文摘
背景。糖尿病患者内毒素已经被认为是2型糖尿病(T2DM)病人体内的特点。最近的研究表明,肠道泄漏糖尿病内毒素扮演关键的角色。皮质Mori (CM)已被广泛应用在中国改善2型糖尿病的发展,但其对内毒素的影响是未知的。方法。这项研究是由两个部分:(1)体内研究厘米在db / db小鼠糖尿病内毒素。八个正常C57BL / 6小鼠组控制;(2)体外研究mulberroside糖尿病内毒素(MBA)厘米。潜在机制的MBA在改善糖尿病内毒素也探索。结果。目前的研究发现,厘米水提取物降低血糖水平,改善肝脏和肾损害在db / db老鼠,和改善糖尿病内毒素( )。我们还发现,水提取物增强肠道的完整性和减少肠道炎症蛋白质ICAM-1表达db / db)染色和免疫组织化学方法检测到的老鼠。在体外研究中,MBA下降引起的MDA和ROS水平有限合伙人( )和增强肠道上皮屏障的完整性( )。结论。我们发现皮质Mori及其活性成分mulberroside保持肠道完整性可以改善糖尿病患者内毒素。
1。介绍
2型糖尿病(T2DM)病人体内已经被认为是一种流行疾病。尽管一系列anti-T2DM特工出现在这十年中,如GLP-1类似物(1),这种流行趋势似乎不群。普遍的西餐,更重要的是,这一趋势正变得恶化。因为遗传因素不应该在几十年内戏剧性的改变,环境因素必须扮演一个角色。此前,格和他的同事们(2)第一次表明,中和促炎细胞因子有助于改善发展2型糖尿病;自那时起,这个词“糖尿病内毒素”建议,“抗炎”已经被贴上一个评估治疗效果的指标在临床的设置。在这十年中,逐渐认识到,肠道菌群失调可能是糖尿病内毒素的来源(3,4),肠道微生物群的失调会导致肠道通透性的增加最终导致代谢内毒素和更高的等离子体脂多糖(LPS) [5,6]。从这个意义上说,保持肠道完整性被认为有利于扭转这种内毒素的影响。
皮质Mori (CM)的干燥根皮桑属阿尔巴l。几个世纪以来,厘米被用于糖尿病的治疗。以前,齐和他的同事们(7)提取能有效改善糖尿病hyperlipidaemia发现厘米。一项研究[8)表明,CM提取浓度依赖性抑制cox - 2和铂族元素的生产2体内和体外抗炎作用。然而,厘米对糖尿病内毒素的影响没有被调查。
目前的研究是由两个部分:(1)体内研究糖尿病内毒素的CM db / db老鼠和(2)的体外研究组件从CM (mulberroside)糖尿病内毒素和其潜在的机制。
2。材料和方法
2.1。材料、试剂和动物
皮质Mori (CM)从亳州买中草药市场(安徽、中国)。标准mulberroside (MBA)是来自中国国家食品和药物控制机构(中国,北京)。二甲双胍是购自GBCBIO技术(广州)。脂多糖(LPS)是来自σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。ELISA试剂盒对高级糖化终端产品(年龄)和有限合伙人从程琳购买生物科技公司(中国,北京)。包对丙氨酸转氨酶(ALT或GPT),谷氨酸草酰乙酸的转氨酶(AST),糖化血红蛋白,肌酸酐(Cr)建成(南京、江苏、中国)。3 - (4、5)-Dimethylthiazo (-z-y1) 3, 5-diphenytetrazoli-umromide (MTT),主要抗体带occludens蛋白1 (ZO-1) occludin, ICAM-1, p-p38 MAPK, p38 MAPK和购买的圣克鲁斯(美国)。包mAlb源自Westang(上海,中国)。对il - 1包β、引发MCP-1, TNF -α买来Neobioscience(中国深圳)。MDA、活性氧检测试剂盒来自Beyotime生物技术(中国,北京)。杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM),胎牛血清的边后卫,胰蛋白酶,MEM不必要的氨基酸溶液,谷酰胺获得Gibco(大木屋,美国)。DAPI Cy3——, FITC-conjugated二级抗体由博士德(武汉,中国)。24-well transwell细胞培养板(挂插入直径6.5毫米,膜面积0.3厘米2)从康宁公司(美国纽约康宁)。电阻检测系统(Millicell ESR-2)从微孔(美国Billerica的)。其他试剂和试剂盒从商业来源。
