文摘

黑种草l(NS)和它的挥发性化合物是众所周知的广泛的影响。本研究旨在探讨化学成分和可变性在体外5精油的抗菌活性(Eos)来自摩洛哥、沙特阿拉伯、叙利亚、印度和法国。这五个样本不同的土壤和气候条件下生长。琼脂扩散法和采用方法96 -孔板被用来测试临床分离耐多药菌株的敏感性(耐甲氧西林的病人金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,铜绿假单胞菌,鲍曼不动杆菌),测定最低抑制浓度和杀菌浓度。在所有的调查中Eos,单萜化学成分中。摩洛哥、沙特阿拉伯和叙利亚种子特征的存在α-phellandrene (20.03 - -30.54%),β甲基异丙基苯(12.31 -23.82%)和4−caranol (9.77 -14.27%)。印度种子与4-caranol丰富(18.81%),β甲基异丙基苯(14.22%),α-phellandrene (10.58%)β-chamigrene(9.54%),而法国NS丰富了草蒿脑(20.22%)和D-limonene (14.63%)。最低抑制(MIC)和杀菌浓度(MBC)获得了四个Eos(除了法国,因为低收益率)从3 - 40进行测试μl /毫升。革兰氏阳性(+)Eos略敏感的细菌比革兰氏阴性细菌(−)测试。这项研究的结果显示,Eos的NS种子展示有趣的抗菌活性可以关联到不同的生物活性化合物的存在。事实上,这些化合物可以用于预防或治疗目的的无控的出现对抗生素的耐药性。

1。介绍

多药耐药性抗生素已经成为一个严重的问题,这将会威胁到数以百万计的世界各地的人们。这种阻力导致增加研究药用植物等新的替代1]。对于这个事实,世界卫生组织(世卫组织)已开发了一系列的全球优先病原体耐多药细菌开发新的有效的抗生素治疗(2]。

精油(Eos)命名的植物挥发性化合物,以各种福利,如抗菌、抗真菌、抗病毒的特性。Eos是主要来源在不同领域如香料、化妆品和制药行业3]。

黑种草l(NS)(黑孜然)属于毛茛科一年生草本的家庭主要是民间医学中使用几个世纪以来[4]。植物广泛分布于北非、中东和印度。用于治疗各种疾病,如咳嗽、哮喘、发烧、湿疹和为了自己的利益作为lactogogue通经剂(5]。如今,不同生物研究正在建立NS;丰富的种子与挥发性化合物、皂苷、生物碱(6)提供一个大范围的影响在不同的疾病(7]。最近,这是证明NS石油和提取产生抗菌、免疫调节和抗癌活性(8]。

本研究的目的是研究化学变化的不同NSEos起源于印度、沙特阿拉伯、摩洛哥、叙利亚、和法国和评估潜在的一些最常见的病原细菌耐多药:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,铜绿假单胞菌,鲍曼不动杆菌从医院隔离。

2。材料和方法

2.1。材料
2.1.1。黑种草种子

的研究黑种草种子来自五个国家:沙特阿拉伯、印度、叙利亚、法国、摩洛哥。测定植物的学名是执行,验证,确认和分类学者/专业植物学家使用活标本和照片。对于植物物种鉴定的准确性,我们称为专业文档与摩洛哥植物有关。教师标本的标本是沉积在凭证号码(HUMPOM471)(9- - - - - -14]。

2.1.2。菌株

细菌用于抗菌活性的测定(S.aureus,大肠杆菌,P.aeruginosa,和A.baumannii)从病人和临床分离鉴定微生物实验室的大学医院中心穆罕默德六世Oujda(摩洛哥)。他们对抗生素的敏感性验证了根据欧洲委员会(EUCAST)药敏测试。所选的是最常见的代表参与pathogen-resistant菌株在人类感染。

2.1.3。抗菌药物敏感性试验

的在体外抗生素敏感性测试基于磁盘扩散法用于这项研究。分离菌株的敏感性是根据EUCAST访问。抗生素检测及其浓度头孢西丁30μg为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌imipenem 10μ克不动杆菌对碳青霉烯耐药,头孢他啶10μg为ceftazidime-resistant假单胞菌。对于extended-spectrum beta-lactamases (ESBL),阿莫西林克拉维酸30μ5 g,第三代头孢菌素头孢噻肟μg)。

