文摘
客观的。探索复合Shenlu颗粒的临床疗效和机制(SLG)治疗再生障碍性贫血(AA)患者。方法。总共有89 AA患者随机分为SLG支持组(A组,n= 44)和对照组(B组,n西方医疗管理= 45),同时继续。6个月后,血像、中药(TCM)综合征分数,和总体临床疗效率进行评估。血清代谢组学特征观察使用ultraperformance SLG干预后液相色谱-光谱法。结果。的水平红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)和血小板(PLT)增加两组在治疗后6个月( ),在A组,海拔PLT变得更加显著( )。中医症状评分较低在A组较B组治疗后( )。代谢组学数据显示显著差异在病人使用SLG 6个月后,和14生物标记被确定。结论。SLG支持性治疗显示,AA患者积极的结果,和代谢组学数据表明SLG影响氨酰生物合成和glycerophospholipid代谢逐渐恢复正常。
1。介绍
再生障碍性贫血(AA)是一种罕见的疾病和异构2-3-fold更高的年发病率在亚洲国家1]。这种疾病的特点是全血细胞减少症和hypocellular骨髓。各类血细胞计数可以大幅减少,从而使患者更容易感染(2]。
在过去的25年里,取得了显著的改善治疗AA,如同种异体干细胞移植和免疫抑制治疗(3]。然而,由于多个并发症或昂贵的医疗成本,大量的患者寻求支持性治疗重点是改善血液学的概要文件,减少并发症,改善他们的生活质量(4]。
中医药(TCM)已经使用了200多年的治疗各种疾病和被视为一种“补充和替代医学”在中国的医疗保健系统。在中国文学,中医被证明能显著降低AA的恶化和改善AA患者的生活质量5,6]。复合Shenlu颗粒(SLG)是一个经典的医院制剂治疗AA由于肾阳虚模式,已在临床实践中使用了超过十年在上海曙光医院。先前的研究已经报道,SLG表明鼓励改善AA患者。证据显示SLG会调节免疫系统,调节细胞因子的水平Treg细胞的比例;然而,它的治疗物质基础和机制仍未定义(7,8]。
代谢组学是一个功能强大的分析方法评估代谢的特点和交互组件在一个特定期间(9]。通过研究代谢组学的变化,我们可以识别生物标记和生物途径生物系统时刺激或扰动,从而理解疾病和药物的作用[10]。
在这项研究中,我们进行了一个试验性质的临床试验在AA患者评估SLG支持性治疗的临床疗效。此外,代谢组学筛查研究结合模式识别方法进行探索SLG的监管机制。
2。方法和材料
2.1。入选标准
入选标准如下:(一)满足主流医学的AA诊断标准的患者(11)和肾阳虚中药模式识别(12];(b)患者没有其他严重疾病(如心血管疾病、严重肝和肾脏功能障碍,严重的感染,和精神疾病);(c)患者年龄在15 - 80年;和(d)患者自愿参与了这项研究,并签署了知情同意。
2.2。排除标准
排除标准如下:(a)患者怀孕或哺乳;(b)患者诊断为其他血液疾病或恶性肿瘤;(c)患者诊断复杂的中药综合症;和(d)患者未能遵照医嘱服药。
2.3。通用数据
2017年3月至2019年3月,89名患者从上海曙光医院加入了这项研究。采用简单随机化根据电脑生成的随机数序列。所有患者随机分为SLG治疗组(A组,n= 44)和对照组(B组,n= 45)。本研究遵循赫尔辛基宣言和机构伦理委员会批准的上海曙光医院(2020 - sgys - 028)。由所有参与者签署书面知情同意。
2.4。治疗方法
所有登记患者接受了主流医学治疗协议,包括康力龙(4 - 6 mg·d−1mg··tid)和环孢霉素A(3 - 6公斤−1·d−1,血清浓度维持在150 - 250 ng / L)。主流医学的基础上维护,A组患者服用复合Shenlu颗粒,它由以下准备草药:Hongshenxu (红参的尾巴),Lujiao (阿胶山茱萸表示“鹿),Fuzi (川乌说明附子),Rougui (肉桂Cassiae),Tusizi (精液Cuscutae),Dihuang (生地),Zhiguiban (处理龟甲),Buguzhi (补骨脂),Gouqizi(枸杞子)和Roucongrong (肉苁蓉)。常规的中医草药散装进口来源在上海和由中药制成颗粒中心上海曙光医院(批号:200202)。门诊每剂用量是12克,一天三次用温水交付。治疗期间两组持续了6个月。