雄性C57BL / 6和db / db小鼠体重20 - 30 g由地下实验室动物有限公司(常州,中国),和正常食物饮食或高脂肪饮食,分别管理的动物。所有动物保健和调查符合指南发表的实验动物保健和使用由美国国家卫生研究院(NIH出版85号- 23,1996年修订),并通过澳门科技大学。动物们保持在12/12 h光/暗周期。在药物干预之前,所有的动物在动物房为3天,使它们适应环境。
2.2。制备皮层Mori水提取物(ECM)
干粉的皮质Mori(厘米,300克)和双重蒸馏水浸(3000毫升)和连续煮2 h的恒温器。水萃取混合物过滤,浓缩与R2002旋转蒸发器,150毫升的水提取物和股票的解决方案厘米(ECM)获得浓度为2 g / ml。药材的解决方案是透过一个0.45μm膜。最后,股票的解决方案是用水稀释到1.25克/毫升(高剂量),0.58克/毫升(中等剂量)和0.31克/毫升(低剂量),然后储存在4°C到使用。
2.3。动物分组和药物管理局
糖尿病动物(老鼠db / db)随机分为5组如下:(1)负对照组(n= 6);(2)阳性对照组(动物管理与二甲双胍(0.15克/公斤体重,n= 6);(3)低剂量皮质森集团(0.91克/公斤体重,n= 6);(4)中等剂量皮质森集团(1.82克/公斤体重,n= 6);和(5)高剂量皮质森集团(3.64克/公斤体重,n= 6)。八个正常C57BL / 6小鼠组控制。每一天,所有的动物都是用药物管理如上所述或0.45毫升生理盐水(正常和模型组动物)填喂法连续5周。在实验结束时,血液样本为生化检查,收集动物牺牲,结肠组织学评价样本收集。
2.4。血液化验
血液细胞计数测量了华贵的医院的临床实验室隶属于暨南大学(广州)。血液糖化血红蛋白,年龄、AST、ALT、包子、Cr、有限合伙人,MCP-1由包根据协议由制造商提供。
2.5。苏木精和伊红染色和Immunohistological评价结肠
结肠癌在4%多聚甲醛固定24小时,然后paraffinized。为观察,部分(0.4μm)与苏木精和伊红染色为5分钟())的解决方案,和结肠组织病理学图像的光学显微镜下观察(奥林巴斯、东京、日本)。immunohistological评价结肠,部分是第一次孵化主要抗体ICAM-1 (1: 200);然后,biotin-conjugated二级抗体和streptavidin-biotin酶复杂被添加到部分开发布朗存款(阳性染色)。
2.6。细胞培养
人类上皮结直肠腺癌(Caco-2)细胞从美国购买类型组织集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。细胞在DMEM保持10%胎牛血清的边后卫,青霉素和链霉素1%,1% MEM不必要的氨基酸,细胞培养中谷酰胺孵化器。
2.7。MTT试验
评估的影响有限合伙人和mulberroside (MBA)细胞生存能力,细胞MTT(5毫克/毫升)处理4 h紧随其后的是二甲亚砜(DMSO)孵化。490纳米的吸光度由分光光度计。
2.8。细胞抗氧化活性实验
细胞抗氧化活性评价通过确定水平的丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)的药物干预后根据制造商的指示。
2.9。免疫荧光分析
Caco-2细胞被播种在幻灯片上。与车辆接受治疗后,有限合伙人(100μg / ml),或有限合伙人+ MBA (70μ米),细胞用4%多聚甲醛固定。然后,主要抗体包括ZO-1 (1: 100), occludin (1: 100), p-p38 MAPK(1: 100),或p38 MAPK(1: 100)被添加到培养细胞。DAPI用于核染色和FITC -或Cy3-conjugated二级抗体应用于荧光显微镜下观察蛋白质的表达或激活(奥林巴斯、东京、日本)。
2.10。Inflammatory-Related细胞因子测定
有限合伙人和炎性细胞因子包括il - 1的水平β肿瘤坏死因子-α药物干预后,引发决定根据制造商的指示。
2.11。肠上皮屏障评价
