人参皂甙RB3减轻了通过TGF治疗对口腔癌症的顺铂对肾脏的毒性作用β- 介导的线粒体细胞凋亡

抽象的

客观的．研究旨在确认转化生长因子的作用 -β（TGF-β揭示了人参皂苷Rb3 (Rb3)在CPT治疗口腔癌过程中通过TGF-减轻CPT对肾毒性的作用机制β- 介导的线粒体细胞凋亡。方法．建立并用CPT和/或RB3建立并治疗含有口腔癌细胞ACC83的异种移植裸鼠裸鼠模型。称量处理的小鼠的体重，收集肾组织;以下，组织病理学和TGF的表达β采用H&E染色和免疫组化检测。随后，用CPT和/或Rb3处理GP-293肾细胞。TGF-的表达及磷酸化βWestern blotting检测GP-293细胞中Smad2、Smad3、Bcl-2、Bax的表达。流式细胞术检测细胞凋亡和线粒体膜电位。结果．卵黄移植物裸鼠暴露于CPT呈现体重损失，坏死区域，以及TGF在肾组织中的表达增加，RB3预处理缓解了CPT引起的这些变化。在GP-293细胞中，CPT施用诱导Smad2和Smad3的磷酸化，RB3预处理通过CPT抑制了诱导的磷酸化。此外，流式细胞术分析显示RB3抑制CPT诱发的细胞凋亡率和线粒体去极化。蛋白质印迹试验表明，RB3缓解了PARP，胱天蛋白酶3，胱天蛋白酶8和Caspase 9的切割，诱导Bax表达和Bcl-2表达的抑制。另外，在用多段的TGF抑制剂治疗后，RB3对CPT诱发的细胞凋亡率，抑制BAX表达和BCL-2在GP-293细胞中的诱导表现出没有缓解作用。结论．RB3可以通过TGF治疗对口腔癌的肾细胞缓解CPT引起的毒性作用β- 介导的线粒体细胞凋亡。

1.介绍

口腔腔和唇部发生的口腔癌是第六次最常见的癌症，占地球周围约30万个新病例[1]．缺乏对口腔癌的早期诊断策略推迟治疗并导致口腔癌的惨淡存活率和死亡率[2- - - - - -5]．据统计，2012年死亡145,000名口腔癌患者[1]．口腔癌导致人类的忧虑和健康负担[6，7]．虽然临床和理论中的口腔癌有丰富的治疗方法，但癌症治疗的有效策略仍然是一个挑战[8，9]．目前，化疗仍是包括口腔癌在内的各种癌症的常用治疗方法之一[10.]，顺铂(CPT)是一种重要的化疗药物，多年来广泛应用于口腔癌[11.，12.]．然而，CPT可以杀死身体中正常和癌细胞的几乎所有接触的细胞，这导致对正常组织如心脏，肾脏和肝脏的毒性[13.]．CPT对细胞缺乏选择性限制了CPT在口腔肿瘤治疗中的临床应用[14.]．令人兴奋的是，最近的研究表明，几种传统中药提取物及其成分可以抑制cpt引起的肝损伤、肾损伤和心肌损伤[15.，16.]．在这些活性中草药提取物和成分中，有报道称Rb3可以缓解cpt诱发的肿瘤模型中的肾脏损伤[17.]．然而，RB3对治疗口腔癌症治疗过程中CTB毒性的潜在效果和机制仍然模糊不清。因此，迫切需要阐明RB3在CPT治疗口服癌的过程中的肾脏保护作用，用于RB3的药物发育和口腔癌的临床治疗。