2.1.4。化学物质

以下试剂和溶剂从Sigma-Aldrich购买化学品:己烷,二甲亚砜(DMSO)和rizasurine钠盐。

2.2。精油的提取

的NS样品被放置在阴暗的房间自然干,直到体重稳定大约为(6天)。完全干燥的样本转向hydrodistillation前的细粉。然后,100克的植物材料在300毫升的水受到hydrodistillation使用修改后的Clevenger-type装置直到精油水平稳定(2到3小时)。萃取后,用无水硫酸钠去除水痕迹,精油是存储在一个密封的玻璃容器在冰箱4°C到分析。

2.3。定性和半定量的分析黑种草精油

分析了使用气相色谱仪(日本岛津公司gc - 2010)配备了熔融石英毛细管柱(5%苯基甲基硅氧烷,30米×0.25毫米,0.25μ膜厚度)加上一个质谱检测器(GC-MS-QP2010)。氦作为载气被调整至100 KPa的恒压。烤箱温度设定最初在50°C(保持1分钟),后跟一个梯度10°C /分钟250°C(保持1分钟)。喷油器的燃油温度、传输线和离子源是设定在250°C, 250°C,分别和200°C。定性和semiqualitative分析(表1包含1),解决方案μL样品稀释的己烷(50毫克/ g)被注入在分裂模式(分流比= 50 - 80),和gc - ms系统是在扫描模式。质谱记录在70 eV(电子碰撞电离模式)的m / z范围40 - 350点。u(速度和溶剂延迟5 s /扫描和4.5分钟,分别)。识别的精油成分是完成基于女士的比较数据与存储在国家标准与技术研究所(NIST147)计算机图书馆。LabSolutions(2.5版)是用于数据收集和处理。表1给了Eos的每个组件的相对比例根据GC的峰值区域没有修正因素。所有实验进行了一式三份,数据被表示为均值±SD。

表1
化学成分确定的黑种草l .精油的五个国家。
2.4。抗菌活性的测定

的抗菌活性NSEos已经决定使用两种不同的技术如下所述。

2.4.1。琼脂扩散法

采用琼脂扩散法作为一个初步测试Eo抗菌活性的测定。所有菌株的浊度标准0.5麦克法兰促进它们之间的比较。之后,菌株接种的培养皿表面穆勒辛顿琼脂(尼古拉斯)使用消毒棉签。消毒绘画纸过滤器(直径6毫米)和20饱和μl (Eo溶解在2% DMSO溶液,然后,他们放置在培养皿表面之前接种微生物使用钳。24小时后的孵化37°C的所有菜肴,抗菌活性是评估通过测量的直径生长抑制区在毫米。抑制区域的测量进行了三次为每个Eo [15]。

2.4.2。确定最低抑制浓度(MIC)和杀菌(MBC)

在这项研究中,采用的方法使用一个96孔板。刃天青是利用作为细菌生长的指标测定的麦克风16]。刃天青nonfluorescent紫色/蓝色染料时减少到resorufin成了粉红色和荧光的可行的细胞氧化还原酶酶(17]。

精油溶解在2% DMSO,穆勒辛顿汤系列稀释了。搅拌后,180年μl(每个浓度添加到板井。这时,一个细菌细胞的悬浮(107CFU /毫升,20μl)被添加到每个。添加刃天青之后,所有的盘子都孵化24小时37°C。精油,没有丝毫的最小浓度被认为是麦克风的颜色变化。

随后,20μl是退出每个微型板块的,不显示任何颜色变化,表面的扩散尼古拉斯培养皿用消毒棉签,然后,在37°C的环境18到24小时。这道菜没有MBC亚文化被认为是。

所有测试在一式三份,包括抗生素MHB进行积极控制和精油溶解在DMSO溶液2%没有微生物作为一个消极的控制。

2.5。统计分析

分析与方差分析其次是图基测试执行事后多重比较阈值5%。油组件总数的比例高于5%石油受到分层聚类分析(HCA)和主成分分析(PCA)使用SPSS v22.0软件。HCA的情况下,系统树图(树)是使用病房的层次聚类方法和石油样品之间的平方欧氏距离。

3所示。结果与讨论

3.1。精油的提取和化学成分

五的精油(Eos)NS样品属于五个国家(印度、沙特阿拉伯、摩洛哥、叙利亚和法国)hydrodistillation方法获得的收益率从0.047%到1.7%不等。Eos的构成研究使用gc - MS技术,和他们的选民的身份完成基于女士的比较数据与存储在国家标准与技术研究所(NIST147)计算机图书馆。研究了油的化学成分和色谱表所示1和图1,分别。所有确定的化合物,单萜构成比例最高(55.81 - 96.68%)。数据显示,被发现的主要组件α-phellandrene,β蒎烯,β甲基异丙基苯,4-caranol分别NS收集来自印度、沙特阿拉伯、摩洛哥、叙利亚。法国石油成分被发生的特点,在明显的内容,草蒿脑和D-limonene。