2.5。结果
2.5.1。常见的指数
性别、年龄、体重和身高,和当前和过去的病史记录。药物治疗6个月后,空腹血液被收集并存储在冰箱里(−80°C)分离血清后进行进一步分析。
2.5.2。疗效指标
(一)血图:患者每月常规血液检查。(b)中医综合症评估:中医综合症分数评估根据2010年的临床诊断和治疗方案。
2.5.3。疗效评价标准
在主流医学标准如下。(一)基本治愈:贫血和出血消失,血红蛋白水平的120 g / L的男性和女性患者110 g / L, 1年内没有复苏。(b)缓解:贫血和出血消失,血红蛋白水平的120 g / L的男性患者和女性患者的110 g / L。白细胞(WBC)计数达到3.5×109/ L,血小板计数显示有所改善。3个月内疾病保持稳定或有所改善。(c):改善贫血和出血transfusion-independent方式明显改善,和血红蛋白增加超过30 g / L。疾病保持稳定的时间超过3个月。所有三个标准都应该评估的条件没有输血在过去3个月。(d)无效:症状和治疗后血图没有明显改善。疾病控制率定义的总速率基本治愈,缓解和改善患者。中医标准:分数提高率=(评分在治疗后−分数)/评分在治疗之前×100%。
2.6。样品制备对代谢组学
6个月的治疗后,两组患者的血清被撤−80°C的温度在4°C冰箱和冷冻。二百毫升的血清正是转移到1.5毫升离心管,和600年μL冷甲醇浸入。管是混合了30年代和离心10分钟在14000 rpm,和样品溶液制备。质量控制(QC)样本由混合20μ从每个样本血清L和提取使用相同的程序作为测试样本。两个QC样品插入定期每10个样本。
2.7。UPLC-MS分析
UPLC-MS进行热Accela 1250 UPLC / Q-Exactive系统(热费希尔科学、圣何塞、钙、美国)配备一个二进制溶剂输送泵。海泼斯尔合金黄金C18柱(身份证。,1.9 μm;使用热费希尔科学)。溶剂:列是维持在40°C,和分离是通过使用以下梯度:0 - 2% B, 0 - 0.5分钟;2 - 30%,0.5 5分钟;和B 30 - 98%, 5 - 10分钟;成分98% B举行6分钟,然后回到2% B .流量设定在0.30 mL / min, B是乙腈(0.1%甲酸)和水甲酸(0.1%甲酸)。注入体积是2μl .质量光谱数据收集使用的电喷雾电离(ESI)源操作或正面或负面离子模式的范围70 - 1050米/z。碰撞能量是15到40 eV (15 -−−40 eV)为每个运行。
2.8。统计分析
统计分析与SPSS 20.0进行。数据表示为平均值±标准错误(SE)。连续变量,使用非参数Mann-Whitney不是正态分布进行了分析U测试。正态分布分析了连续变量使用未配对的学生的t测试。分类变量使用卡方检验进行比较。双面的小于0.05的值被认为是具有统计学意义。
原始的代谢组学数据分析复合发现者2.0软件(热费希尔科学、圣何塞、钙、美国)。RT对齐后,峰值歧视、离子过滤和识别,得到三维数据表包括的文件米/z、RT和强度,米/zrt对被用作标识符为每个特性。矩阵中提取,在每组80%以上是常数,或发现他们被删除。积极的模式和消极的模式数据组合成一个组合数据集,然后导入到SIMCA 14.0软件(Umetrics、期刊、瑞典)。意味着定心和单位方差比例后,主成分分析(PCA)和正交偏least-squares-discriminant分析(OPLS-DA)进行分析代谢改变。变量重要性的投影(VIP) > 1.0被认为是相关的歧视。KEGG (http://www.kegg.jp/)和MetaboAnalyst 3.0 (http://www.metaboanalyst.ca/)被用来识别的代谢途径。
3所示。结果
3.1。病人的特点