TGF-β途径被认为是信号级联反应转化生长的基本过程，以介导细胞增殖，细胞凋亡和分化[18.]．它在肿瘤进展，伤口愈合，免疫应答等中施加各种病理和生理功能[19.，20.]．最近，几个新兴的证据碎片表明TGF-β可以作为组织修复介质，通过线粒体细胞凋亡益处或加剧脑，肝脏和其他组织中的组织损伤[21.，22.]．Jin等报道TGF-β通过细胞凋亡导致LRG1诱导的缺血/再灌注损伤[23.]．Wang等的另一项研究也表明TGF-β参与miRNA-590-5P调节的软骨细胞凋亡，响应机械压力损伤[24.]．线粒体细胞凋亡对于维持体内稳定性的特别是必不可少的，这可以根据细胞凋亡因子的严重程序来清除不需要的和异常细胞。然而，这种疾病和缺乏使用的凋亡会导致正常的细胞死亡和组织损伤[25.]．在CPT治疗癌症的过程中，大量证据证实CPT诱导了正常肾、肝、肺等组织的细胞凋亡和组织损伤，最终导致了严重的毒性作用[26.]．该信息意味着在治疗口腔癌期间的CPT诱发的肾毒性可能与TGF相关β- 诱导的线粒体细胞凋亡。

在本研究中，我们旨在确认TGF的作用 -β在CPT治疗口腔癌过程中引起肾毒性，阐明Rb3通过TGF-减轻CPT肾毒性的潜在机制β- 介导的线粒体细胞凋亡。首先，构建轴承口腔癌细胞ACC83的异种移植裸鼠模型。CPT的肾脏毒性，RB3的保护作用和TGF-β评估肾组织中的表达。其次，使用人肾上皮GP-293细胞来确定RB3和CPT对TGF的影响β信号途径和线粒体细胞凋亡。最后，TGF的作用 -β研究了CPT在GP-293细胞中引起的RB3抑制线粒体细胞凋亡的信号途径。

2。材料和方法

2.1。化学品和试剂

从阿拉丁（中国）获得人参皂苷RB3和顺铂的标准。苏木精和曙红购自南京江城（中国）。TGF的一抗β，smad2，smad3，p-smad2，p-smad3，bcl-2，bax，切割的parp，切割的caspase 3，切割的caspase 8，切割的caspase 9，和β-Actin从Abcam（USA）提供。Annexin V-Fitc凋亡试剂盒购自BD（美国）。从Solarbio（中国）获得JC-1染料。从Biovision（USA）购买Caspase 3，Caspase 8和Caspase 9比色测定试剂盒。

2.2。建立异种移植裸鼠模型轴承口腔癌细胞ACC83

SPF男性和6周老年人的裸鼠购自厦门大学实验室动物中心（中国厦门）。所有小鼠根据基因型和性别，每笼5个，在22-26°C的大气中升高，在12小时的光暗循环，连续进入食物和水。在调整环境下五天后，将小鼠皮下植入预制口腔癌细胞ACC83（约5×10⁶ cells in 100 μ.每只小鼠的PBS）。一周后，当植入的Acc83细胞开始显示一点肿瘤，在皮下小鼠中呈现不同的尺寸，我们选择携带均匀尺寸的小鼠作为绿豆，随机分为四组（n= 6)。所选小鼠继续留置1周，并给予CPT和/或Rb3治疗，以评估毒性作用。

2.3。动物实验设计和治疗

轴承口腔肿瘤的裸鼠分为四组：对照，CPT，CPT +低RB3和CPT +高RB3组。对照组每天用盐水给予盐水，连续28天。每隔一天，CPT组每隔一天腹腔内注射10mg / kg顺铂28天。CPT +低RB3和CPT +高RB3组分别用10mg / kg和20mg / kg人参皂苷Rb3施用，每日一次，以及CPT组的相同顺铂注射液28天。每周测量一下小鼠的体重。在28岁的治疗结束时^TH.一天，所有小鼠都被安乐死，并立即将肾脏溶解并用4％多聚甲醛固定，用于组织病理学分析。

