;TRPC6表达的几个条件产生不同的结果。Downregulation TRPC6在系膜细胞发生文化在高葡萄糖治疗(17,18]。另一方面,一些研究表明,治疗高葡萄糖增加TRPC6在肾小球和心脏与活性氧相关生产和激活肾素-血管紧张素系统(RAS) (14,19]。
DM常与微血管和macrovascular疾病联系在一起,作为早期到晚期的并发症高血糖条件(20.,21]。慢性高血糖RAS激活,导致肾小球高血压加重内皮功能障碍。然而,这种机制并不完全理解(22]。Endothelin-1 (ET-1)称为一个强有力的血管收缩剂,促进血管收缩剂和血管舒张药物质之间的不平衡(23]。减少生产氧化亚硝酸盐(NO)导致心血管和肾脏损害的累进税由血管损伤的损伤(24- - - - - -26]。等离子体ET-1和微血管病与2型糖尿病的严重程度呈正相关,导致血管功能障碍(27]。失衡和局部生长因子作用于血管的物质导致血管损伤的病理生理学(28]。此外,激活血管活性的,比如RAS,诱发氧化应激促进血管损伤和重塑,改变腔和墙区域(28]。RAS的本质具有里程碑意义的新概念的表征是血管紧张素1 - 7 (Ang-1-7)由ACE2有血管舒张作用[29日]。另一方面,ET-1也有助于血管重建intrarenal动脉肾缺血/再灌注损伤(30.]。
积雪草的(CeA)是一种草本植物,被发现在热带气候国家。它已被广泛用作传统草药由于其抗炎,抗氧化,神经保护作用[31日- - - - - -34]。东航的主要组件是由积雪草酸常用药用,madecassic酸,asiatocoside, madecassicoside。Madecassic酸东航演示了通过降低活性氧的抗糖尿病的作用、过氧化氢酶、谷胱甘肽,增加和减少炎症过程(34,35]。此外,madecassic酸催化剂的一个重要的角色过氧物酶体proliferator-activated受体γ(PPARγ)通过绑定过氧物酶体扩散国的5′上游元件响应元件(PPRE)。这个过程提高胰岛素的敏感性,即使这个过程仍不清楚。PPARγ广泛存在于脂肪组织,肠细胞、巨噬细胞和内皮细胞。一旦激活,兴奋剂PPARγ促进抑制肿瘤坏死因子-α(TNF -α),核因子kappa-beta (NFB),激活蛋白1 (AP-1)。除非,madecassic本身引起的低密度脂蛋白(LDL)通过upregulation CD36 [34,36,37]。
在这项研究中,我们旨在阐明东航的作用治疗在早期或晚期糖尿病的高血糖条件。我们专注于肾小球损伤,介导的血管重建它的抗氧化性能。
2。材料和方法
2.1。动物实验和肾脏收割
DM大鼠模型是通过腹腔注射链脲霉素(60毫克/公斤体重(BW))单剂量(38,39]。纯种雄性老鼠(3个月大,160 - 200克)1个月被分为DM (DM1,n= 5)、DM 2个月(DM2,n= 5),DM-treated东航2个月开始从第一诊断DM(二代,n= 5)和DM-treated东航DM (DM1C1,一个月后n= 5)。东航的ethanolic提取(400毫克/公斤体重)是每日通过口服填喂法。在研究结束时,(2个月)后,老鼠与氯胺酮麻醉(50毫克/公斤体重),甲苯噻嗪(2毫克/公斤体重),和乙酰丙嗪(0.5毫克/公斤体重)。然后,腹部和胸腔打开访问心脏和肾脏。接下来,从左心室器官使用生理盐水灌注0.9%。最后,肾脏是收获,左肾后来沉浸在RNA (Ambion AM7021)和右肾保存在中性缓冲福尔马林(NBF)。
这项研究是根据动物保健指南进行的意大利Gadjah马达思班和已经批准的医疗和卫生研究医学院伦理委员会,公共卫生和护理,意大利Gadjah马达思班,与道德权宜之计数量/颗/ 1211 / EC / 2019。
2.2。积雪草的提取
东航的叶子从默拉皮火山草药Farma获得(商业草药制造商)和隔离方法被描述根据前面的研究(40]。积雪草的(400毫克/公斤体重)41通过口服填喂法)是管理糖尿病诱导后1个月和2个月。这个过程进行的药理和治疗,医学院、公共卫生、护理,意大利Gadjah马达思班。
2.3。RNA提取和互补脱氧核糖核酸的合成
肾脏是使用Genezol RNA提取的解决方案(Genezol™, GZR100)根据协议从制造商。RNA浓度是量化使用nanodrop (Maestrogen、锰- 913 a)。RNA合成到cDNA使用互补脱氧核糖核酸合成装备(SMOBio RP1400) PCR条件:30°C 10分钟。,42°C 60分钟。,和85°C for 5 min.