试验过程中,89名患者中有9撤回:五组和四组患者组(n= 39)是41.08±2.05岁(平均±SE),其中包括19名男子和20名女子。患者在B组(n= 41)是40.24±2.19岁,其中包括23个男性和18个女性。没有显著差异在两组之间的通用数据( )(表1)。
3.2。血图的比较
没有不同的血像的患者在治疗前组( )。6个月后,在A组的白细胞计数显著增加,从3.31±0.25×1094.32±0.21×10 / L9/ L ( ),而在B组,没有发现显著差异( )。加拿大皇家银行的水平和Hb增加两组( ),只有在A组,PLT成为重要的增加( )(表2)。
3.3。中医证候评分和疗效比较
没有观察到的差异的中医症状评分两组治疗前(12.2±0.69,11.9±0.51, )。治疗6个月后,两组中医症状改善,和综合症成绩显著下降(6.4±0.50,7.9±0.60, )。中医症状评分较低在A组较B组治疗后(图1; )。的患者完成了研究,疾病控制的A组为79.49%,B组为68.29% ( )。
3.4。血清代谢物鉴定
总共有2213年的峰值检测到UPLC-MS从80份血清样本(图2)。集中质量控制样品聚集紧密的主成分分析模型,说明优秀的可重复性。中医是否影响代谢模式和确定重大变化的代谢物,OPLS-DA使用。得分情节产生OPLS-DA模型显示一个明确的两组(图之间的分离3(一个))。OPLS-DA模型显示R2X值为0.22,一个R2Y值为0.87,问2(和)值为0.491(图3(一个))。四倍交叉验证的R2Y和问2表示良好的适应性和可预测性,负面的问2从999年排列测试建议OPLS-DA没有过度拟合模型。结果表明,有16个积极和43个负离子模式不同的代谢物在6个月的治疗后两组,其中14个代谢物,包括氨基酸、鞘脂类,glycerophospholipids,和其他内源性化合物,可以被识别(表3)。
(一)
(b)
(一)
(b)
基于14个潜在生物标记物在两组之间,基于MetaboAnalyst 3.0进行路径分析。如图4,潜在的目标氨酰生物合成代谢途径,glycerophospholipid新陈代谢,亚油酸的新陈代谢和鞘脂类代谢( )。
3.5。不良反应
报告的最常见的副作用是轻度胃肠道症状,如腹胀,便溏,便秘。恶心是由2例报道。所有症状为吸毒后适当的解决方向。没有变化观察到肾或肝功能与基线水平相比。
4所示。讨论
中医综合治疗和WM在中国是一种常见的做法,采用常规的临床治疗AA (4]。在这项研究中,我们发现SLG治疗基于肾脏增强模式添加到他们的持续的支持管理导致疾病控制率较高,在中国以前的出版物是一致的(13,14]。代谢组学分析表明,摄入SLG AA患者带来了重要的生化变化。SLG的影响主要是影响氨酰生物合成和glycerophospholipid AA患者的代谢,表明SLG治疗逐渐把氨基酸和脂质代谢患者恢复正常。
根据中医的原理,肾脏的主要作用是储存精华,主导发展和繁殖,控制骨,滋养骨髓(15]。本质和血液来源基本相同,而本质可以转变成血。肾实质是骨髓的起源。复合Shenlu颗粒的公式是基于中医理论设计的,和许多的草药配方被分类为“滋养肾脏和血液。“现代生物医学科学已经显示,红参和Lujiaojiao能促进造血作用由多个机制,包括造血祖细胞克隆形成单位扩散细胞(16),抑制炎性细胞因子(17,18),抑制细胞凋亡,扰动异常信号通路(19]。一些组件的SLG的草药也有免疫调节活动报道(枸杞子、龟壳、烤补水果,舟形乌头,精液Cuscutae、肉桂等)或hemopoiesis-promoting活动(地黄根,肉苁蓉等)(14,20.- - - - - -22]。
中药的处方通常基于TCM-type诊断患者的综合症,这是一个练习中医理论中固有的个性化治疗。人们已经发现,中医有一个关系类型的AA和免疫功能23]。基于肾脏增强模式,我们发现经济复苏的血像SLG联合治疗组的疗效优于单独主流医学。白细胞计数和血小板恢复更大的改善中药组及中医症状评分显著降低后6个月和单独的主流医学相比。类似的结果治疗骨髓增生异常综合征,骨髓纤维化,地中海贫血中医混合物(14]。