2.4。H＆E染色组织病理学

安乐死后，收集各组裸鼠的肾脏。用预冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤左肾，并储存在−80°C的超低温冰箱中进行接下来的Western blotting实验。右肾切成0.7 cm × 0.7 cm的方形，4%多聚甲醛4℃固定24小时以上。用石蜡包埋固定的肾方，切片3μ.M厚度，然后粘附到载玻片上。通过连续放置在二甲苯I的溶液中，将切片的薄肾样品脱蜡10分钟，二甲苯II持续10分钟，无水醇I持续5分钟，无水醇II持续5分钟，5分钟，5分钟，90％醇5分钟，80％醇5分钟，分别为70％醇5分钟，然后用蒸馏水洗涤。将脱蜡的载玻片用苏木精染色5分钟，曙红3分钟。最后，将染色的肾脏组织在95％醇，无水醇和二甲苯的溶液中脱水，并覆盖着中性树脂，用于使用荧光显微镜（Leica，德国）检测和成像。

2．5．免疫组化观察TGF-的表达β

将上述脱蜡切片放入氨基柠檬酸盐溶液中以进行抗原检索，然后在室温下在10％山羊血清中封闭1小时。封闭切片加入50 μ.l稀释的TGF的一抗溶液 -β（1：500稀释）并在37℃温育1小时，用PBS洗涤三次，然后再抗体另外1小时。用PBS洗涤三次后，将切片着色，50个 μ.L水的新鲜发色试剂的量，并用苏木精染色30秒。自来水洗涤切片20分钟以停止染色。最后，将染色的肾脏组织在95％醇I溶液中脱水3秒，95％醇II持续3秒，无水醇5分钟，二甲苯 - 醇（1：1）5分钟，二甲苯I为2几分钟，二甲苯II在曲调2分钟，覆盖中性树脂，用于使用荧光显微镜（Leica，德国）检测和成像。

2．6．细胞培养与处理

口腔癌ACC83细胞和正常肾上皮细胞GP-293在Dulbecco的改性鹰培养基（DMEM）中含有10％FBS的5％CO₂气氛在37°C。在10 cm细胞培养板中，当对数期ACC细胞数量达到12个时，用0.25%胰蛋白酶液消化，按200 PBS重悬于5ml EP管中μ.l每10厘米细胞培养板PBS;如下，将重悬的细胞皮下注射到100℃下裸鼠 μ.L对于一只小鼠构建口腔肿瘤小鼠模型。当对数相中的GP-293细胞约为85％汇合时，将它们接种成6个孔培养板，并根据需要用CPT和/或RB3处理。然后，通过以下实验收集并检测细胞。

2.7。流式细胞术检测FITC-Annexin V/PI双染色对细胞凋亡的影响

将CTP和/或RB3处理的GP-293细胞用0.25％胰蛋白酶消化成单细胞，并转移到1.5ml EP管中。用预压制PBS洗涤消化的细胞，并以1500rpm和4℃离心5分钟。将细胞的沉淀物重新悬浮300 μ.l 1×绑定缓冲液;以下，5 μ.加入annexin V-Fitc以在室温下孵育15分钟，然后，5 μ.L of pi被添加到污渍中。最后，染色的细胞被另外200 μ.L 1×结合缓冲液和流式细胞术（Bechman，USA）检测。

2.8。用于检测蛋白质表达的Western Blotting

收获CTP和/或RB3处理的GP-293细胞并用RIPA缓冲液裂解。使用BCA试剂盒检测细胞裂解物的总蛋白质浓度，然后在沸腾条件下用负载缓冲液进行变性。30. μ.将G的总变性蛋白质加载并进行蛋白质分离的十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。将分离的蛋白质转移至PVDF膜。在用吐温20（TBST）的Tris缓冲盐水中封闭5％脱脂牛奶1小时后，将PVDF膜与针对TGF的初级抗体一起温育β，smad2，smad3，p-smad2，p-smad3，bcl-2，bax，切割的parp，切割的caspase 3，切割的caspase 8，并在4℃下裂解胱天蛋白酶9，过夜和抗体β-Actin雇用作为内部参考。用TBST洗涤PVDF膜三次，并在室温下进一步温育2小时。最后，使用ECL试剂探测PVDF膜上的相应靶标。