一个体外肠上皮屏障模型是根据我们以前的报告(9]。一般来说,Caco-2细胞的密度1×105被播种上的膜transwell系统,进一步培养21天;然后,汇合的单层是获得transepithelial电阻(te)超过400Ωcm2。药品监督管理局24 h后,上层添加与有限合伙人;最后,水平有限合伙人transwell决心的下议院。
2.12。统计分析
数据被表示为平均值±标准偏差(SD)。与单向方差分析方法应用SPSS 19.0软件进行数据分析。的值为0.05或更少被认为是统计显著。
3所示。结果
3.1。血糖化蛋白质
高血糖是糖尿病人最显著的现象。长期接触的血红蛋白和其他形式的血浆葡萄糖会促进蛋白质非酶的糖化通路并生成糖化蛋白质,即糖化血红蛋白或高级糖化终端产品(年龄)。因此,糖化蛋白的水平可以反映平均血浆葡萄糖浓度在长时间的时间。确定如果口头CM管理可能影响这个糖化,糖化血红蛋白水平和年龄被工具检测到。如数据所示1(一)和1 (b),药品管理局与二甲双胍或厘米可以显著降低糖化血红蛋白水平和年龄与糖尿病模型组相比,在中等剂量和CM有更多影响降低年龄水平与高或低剂量(图1 (b))。
(一)
(b)
3.2。肝脏和肾脏功能
厘米水提取物对靶器官的影响评估糖尿病、肝脏和肾脏功能测定。图中所描绘的一样2(一个)和2 (b)CM管理在低剂量和中剂量不会肝功能恶化的ALT和AST水平没有显著高于DM组。对于肾功能,我们确定尿包(图2 (c)),Cr(图2 (d)),比mAlb / Cr(图2 (e))。我们发现在DM小鼠肾脏功能显著受损;在这一点上,所有的三项指标明显升高,而政府厘米在低或中等剂量可以显著降低肾功能指标。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.3。CM改善糖尿病小鼠内毒素在db / db
2型糖尿病已被公认的低度炎症疾病,和炎性细胞浸润的特点(10]。在目前的研究中,我们发现,白细胞(WBC)的数量大大增加了与正常小鼠相比(图3(一个)),和管理与低或中等剂量的厘米可以显著减少白细胞水平;更重要的是,中等剂量的CM具有更显著的影响较低或高剂量。我们还观察到异常淋巴细胞的数量(阿里)在糖尿病动物显著增加,这高度可以减少任何药物干预这一实验(图3 (b))。目前的数据表明CM中剂量对改善糖尿病和有益效果diabetic-inflammatory细胞浸润。
(一)
(b)
(c)
(d)
炎性细胞浸润依赖炎症化学引诱物蛋白质的表达。MCP-1也研究了它在调节炎症细胞浸润作用[11]。我们观察到在当下研究MCP-1显著增加了糖尿病模型组与正常小鼠相比,和管理与二甲双胍或低/中剂量的厘米可以显著减少MCP-1水平(图3 (c), 比糖尿病组)。
脂多糖(LPS),也被称为内毒素,已发现升高糖尿病糖尿病内毒素(人口和共享的重要组成12]。在目前的研究中,我们发现血清水平的有限合伙人在糖尿病小鼠与正常小鼠相比增加了7倍(图3 (d));二甲双胍和CM治疗显著降低LPS水平( 与糖尿病组);更重要的是,低或中等剂量的CM管理更重要的效应与二甲双胍相比,在降低血清有限合伙人( )。众所周知,有限合伙人是一种革兰氏阴性细菌的细胞壁的重要组成部分。从这个意义上讲,gut-sourced革兰氏阴性细菌(或所谓的bad-microbiota) overproliferation伴随着肠道屏障完整性损害可能发挥作用在糖尿病内毒素。
3.4。CM保存肠道完整性和减少促炎细胞因子的表达
验证CM干预是否能保持肠道的完整性和抑制“gut-leak”介导糖尿病内毒素,我们进行苏木精和伊红染色())和immunohistological评价肠道。如图4(一),肠道生理障碍是严重受损的肠道上皮细胞从基底层分离;一旦动物服用二甲双胍或厘米,肠道的完整性明显恢复;更重要的是,中等剂量的厘米对保持肠道完整性的影响更重要;,这个剂量管理可以恢复肠道的完整性的正常状态的组织学评估。
(一)
(b)
炎性细胞浸润明显减少了CM管理中等剂量,我们想知道如果有任何炎症蛋白参与了这一过程。ICAM-1是公认的糖尿病和参与开发之后炎性细胞浸润(13]。为了证明我们的假设,其表达式是由免疫组织化学方法。如图4 (b),ICAM-1表达伴随着炎症细胞浸润在糖尿病大鼠显著增加,和中等剂量的CM显著逆转ICAM-1表达式和白细胞浸润。收敛从上面发现,我们的结论是,口服与CM对糖尿病内毒素,会有积极的影响和潜在的机制可能对其功能属性保护肠道屏障的完整性。