2.4。反向Transcriptase-PCR (rt - pcr)
反向Transcriptase-PCR放大执行几个具体目标基因包括抗氧化酶,nephrin, TRPC6, ACE2,以挪士,ppET-1使用以下引物的序列(表1):
2.5。血管重建
kidney-embedded石蜡切成4µ米在随后厚度deparaffinized使用二甲苯和患者使用100%,90%,80%,70%乙醇。使用小天狼星红之后,幻灯片被孵化了一个小时来评估在intrarenal动脉壁厚(直径10 - 50米)(30.]。最后,被抓获的幻灯片使用Optilab软件400 x放大的15个随机领域。
2.6。免疫组织化学染色(包含IHC) SOD-1 WT-1
幻灯片deparaffinized使用二甲苯和患者使用100%,90%,80%,70%乙醇,然后跟着抗原检索使用柠檬酸缓冲pH值6和阻止过氧化物酶使用H202在PBS溶液的3%。之后,幻灯片被孵化与阻塞血清(摘要,IHC007),和兔子1圣单克隆抗体SOD1(1: 100年,bios, bs - 10216 - r)和WT-1(1: 50,圣克鲁斯,sc - 192)。最后,幻灯片是孵化poly-HRP Goat-anti兔子和diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)(摘要,IHC007)。评估结果与光学显微镜(奥林巴斯,CX22®),捕获与Optilab软件400 x放大。
2.7。免疫印迹
肾脏是根据Pro-Prep协议中提取TM生物技术(基因内区,17081)。与600年20毫克的肾脏是均质L (Pro-PrepTM解决方案。然后,匀浆在15000转离心液在4°C 20分钟。后来,上层清液分离到10% sds - page和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。接下来,这是初级抗体孵育, - - - - - -肌动蛋白(1:1000年,Abcam ab8227)和SOD1(1: 200年,bios, bs - 10216 - r)在一夜之间,以可视化使用ECL结束'免疫印迹检测试剂(通用电气医疗集团,RPN2232) Geldoc机(Geldoc Syngene Gbox Seri化学xrq)。
2.8。统计分析
23 SPSS软件Windows (IBM公司,芝加哥)是用于分析数据。数据正常测试是使用Shapiro-Wilk和单向方差分析进行正常的数据分布。的 - - - - - -值小于0.05 (< 0.05)被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。消耗的葡萄糖水平,蛋白尿和肾小球硬化症CeA-Treated组
我们表明,链脲霉素注射持续升高血糖水平比对照组( 0.001),降低了东航管理时。CeA治疗糖尿病的早期阶段(二)显著降低血糖水平相比DM2 (= 0.009)。否则,DM1C1没有任何明显的降低血糖水平相比,DM组。蛋白尿是显然的DM2组相对于对照组( 0.001)和DM1组( 0.001)。CeA治疗组、三代或DM1C1相比表现出显著减少蛋白尿的DM2 ( 0.001)。
肾小球硬化症的组织学染色显示正常对照组的形态学特征;然而,DM组显示硬化、粘连、基底膜的增厚,肾小球小动脉的收缩。CeA管理时,这些伤害比对照组明显改善。
3.2。积雪草的提高超氧化物歧化酶
SOD1的mRNA表达和SOD3显著降低DM组;然而,没有变更SOD2 mRNA的表达。的mRNA表达SOD-1 DM1大幅减少(= 0.005)和DM2 ( 0.001)相比,控制。三代显示的mRNA表达的一个重要高程SOD1 DM2(相比= 0.006)而DM1C1显示与DM组没有区别。我们还证明了SOD1蛋白表达降低DM组与对照组相比。二代表现出显著的海拔SOD1的蛋白表达。SOD1蛋白表达降低大幅DM1 (= 0.000),DM2 (= 0.006),二代(= 0.004)和DM1C1 (= 0.000)组与对照组相比。管理东航的二代(= 0.015)改善SOD1相比DM1组蛋白表达。