(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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(e)
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图1
气相总离子色谱(TIC)黑种草五个国家的精油。
3.2。化学精油成分的变化

油组件总数的百分比高于或等于5%石油受到分层集群(HCA)和主成分分析(PCA)为了调查相似性和Eos组成之间的关系NS样本。

系统树图由HCA(图2),NS数量可以分为两个主要集群的距离25单位。样品通过更短的距离比这些更类似连接由一个更长的距离。在近距离(∼5单元),调查人群分为三组(Gr 1到3)。第一组(集群),由三个样本来自沙特阿拉伯、摩洛哥、叙利亚,是丰富的α-phellandrene(20.03 -30.54%)和相对温和的水平β甲基异丙基苯(12.31 -23.82%)和4-caranol (9.77 -14.27%)。第二组,包含示例的印度和其他人群的最远的集群,特点是比例最高的β-chamigrene (9.54%)。


图2
系统树图5黑种草人口产生的分层聚类分析。

第三组(集群II),法国的样品是最遥远的组比别人高,中等水平草蒿脑(20.22%)和D-limonene分别(14.63%)。

PCA分析显示,前两个主成分代表82%的植物化学的方差。图3显示了PCA的2 d图形表示。如图,第一主成分(PC1)占总方差的57%,积极与相关α-phellandrene,β蒎烯,β甲基异丙基苯,4-caranol主要的油NS收集从沙特阿拉伯、摩洛哥、叙利亚和印度。另一方面,PC1相关负面D-limonene和草蒿脑主导的油NS起源于法国。第二主成分,占一个额外的总方差的25%,呈正相关β-chamigrene。这些主成分分析数据导致的分类NS分成三个主要组代表是否如下:α-phellandrene /β甲基异丙基苯/ 4-caranol(沙特阿拉伯、摩洛哥、叙利亚),4-caranol /β甲基异丙基苯/α-phellandrene /β-chamigrene(印度)和草蒿脑/ D-limonene(法国)。这种分类确认HCA的结果。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
2 d图形表示化学成分油的主成分分析NS起源于五个国家。(a, b)的PCA分布变量和样本,分别。

最后,有趣的是伟大的Eos之间的相似性NS样品收集来自印度、沙特阿拉伯、摩洛哥、叙利亚尽管他们生长在不同的土壤和气候条件。如此相近的石油成分在植物可以解释相似的遗传因素。

3.3。抗菌活性的测定

敏感性试验表明,不同菌株对使用抗生素产生抗药性,并没有观察到抑制直径在琼脂板上。有关ESBL,穆勒辛顿琼脂的双圆盘协同方法使用。阿莫西林克拉维酸抑制生产的beta-lactamases创建一个协同效应与第三代头孢菌素强烈建议ESBL的生产。

NSEos是评估对四bacteria-resistant菌株的抗菌活性:金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,铜绿假单胞菌,和答:baumannii。数据与抗菌的潜力NSEos展示在表2。

表2
区(mm)的抑制手段黑种草精油(Eos)菌株进行测试。

测试中细菌、抗多种抗菌素的金黄色葡萄球菌所有Eos (MRSA)被认为是敏感测试(区抑制:14 - 15毫米)除了沙特阿拉伯Eo使适度敏感活动(10毫米)。正如同一个表中所描述的,答:baumannii(12.5到13.5毫米)铜绿假单胞菌(10.06到12.5毫米)被认为是中度敏感的Eos的起源。基于欧元区抑制(8到9.5毫米)大肠杆菌挥发性化合物被认为是稍微敏感的四个国家。抑制活性的比较根据原点不显著( > 0.05),而所有菌株之间的对比测试是非常重要的( < 0.001)。

中等收入国家测量使用96孔板,采用方法和获得的结果记录在表中3。

表3
麦克风和MBCμl /毫升黑种草精油对细菌进行测试。

所有结果反映的Eos不同起源提供了一个重要的抑制性活动在所有测试细菌。的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Eos是最敏感的菌株。四个起源的麦克风记录了从3到10μl /毫升有轻微区别与那些在MBC值。

关于答:baumannii和大肠杆菌,所有麦克风值等于MBCs(10到20μl /毫升)。至于铜绿假单胞菌,有一个印度的麦克风(10的区别μl /毫升)和中等收入国家的叙利亚、沙特阿拉伯和摩洛哥(20μl /毫升),但印度的MBCs值是相同的,摩洛哥,和沙特阿拉伯(30μl /毫升)与叙利亚的MBC Eo (40μl /毫升)。