代谢组学可以发挥积极作用在疾病控制率评估和澄清的中医机理24]。我们的代谢组学研究表明,氨基酸和脂质代谢有显著差异后中药治疗。相关的代谢产物氨基酸和脂质合成相关免疫功能和细胞膜,最终可能影响治疗的效果。
色氨酸代谢的改变通路SLG患者中确定。色氨酸可以参与不同的通路,包括犬尿氨酸通路,据报道是由改变免疫反应(25]。低水平的色氨酸往往与增加氧化应激反应和各种疾病,包括癌症、神经退行性疾病,再生障碍性贫血(26]。的代谢物indole-3-acetamide确定从另一个色氨酸代谢通路,也观察到由中医治疗(27]。我们的研究结果表明,SLG实践导致色氨酸代谢的改善AA患者。鉴于色氨酸代谢的中介效应在免疫系统中,代谢紊乱可能是管制。
Glycerophospholipid还确定了代谢调控SLG联合治疗组,与电脑调节和显著升高(VIP > 1 )。电脑最大的glycerophospholipid哺乳动物。他们提供了生物膜的主要结构成分和膜脂质细胞内。膜化学成分和代谢紊乱的变化在某些类型的细胞中观察到AA患者(28]。在这项研究中,对glycerophospholipids SLG有强烈影响,这可能的影响,维持细胞的正常功能和提高脂类代谢,从而稳定细胞膜。
还确定了苯丙氨酸代谢的SLG联合治疗组。苯丙氨酸,这是其中一个重要的芳香族氨基酸生产各种蛋白质,一直作为氧化应激生物标志物(29日]。此外,它可以翻译成酪氨酸在肝脏等身体组织。之前有研究表明,免疫,肝、肾功能异常、神经系统疾病、继承,与苯丙氨酸代谢紊乱和其他因素显著相关(30.,31日]。维持正常代谢的苯丙氨酸可以帮助确保身体的成长,发展,和生理学。在这项研究中,结果表明,苯丙氨酸含量SLG组增加血液中,这可能表明,免疫功能提高,影响了苯丙氨酸代谢途径。
这是一个试点临床试验调查SLG综合治疗的临床疗效和影响内源性代谢物为AA。研究的样本量相对较小。大样本长期研究是必要的,为了消除遗传背景的差异,如果统一的饮食和生活习惯可以纳入控制,结果会更有意义。基于这项研究中,一个长期的临床试验将由我们的团队评估SLG的安全性和有效性为AA在不久的将来。
5。结论
在这项研究中,临床试验表明,SLG和WM疗法在AA的治疗有积极作用。根据肾加强综合症,血细胞在SLG联合治疗组的疗效优于WM独自集团和中医症状评分显著降低后6个月。代谢组学研究基于UPLC-MS分析说明SLG氨基酸和glycerophospholipid代谢的影响,这可能提供新的见解的潜在机制。
缩写
| AA: | 再生障碍性贫血 |
| 应急服务国际公司: | 电喷雾电离 |
| 血红蛋白: | 血红蛋白 |
| OPLS-DA: | 正交偏least-squares-discriminant分析 |
| PLT: | 血小板 |
| 主成分分析: | 主成分分析 |
| 质量控制: | 质量控制 |
| 加拿大皇家银行: | 红细胞 |
| RT: | 保留时间 |
| SLG: | 复合Shenlu颗粒 |
| 中医: | 中国传统医学 |
| UPLC-MS: | Ultraperformance液体色谱-光谱法 |
| 贵宾: | 变量重要性的投影 |
| 白细胞: | 白血细胞 |
| WM: | 西方医学。 |
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
周枫和肖颖胡锦涛同样起到了推波助澜的作用。
确认
这项工作得到了中国传统医学的优势培养项目,血液学专业;培养项目主要疾病的中医(项目号zybz - 2017006);中医和特殊培养项目上海市卫生委员会(项目没有。3049)。
补充材料
图S1:线块质量控制(QC)利用主成分分析法(PCA)样本生成使用组件1和2。峰面积偏差可以通过分布的评估运行(X设在:运行秩序;Y设在:标准差)。(a) QC情节第一组件从LC -电喷雾质谱(+)数据,(b)质量控制图的第二个组件从LC -电喷雾质谱(+)数据,(c)质量控制图的第一个组件LC - ESI - ms数据,和(d) QC情节第二组件从LC - ESI - ms数据。表S1: SLG干预后信息的潜在生物标志物。(补充材料)