3.5。Mulberroside从CM增强Caco-2细胞的抗氧化活性
Mulberroside被发现是一个活跃的组件已经证明拥有多个活动。氧化应激损伤被认为参与肠道泄漏和糖尿病内毒素的发展。调查如果MBA拥有一些影响这方面,Caco-2细胞孵化24小时用药物;然后,MDA的文化上层清液收集检测和ROS水平观察细胞的免疫荧光方法。如数据所示5(一个)和5 (b)明显,LPS刺激的MDA和活性氧水平升高Caco-2细胞,和MBA干预显示令人满意的影响降低到正常水平。
(一)
(b)
3.6。MBA增加肠道的完整性
评估MBA对肠道上皮屏障,我们构建了一个由transwell Caco-2细胞单层细胞培养系统。Transepithelial电阻(te)在单层与Millicell-ERS电阻测量系统和有限合伙人从参议院众议院在单层决心。如数据所示6(一)和6 (b),有限合伙人显著降低三通是伴随着高渗透率单层下议院(有限合伙人的 ),和治疗与MBA加强了单层的完整性。
(一)
(b)
(c)
(d)
两个关键因素包括细胞生存能力和细胞间紧密连接导致肠道屏障的完整性(14]。在目前的研究中,我们没有发现一个重要的MBA对增加Caco-2细胞生存的影响(图7(一)),我们想知道后药物管理局紧密连接条件。在目前的研究中,两种紧密连接蛋白的表达包括ZO-1和occludin进行了研究。我们可以看到在图6 (c),这些结蛋白高表达在正常Caco-2细胞,和有限合伙人管理明显减少他们的表达;最少、MBA干预改善这减少。
(一)
(b)
(c)
(d)
进一步调查的潜在机制,观察细胞内信号通路的激活状态。p38MAPK信号通路的研究发展糖尿病内毒素的作用。如图6 (d),total-p38MAPK量正常,有限合伙人和有限合伙人+ MBA组在相似的水平。有限合伙人孵化p38MAPK显著激活,其磷形式(p-p38MAPK)显著增加;当细胞进一步管理MBA有限合伙人后,激活p38MAPK显著抑制。
4所示。讨论
代谢内毒素现在已经被公认为一个风险因素是紧密伴随着二型糖尿病的发病和进展(15,16]。虽然仍然是一个冲突来源的内毒素,学者们从基础研究和临床医生取得了共识,抑制内毒素有助于减弱的发展2型糖尿病。在中国许多草药用于治疗糖尿病了数百年。然而,大多数的影响机制是未知的。在目前的研究中,我们调查了皮层Mori (CM)对糖尿病的影响在db / db小鼠内毒素;活性成分的影响,同时进行体外研究。
此前,格和他的同事们(2)第一次表明,中和促炎细胞因子有助于改善发展2型糖尿病;自那时起,术语“糖尿病内毒素”建议,“抗炎”标签的临床治疗效果评估的指标。最近,肠道的关键作用在保护身体健康状态已经越来越多的认可。肠道屏障功能障碍将导致“gut-leak”和促进gut-sourced病原体的入口或毒素进入血液循环;从这个意义上说,如果这个源不介入,它可能持续激活炎症细胞和扩大生产internal-derived炎性细胞因子,最后,出现糖尿病内毒素。不幸的是,没有满意的策略或药物,目前可以解决这个问题。
皮质Mori(厘米,唱呗π在中国)的根源桑属阿尔巴L,传统上用于治疗糖尿病炎症(17,18]。首先对db / db小鼠,观察其影响血液和组织学实验进行。我们发现,在中等剂量口服厘米水提取物具有显著的影响在减少糖化蛋白质含量(糖化血红蛋白和年龄),改善糖尿病肾病,减少糖尿病大鼠在db / db炎症。血液水平的一个重要的发现是,有限合伙人在CM提取物显著降低应用程序。作为有限合伙人不能从内部生成源,我们假定厘米可能具有保护作用抑制外包有限合伙人进入身体。为此,进行了组织学实验。通过圆)染色,我们观察到肠道屏障在糖尿病小鼠受损严重,和CM管理极大地保留其完整性。此外,CM管理显著减少的表达在肠道壁ICAM-1和炎性细胞浸润。我们的研究结果表明,CM可能改善糖尿病内毒素通过增强肠道的完整性。据我们所知,这是第一个报告,对肠道厘米有影响。