4所示。讨论

关于化学剖面,获得的结果在我们的研究中表现出不同的化学资料与文献相比NSEos来自伊朗、突尼斯和阿尔及利亚(18- - - - - -20.],也证实了Eos的构成是高度受气候条件的影响和地理位置的差异所(21]。

众所周知,挥发性化合物被赋予一个伟大中断能源的生产能力在线粒体膜损伤质子泵;同时,这些化合物能够抑制结构大分子的合成和生长调节剂22,23]。

的抗菌活性NS挥发性化合物的研究国家(印度、沙特阿拉伯、摩洛哥、叙利亚)可以关联到不同的分子识别与gc - ms等α-phellandrene,β甲基异丙基苯,β蒎烯、百里酚。

结果表明,Eos起源于研究的四个国家中产生更强的抗菌活性比革兰氏阴性细菌革兰氏阳性,这可能是由于存在一个内在的抵抗Eos系统。人等。24]表明,细菌的反应主要取决于他们的形态(细菌壁),革兰氏阳性细菌的肽聚糖存在墙允许疏水性分子到达内部环境,而脂多糖存在的革兰氏阴性细菌可以通过小分子亲水不受阻力的影响,这是由于大量的孔蛋白的蛋白质(25]。

关于抗菌效果,据报道,突尼斯NSEos显示针对两个菌株的抗菌活性大肠杆菌(集成电路5062.0μg / ml)金黄色葡萄球菌(集成电路5012.0μg / ml);同时,他们认为这些影响可以归因于百里香醌和长叶烯(18]。

Eos显示在另一项研究中,一个重要的活动在不同的抗多种抗菌素的革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株,但没有观察到效果a . baumannii这是我们的结果,所有矛盾的Eos研究表明细菌的抑制与麦克风价值从10到20μl /毫升(26),而在delo和巴里的研究(27),Eo与低浓度有一个重要的活动除了各种压力大肠杆菌Eos没有活跃在所有测试浓度是不同于我们的发现在Eos活跃大肠杆菌麦克风(20μl /毫升)。辛格的Eos et al。(28研究表明影响大肠杆菌在我们的研究结果与伙伴。

Işcan et al。(29日研究表明α-phellandrene, Eos的主要化合物属于沙特阿拉伯、摩洛哥、叙利亚(20.03 - -30.54%),有弱抗菌活性等菌株金黄色葡萄球菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)大肠杆菌,铜绿假单胞菌在不同的浓度从1 > 4毫克/毫升。它也提到过α-phellandrene可能导致抗菌的效果30.]。的β蒎烯在不同国家的Eos研究比例从4.53和-9.77%α蒎烯在摩洛哥(6.29%)和叙利亚(4.07%)Eos显示一个重要的抑制活性金黄色葡萄球菌MIC值等于20μl /毫升(31日]。

萨阿德和穆勒的研究23)表明,麝香草酚羟基目前是负责抗菌活性。Mosolygo et al。32)表明,麝香草酚,单萜出现在印度的精油(4.64%)、沙特阿拉伯(8.39%),和摩洛哥(7%)、展品的抗菌活性金黄色葡萄球菌和大肠杆菌,获得的麦克风分别0.31和5毫克/毫升。也报道,麝香草酚会导致细胞膜的扩大导致被动扩散之间的离子扩散磷脂向外部区域(3,33]。

的β甲基异丙基苯、香荆芥酚前体的一个主要的化合物存在于所有样品测试一个百分比在23.82%和12.31之间,有一个重要的亲和力的脂质体膜使其扩展(34),还发现在蛋白质合成甲基异丙基苯没有显著的影响大肠杆菌观察到在运动性降低而显著的影响(35]。

5。结论

确定的化合物在这工作采用气相通过hydrodistillation紧随其后的研究化学变化和评估他们的抗菌效果。尽管的地理分布NS种子,一个伟大的相似性在石油成分和活动表现出耐多药细菌。革兰氏阳性微生物比革兰氏阴性细菌通常对Eos更敏感。因此,NSEos提供一个丰富的植物化学的化合物可用于治疗不同的传染病引起的微生物制剂。

数据可用性

所有数据用于支持我们的研究的发现是网上和通讯作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者在这部作品想表达他们的感谢先生BERRAH Aboulkacem先生为他的帮助提供英语和BEKKOUCH Oussama himani技术支持。