2.9。流式细胞术JC-1染色线粒体电位

在GP-293细胞中处理CPT和/或RB3后，丢弃培养基，并使用PBS洗涤细胞，并加入新鲜的培养基（1mL）。然后将1ml JC-1将工作溶液加入细胞中以在37℃下孵育20分钟。温育后，用妊娠JC-1染色缓冲液洗涤细胞两次并用0.25％胰蛋白酶消化。消化的细胞用于流式细胞术分析。

2.10。统计分析

所有实验数据都被呈现为平均值±标准偏差（S.D.）。使用Inversion 19.0（SPSS，USA）的单向ANOVA进行比较组之间的统计差异。< 0.05为有统计学意义。星号( ）代表与对照组的比较，以及磅标志（^＃）是与CPT组进行比较。

结果

3．1．Rb3对cpt诱发裸鼠肾毒性的保护作用

体重和组织病理学是评价药物毒性的标准方法。在对照组中，携带口腔癌细胞ACC83的移植裸鼠的体重从0天到28天呈线性增加(图)1 (b))．注射CPT的小鼠在与对照组相比下方的体重中显示出水平线性，表明CPT导致小鼠体重丧失。预期，人参皂甙RB3（图中所示的结构1(一)）通过Gavage施用20mg / kg CPT + RB3组的剂量减轻了由CPT引起的体重损失，如接近对照组的体重曲线所确定的。此外，组织病理学分析（图1 (c)）表明，在CPT组的肾组织中发现了许多坏死地区，而不是对照组。同时，人参皂苷RB3预处理抑制了由CPT引起的肾组织的坏死。这些结果表明，人参皂苷RB3可以防止携带口腔肿瘤的异种移植裸鼠的CPT引起的肾毒性。

3.2。RB3对TGF的表达水平的影响β在异种移植裸鼠的肾组织中

TGF的水平β用免疫组化染色和蛋白质印迹检查表达。如免疫组织化学的代表性图像（图2（a）），对照组小鼠的肾组织呈现正常细胞形态和TGF-β表达式。CPT注射促进了细胞形态变形和TGF-的诱导β与对照组相比( < 0.01, Figure2（b）)．相反，Rb3给药20 mg/kg剂量可抑制cpt诱导的TGF-β表达和修复肾组织中的变形细胞形态，对照组中的水平与这些水平相似（图2（a）和2（b）)．此外，Western Blotting Assay揭示了TGF的类似变化趋势β用免疫组织化学染色获得的数据表达，即CPT诱导TGF-β表达和RB3抑制了TGF的诱导βCTP在患有口腔肿瘤的异种移植裸鼠肾组织中的表达。

3.3。RB3对TGF的影响βGP-293细胞中的信号途径

进一步评估RB3对TGF的影响β信号途径，我们在人肾上皮GP-293细胞中使用蛋白质印迹测定检测了Smad2和Smad3的表达和磷酸化水平。如图所示3.， TGF-表达水平β将暴露于CTP暴露于CTP的细胞与与数据小鼠一致的对照组相比（ < 0.001, Figure3（b）），同时CTP激活Smad2的磷酸化水平（ < 0.001, Figure3（c）)及Smad3 ( < 0.001, Figure3（e））但在Smad2和Smad3的表达中没有统计变化。在用不同浓度的RB3治疗后，TGF-β与CPT组相比，抑制了GP-293细胞中Smad2和Smad3的表达水平和磷酸化水平，其抑制水平浓缩。一起，体内/体外数据意味着CPT可以调解TGF-β表达及其途径和RB3对CPT介导的TGF具有抑制能力β信号路径。