Hyperglycemia-caused DM增强显著减少的SOD3 DM1 (= 0.004)和DM2 (= 0.003)组与对照组相比。此外,二代证明SOD3 mRNA表达的一个重要upregulation DM1(相比= 0.017),DM2 (= 0.010)和DM1C1 (= 0.038)。
3.3。东航治疗可能与高Nephrin和低TRPC6 mRNA表达
接下来,我们的研究结果表明,mRNA的表达TRPC6 DM1(价格高= 0.002)和DM2 (= 0.001)组与对照组相比。与此同时,只有二代(= 0.005)降低了TRPC6的mRNA表达与对照组相比。nephrin显著降低了DM2组与控制( 0.001)和DM1组(= 0.001)。CeA组引起高nephrin mRNA表达相比对照组(= 0.001)。低nephrin mRNA表达与减少WT-1蛋白表达在肾脏和CeA的治疗恢复了WT-1肾小球的蛋白表达。
3.4。东航ppET-1减少和增加以挪士和ACE2 mRNA表达
然后,我们评估的不平衡引起的血管收缩剂和血管舒张剂,促进血管重建DM。早期的高血糖(DM1组)以挪士mRNA水平增加(= 0.045)与对照组相比。然后,以挪士mRNA表达DM2组下降(= 0.014)与对照组相比。以挪士mRNA表达显著增加DM1C1 (= 0.007)和二(= 0.017)相比DM1组以及三代(= 0.038)相比DM2组。血管收缩剂,ppET-1明显高于DM1 ( 0.001)和DM2 ( 0.001)组与对照组相比。东航治疗高血糖诱导的早期阶段DM显著降低ppET-1 mRNA表达相比DM1 (= 0.019)和DM2 (= 0.001)组。此外,我们评估了ACE2的mRNA表达血管紧张素ⅱ的计数器指针。DM ACE2的差别刺激对这些基因的mRNA表达很明显看到DM2 ( 0.001)与对照组相比。然而,无论是二代(= 0.028)和DM1C1 (= 0.009)提升明显高于ACE2相比DM2组。
3.5。积雪草的治疗糖尿病改善血管重塑
最后,我们证明了东航抑制肾脏血管重建划定增加壁厚和内腔壁面积比(LWAR)糖尿病组。血管壁的增厚明显是在DM2 (< 0.01)相比,控制和DM1组。东航的治疗明显减少壁厚在二代相比,DM2 (= 0.0255)集团以及DM1C1 DM1(相比= 0.0219)。DM1腔壁面积比显著增加(= 0.005)和DM2 (= 0.039)组与对照组相比。东航的治疗高血糖诱导糖尿病的早期阶段(二代,= 0.040)显著减少了腔墙面积比相比DM1组。
4所示。讨论
本研究揭示了东航的保护作用提取早期的高血糖状态,但不是在高血糖状态在DM肾损伤后期发展。东航治疗二组代表东航早期治疗,早在高血糖发生,可能会减弱糖尿病肾病(DN)。DN发起慢性肾脏疾病(CKD)和ESRD加剧了系膜细胞扩张,肾小球基底膜(GBM)增厚,和肾小球硬化症40,41]。由于肾小球滤过屏障(GFB)由内皮细胞,“绿带运动”,割开隔膜(SD),层的损伤导致蛋白尿(42]。在这项研究中,糖尿病肾病是通过一个腹腔内注射诱导(60毫克/公斤体重)导致血糖水平和肾脏损伤的海拔显示高水平的蛋白尿和肾小球硬化症(图1)。高葡萄糖水平导致损伤内皮细胞和系膜细胞由于细胞内葡萄糖的洪水43]。降低血糖水平early-hyperglycemic与东航相关治疗的条件,但不是年末高血糖的状态(图1)。这一发现表明,衰减受伤的部分可能会与血糖降低。
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(c)