在目前的研究中,我们发现,低或中等剂量的厘米在糖尿病小鼠具有保护作用,而高剂量厘米增加血清ALT, AST,肌酐,有限合伙人的水平。我们假定这些副作用可能归因于over-high-dose厘米应用程序。一方面,高剂量厘米超过老鼠的代谢能力,从而诱导损伤相关的器官,如肝脏和肾脏;另一方面,与大剂量口服厘米诱导高渗损伤在肠道,因此提升肠道泄漏和糖尿病炎症。然而,确切原因仍有待充分解释道。
MBA是活性成分之一,据报道,有各种各样的活动。核实之后如果MBA对保持肠道完整性的影响改善糖尿病内毒素,设计一系列的体外研究。Caco-2细胞是结肠上皮细胞系,已被广泛应用于作为模型来研究肠道屏障的完整性(19]。以前,我们已经成功地构建了一个单细胞的肠道屏障模型利用Caco-2细胞(9]。在目前的研究中,采用Caco-2细胞系,有限合伙人是用于刺激Caco-2细胞损伤模拟糖尿病肠上皮屏障的损害。我们目前的体外疾病模型从歌曲和他的同事们支持以前的报告20.],有限合伙人政府将诱发小鼠肠道伴随上皮细胞的泄漏损失。
上皮细胞损失和炎症是糖尿病内毒素的特点,来验证体外效果的MBA LPS-induced Caco-2细胞受损,细胞生存能力和炎性细胞因子分泌首次研究。报告表明,细胞因子包括TNF -α和il - 1β促进炎症细胞的招聘和渗透和此后夸大炎性损伤(21]。意外,我们没有观察到显著的影响MBA的增强细胞活力和扭转LPS-induced Caco-2细胞中炎性细胞因子的分泌。所以,我们从这一发现得出MBA可能没有直接对抑制炎性细胞因子分泌的影响。氧化应激是糖尿病的特点之一,和过度氧化应激可能直接诱发细胞有助于肠道的泄漏损失。我们注意到MBA有大量的“-哦”结构,我们假设它可能拥有一些对氧化应激的影响。幸运的是,我们发现MBA对LPS-induced氧化应激有明确的效应降低MDA和细胞内ROS水平。
正如上面所讨论的,肠道泄漏将导致腔的paracellular入侵的抗原和毒素进入血液循环22,23]。最近的理解描述的重要性胃肠道障碍发展的DM(漏水24]。肠上皮细胞间的紧密连接是一种天然的屏障对肠毒素和细菌的侵入血液循环(25,26),和细胞数量和细胞之间的紧密连接蛋白的两个重要因素,确保肠道屏障的完整性(19,27]。因为我们没有观察,MBA对肠道上皮细胞有保护作用的可行性,我们想知道如果它有一些影响紧密连接蛋白的表达。我们发现MBA管理显著高表达紧密连接蛋白的表达,包括ZO-1和occludin。我们现在发现是根据有限合伙人管理可以减少紧密连接蛋白的表达,增加paracellular渗透率(20.]。我们发现是进一步验证;,有限合伙人在肠道上皮屏障的渗透率下降,三通是增强的MBA管理。
正如上面所讨论的,内毒素已经发现的关键因素之一,糖尿病,促进发展和肠道泄漏可能是一个新的目标在预防疾病进展(15,16]。在目前的研究中,我们发现口服皮质的提取Mori降低血清水平的有限合伙人和保护肠道屏障的完整性。因此,我们发现在Caco-2细胞底层机制。以前,Koistinen和他的同事发现,p38 MAPK信号通路导致骨骼肌细胞胰岛素抵抗[28]。除此之外,p38 MAPK也被证明是至关重要的细胞信号通路介导炎症和紧密连接蛋白的表达。据报道,激活p38 MAPK将增加炎症细胞因子表达和分泌,而这将减少上皮细胞之间的紧密连接蛋白的表达(29日,30.]。进一步研究其作用MBA-mediated肠道屏障功能完整性、激活免疫荧光方法进行了研究。我们发现有限合伙人显著降低三通和p38 MAPK激活,而MBA管理水平显著降低p-p38 Caco-2细胞MAPK和增加肠道屏障的完整性。
总之,我们证明了在当下,口服皮质Mori水提取物能改善糖尿病内毒素通过增强肠道的完整性。通过在体外研究中,我们表明,MBA对LPS-induced肠道上皮屏障损伤有很大的影响,抗炎,抗氧化压力,并提高紧密连接蛋白的表达参与它的保护作用,以及p38MAPK参与这个过程。我们现在发现可能供应新奇的想法从中药抗糖尿病的药物的研发。
数据可用性
本研究的数据集用于支持这些发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项研究得到了国家自然科学基金(81501271)和南京医学科学技术发展基金会、南京、江苏、中国(QYK11142和YKK15149)。