3.4。RB3对GP-293细胞中CPT诱发细胞凋亡的影响

为证实细胞凋亡在rb3保护cpt诱发毒性中的作用，采用流式细胞仪FITC-Annexin V/PI双染色和Western blotting检测人肾上皮GP-293细胞凋亡。如流式细胞仪象限散点图所示(图4（a）），对照组中的细胞表现出仅2.88％±1.43％的凋亡率，而暴露于CPT的细胞的凋亡率升至18.10％±1.28％（图4（b））并证明CPT显着诱导GP-293细胞中的细胞凋亡。在不同浓度下补充RB3后，细胞的凋亡比随着RB3浓度的上升逐渐降低，较高剂量为2 μ.M和5. μ.M RB3与CPT组相比凋亡率统计学差异（^＃  < 0.05 in 2 μ.m rb3和^###  < 0.001 in 5 μ.M RB3，数字4（a）和4（b）)．此外，使用蛋白质印迹检测PARP（聚ADP-核糖聚合酶）的切割水平，凋亡的常规和经典指示剂，并与流式细胞术的结果呈现一致。将CPT组中PARP的切割水平与对照组进行诱导（ < 0.001), whereas Rb3 reversed the induction of the cleaved PARP level by CPT, and the higher dose is statistically significant differences (^###  < 0.001 in 2 μ.M和5. μ.与CPT组相比，M RB3，数字4（c）和4（d）)．这些凋亡结果表明:2μ.M RB3刚刚开始抑制CPT在人肾上皮GP-293细胞中诱导的凋亡。因此，我们选择2的浓度 μ.M RB3用于后续实验。

3.5。RB3对GP-293细胞中CPT诱发线粒体细胞凋亡的影响

为确定线粒体是否参与Rb3抑制CPT诱发的细胞凋亡，采用JC-1染色的流式细胞术检测GP-293细胞线粒体膜电位，Western blotting检测Bax和Bcl-2线粒体相关蛋白表达。流式细胞仪分析的直方图(图5（a）和5（b））显示CPT组细胞中的绿色/红色的荧光比几乎是4倍，在对照组中，并证明了CPT诱导的线粒体去极化，这是细胞凋亡的早期事件。完全，在2时管理RB3 μ.M显着修复了CPT诱导的线粒体去极化，其绿色/红色的荧光比类似于对照组。此外，Western印迹表明，CPT诱导了Bax的表达并抑制Bcl-2表达;同时，RB3减轻了GP-293细胞中Bax和Bcl-2的CPT介导的蛋白表达（图5（c）和5（d）)．综上所述，Rb3可能通过介导GP-293细胞线粒体去极化和Bcl-2和Bax蛋白的表达来抑制cpt诱导的细胞凋亡。

3.6。RB3对Caspase 3，Caspase 8和Caspase 9在GP-293细胞中的影响

Caspases在启动和执行细胞凋亡过程中起重要作用。采用ELISA法和Western blotting检测GP-293细胞中caspase 3、caspase 8、caspase 9的活性和剪切水平，结果如图所示6．数字6（a）显示暴露于CPT的细胞在Caspase 3中的活动显然增加（7.4折， < 0.001), caspase 8 (4.2 folds,< 0.001)， caspase 9(3.1倍， < 0.01) compared with those of cells in the control group, whereas Rb3 inhibited the activities of the three caspases induced by CPT in the varying degree. Besides, Western blotting showed that CPT induced the cleaved levels of caspases and Rb3 suppressed the induction (Figures6（b）和6（c）)．Caspase 3，Caspase 8和Caspase 9的切割水平的变化趋势与图中的胱天蛋白酶活性一致6（a）．

3.7。TGF的角色 -βRB3上的信号途径抑制CPT在GP-293细胞中引起内源性细胞凋亡

上述信息表明RB3可以介导TGF-β信号途径和内源性细胞凋亡。照亮是否是TGF-βRb3抑制CPT诱发的内源性凋亡信号通路是Rb3抑制CPT诱发的内源性凋亡必不可少的信号通路，我们进一步利用TGF-β人肾上皮GP-293细胞中途径抑制剂抑制剂。如图所示7（a）CPT组细胞凋亡率为24.3±4.1%，Rb3组细胞凋亡率为4.3±1.9%。而二itertide和Rb3预处理后，细胞凋亡率为18.0±3.1%，与CPT组相比无统计学意义的下降，这与Rb3仅能缓解CPT诱发的细胞凋亡率相反。Western blotting结果显示，与CPT组相比，Rb3抑制Bax表达，诱导Bcl-2表达，Rb3与二itertide联合用药剥夺了Rb3介导Bax和Bcl-2表达的权利。这些结果表明，TGF-β信号途径对于RB3抑制CPT引起的内源性细胞凋亡至关重要。