(d)
CeA治疗显著降低蛋白尿和肾小球硬化症相比DM2组(图1)。东航的口服500毫克/公斤和1000毫克/公斤体重,显示降糖药效果所介导的α淀粉酶和双糖酶酶抑制在肠道39]。然后,它变弱的血糖水平和血清血脂其次是减少杂食性、烦渴、多尿症(38,42]。的一项研究提到,东航有几个有效的活性物质如积雪草酸、asiatocoside, madecassic酸,madecassoside,套,triptolide [33,44,45),导致减少蛋白尿和肾小球硬化症。此外,asiatocoside的管理和积雪草酸显著减少尿蛋白排泄和血糖水平在糖尿病大鼠模型33,45]。阐明本研究活性化合物可能给东航的reno-protective效果更好的理解在未来。
早期治疗DM可能会减弱氧化应激和CeA的足细胞损伤与SOD-1 upregulation SOD-3, nephrin mRNA表达数据2和3。DM促进激活酶和非酶的途径导致活性氧的生产。激活的年龄和其配体和受体,受体促进glycated-end产品(愤怒),导致促炎细胞因子和内皮表面自由基产品(3,46- - - - - -48]。控制细胞内葡萄糖损失刺激线粒体电子传递链功能障碍,导致活性氧的最大来源3,5,48,49]。抗氧化酶SOD在催化超氧化物阴离子(有重要作用 )过氧化氢和氧分子,从而保护细胞和组织损伤从活性氧50,51]。然而,在高血糖、SOD无法消除多余的活性氧,从而导致抑制SOD1等抗氧化酶(52,53],SOD3 [53)、过氧化氢酶(52但不是SOD2。减少肾脏SOD酶在KK / Ta-Akita 5周后小鼠高血糖介导的肿瘤坏死因子-α和interleukin-1(il - 1 )(53]。过度SOD1-Tg SOD1的老鼠抑制脂质过氧化的孕产妇高血糖导致减少糖尿病胚胎病的易感性53,54]。淘汰赛的SOD3导致减少基底没有活动,增加超氧化物然后导致受损的内皮细胞和血管内皮放松(55]。东航提高抗氧化酶的口服治疗防止脂质过氧化(56),激活PPARγ然后促进胰岛素敏感性,压制TNF -和NFB (37]。
高血糖的条件也导致足细胞损伤。尿中足细胞的分离沉淀物中可以看到DM患者之前蛋白尿(56- - - - - -58]。减少信使rna和蛋白质水平的nephrin DN-induced阿霉素足突细胞结构改变和完整性(33]。我们显示STZ-induced DM明显减少了mRNA nephrin表达式(图2)。TRPC6可能发挥关键作用在足细胞损伤DN。敲除小鼠在秋田犬TRPC-6减毒肾小球硬化症,管状损伤,甚至蛋白尿而促进系膜细胞扩张(14,59]。活性氧诱导肾小球硬化症的upregulation TRPC6在足细胞59,60]。足突细胞文化转染炒siRNA TRPC6目标和Syndecan4 (Syn4),暴露于高葡萄糖增加活性氧,并通过Syn4 TRPC6 [19]。此外,upregulation TRPC6 mRNA的表达观察2型DM患者的单核细胞,促进动脉粥样硬化(61年]。根据我们的数据,衰减的足细胞损伤可能与降低高血糖有关upregulation SOD-1 / SOD-3 mRNA表达CeA TRPC6 mRNA表达的差别,对这些治疗在早期高血糖条件(数据2和3)。然而,我们的研究不能关联恰恰和减少足细胞足突细胞分离标记表达式在我们的研究中。足突细胞分离的底层机制可能会更好的理解机制。
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在这项研究中,我们观察到STZ-induced DM大鼠模型推广upregulation ET-1 mRNA的表达以挪士和ACE2的差别,对这些基因的mRNA表达(图4)。高产量的ROS在DM中扮演着重要的角色在内皮功能障碍通过氧化亚硝酸盐(NO)的失活和激活的肾活素血管紧张素系(RAS)。以挪士有重要作用作为antiatherogenic有很大的相关性,糖尿病血管损伤的发展。以挪士的基因敲除小鼠表现出严重的糖尿病肾病伴发高血压(62年)和血管肥大(63年]。此外,删除ET-1内皮细胞减少氧化应激后肾缺血/再灌注损伤(IRI) [30.)的差别可能与对这些SOD3 mRNA表达(图2)。ET-1显示不同的效果通过Endothelin-A受体(EDNRA)和Endothelin-B受体(EDNRB)产生不同的影响。几项研究表明,增加血浆ET-1与海拔之间的相关性肾小球滤过率(GFR),系膜细胞扩张,和蛋白尿27]。通过抑制增强ET-1水平促进血管功能障碍的生产,进而以挪士生物利用度不足和生产(64年]。ET-1促进肾小球硬化症的角色是由EDNRB;EDNRB拮抗剂bq的政府——788年,ET-1-induced钙瞬变的差别显示对这些通路导致足细胞分离(65年]。
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已经证明,RAS可以扮演一个角色通过ACE-angiotensin二轴和ACE2-Ang1-7轴。血管紧张素ⅱ提出肾ET-1形成从足细胞和驱动器肾小球硬化症和足突细胞分离64年,65年]。另一方面,血管紧张素ⅱ由血管紧张素转换enzyme2 (ACE2)产生Ang1-7展品血管舒张效应(29日]。这种酶显著降低DM条件如图所示的DM2组。药理管理ACE2抑制剂引起蛋白尿和与肾小球病变的严重程度有关29日]。东航的抗氧化作用与分崩离析ET-1 mRNA表达其次是增强以挪士和ACE2 mRNA的表达。
糖尿病的早期阶段显示反渗透法,血管肥大,和血管损伤59]。肾小球滤过率(GFR)的海拔,早期糖尿病的特征之一,与增加血管直径和肾血流量66年]。我们的研究结果与之前的研究一致显示腔的扩张,基底膜增厚,并增加壁厚(图5)。初以来我们证明了东航治疗糖尿病的高血糖条件降低了血管腔区和壁厚区。然而,东航提取物治疗的效果在后期高血糖条件可能不证明肾损伤衰减。
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在这项研究中,我们想要专注于CeA的保护作用在降低DM的发展在糖尿病的早期和晚期阶段。我们将探讨几个方面,包括氧化应激,足细胞损伤,肾小球硬化症,内皮损伤成为我们的主要焦点。尽管如此,这项研究有局限性。一个重要的限制是,这项研究并没有提供一个积极的对照组相比,可能不是用标准化的治疗药物,如格列本脲(67年,68年)和二甲双胍69年]。尽管我们的研究报道,东航治疗糖尿病的早期阶段可以改善随机血糖水平,肾小球硬化症,抗氧化剂水平,足细胞损伤,糖尿病肾病,我们不能阐明东航的有效性与标准化的治疗药物。此外,我们没有提供提取物的质量控制。我们充分认识到质量控制过程为读者提供更多的信息。因此,我们无法确定哪一个活跃的化合物东航了至关重要的作用在DM reno-protective代理或有害的效果。在未来,这些限制需要进一步调查。
5。结论
积雪草的(CeA)治疗DM改善肾小球硬化症和血管损伤的早期阶段通过提高抗氧化酶。然而,治疗东航在DM少的中间阶段,有效地改善了糖尿病肾小球和血管损伤。
数据可用性
数据请求通过联系相应的作者,可以通过补充评估文件。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关这项研究的出版物。
确认
作者感谢Mulyana先生维护动物实验室助理和Klinik印尼语医学院、公共卫生、护理,协助编辑语言。这项工作是由意大利Gadjah马达思班,印度尼西亚,批准号2403 / UN1.P.III / DIT-LIT / PT / 2020。
补充材料
补充表1:特定的抗体免疫组织化学的信息。补充表2:具体为rt - pcr引物对信息。(补充材料)