4。讨论

CPT常用于临床上的口腔癌治疗几十年;然而，包括肾脏的正常组织的毒性限制了其作为有效抗肿瘤剂的益处。虽然它在模糊的了解中，CPT如何诱发肾脏毒性，但一些证据表明NF-的途径κ..B，自噬，氧化应激和细胞凋亡与CPT与肾脏毒性有关。另外，TGF-β途径在肾纤维化，巨噬细胞浸润和细胞凋亡中发挥着至关重要的作用。但是，TGF的作用β在CPT引起的肾毒性很少报道。在本研究中，我们发现CPT可以诱导TGF的表达β在肾外移植裸鼠模型的肾组织中携带口腔肿瘤和人肾上皮细胞GP-293;此外，CPT也可以调解TGF-βSmad2和Smad3在GP-293细胞中的表达和磷酸化特征的信号通路。结果表明，TGF-β可能参与cpt诱发的肾脏毒性。

RB3是从人参分离的代表性三萜类皂苷，其可以在凋亡，氧化应激，炎症等中发挥各种生物活性。最近的研究表明，RB3可以作为缓解肾组织，心肌细胞和海马损伤的保护剂[27.，28.]．Xing等人的研究。揭示RB3通过AMPK和细胞凋亡介导的自噬途径保护CPT诱导的肾脏毒性[17.]．在另一个研究中，据报道RB3通过在体内和体外激活Perk / NRF2 / HMox1的抗氧化信号通路来施加心脏保护作用[29.]．在目前的研究中，我们说明了一种新的机制，即RB3可能通过TGF来保护CPT诱发的肾脏毒性β体内和体外信号途径。该机制证实RB3抑制了TGF的表达βCPT在肾外移植裸鼠模型的肾组织中诱导，患有口腔肿瘤和肾细胞GP-293和GP-293细胞中Smad2和Smad3的磷酸化。

细胞凋亡是一种生理上编程的细胞死亡过程，以摆脱不需要的和功能失调的细胞，以保持身体的稳态[30.]．线粒体作为细胞活动的调控中心，控制着呼吸链和氧化磷酸化，为几乎所有的细胞生理活动服务。在细胞凋亡过程中，响应凋亡刺激发生线粒体去极化，细胞色素C从线粒体释放，凋亡相关因子Bcl-2和Bax在线粒体中的表达变化;在激活后，caspase 3、caspase 8和caspase 9的一系列半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(caspase)最终诱导poly adp -核糖聚合酶(PARP)的裂解和细胞死亡[31.]．任何无序的线粒体细胞凋亡部分会导致功能性细胞死亡并引发正常的组织损伤[32.]．研究研究证实，CPT通过诱导Bax表达，抑制Bcl-2表达和活化胱天蛋白酶活性诱发肾细胞凋亡。TGF-β还据报道，通过线粒体参与细胞凋亡。我们的结果暗示TGF-β部分导致了cpt诱导的线粒体凋亡。此外，本研究揭示了TGF-βRb3对cpt诱发的细胞凋亡的保护作用是至关重要的，证实了Rb3在TGF-β肾细胞中二itertide的抑制剂。

5。结论

总之，TGF-β途径可能有助于CPT诱发的肾脏毒性，RB3可以通过TGF对肾脏毒性产生保护作用βCPT治疗口腔癌的途径介导的线粒体细胞凋亡。我们的发现提供了对RB3对CPT引起的肾毒性的保护作用的洞察力。对于RB3的发展以及临床中口腔癌的治疗非常重要。

数据可用性

生成或分析支持本研究结果的数据包括在文章中。

利益冲突

作者宣布没有利益冲突。

致谢

本工作得到了中国国家重点研发计划（2016年FFC1102800和2016YFC1102805）的支持。

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